طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة المورفولوجية مناسبة إيمونوديتيكشنز أو فحوصات بكر الخوادر

Summary

القدرة على الكشف عن دقة النصوص أو البروتينات في الأنسجة المورفولوجية أمر بالغ الأهمية لدراسة ما وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية. هنا هو وصف لإجراءات واضحة تشريح أجنحة الخوادر. يمكن استخدام هذه الأجنحة كعينات في العديد من التقنيات (إيمونوهيستوتشيميستري، وفحص PCR، إلخ).

Abstract

وضع الجناح في melanogaster المورفولوجية نموذجا مثاليا لدراسة morphogenesis على مستوى الأنسجة. تطوير هذه الملاحق من مجموعة من الخلايا المسماة الجناح أقراص imaginal شكلت أثناء التطور الجنيني. في مراحل اليرقات تنمو أقراص إيماجينال، زيادة في عدد الخلايا وتشكيل هياكل طلائي مونولاييريد. داخل القضية الخوادر، برعم بأقراص إيماجينال وإضعاف في بيلاييرس على طول خط يصبح الهامش مستقبلا من الجناح. أثناء هذه العملية، تنشأ العروق الطولية بريموديا الخلايا المنطلق على السطوح الظهرية والبطني المحتملين من الجناح. خلال مرحلة الخوادر المشارب الخلايا الوريد لكل سطح الاتصال من أجل إنشاء أنابيب ضيقة؛ في الوقت نفسه، تبدأ عبر الأوردة تكونها.

بمساعدة الواسمات الجزيئية الملائمة، من الممكن تحديد العناصر الرئيسية يؤلف الجناح أثناء تطورها. ولهذا السبب، القدرة على دقة الكشف عن وقائع أو البروتينات في هذا الهيكل حاسم بالنسبة للذين يدرسون وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية للجناح.

ووصف الإجراء هنا يركز على التلاعب بأجنحة الخوادر، توفير إرشادات مفصلة حول كيفية تشريح الجناح خلال مرحلة الخوادر. تشريح الأنسجة الخوادر أكثر صعوبة لأداء نظرائهن في يرقات الطور الثالث. وهذا السبب في وضع هذا النهج، للحصول على عينات سريع وكفاءة عالية الجودة. وترد تفاصيل عن كيفية إيمونوستين وجبل هذه العينات الجناح، للسماح للتصور من البروتينات أو مكونات الخلية، في البروتوكول. مع القليل من الخبرة من الممكن جمع 8-10 أجنحة الخوادر ذات جودة عالية في فترة قصيرة من الزمن.

Introduction

يتم تطوير أجنحة المورفولوجية من أقراص إيماجينال الجناح. البدائي لهذه الأقراص الجناح جانبا أثناء التطور الجنيني كمجموعات صغيرة من الخلايا إيماجينال 20-30 التي إينفاجيناتي من ظهارة الجنينية. بينما تنمو اليرقة إلى مرحلة الطور الثالث، يحدث الانقسام في الخلايا إيماجينال في أوقات محددة مميزة رفع عدد أعضائها (حوالي 50000 الخلايا) وتشكيل الجناح القرص^{1،2،3، 4}. كما تتكاثر الخلايا، أنها أزياء من ظهارة أنبوبي، أدى إلى تصاعد ضغط ذاتية قابلة لطي. أثناء بوباتيون، ظهارة القرص التلسكوبات خارجاً للجناح شكل الطبقات اثنين وعروق طولية تبدأ كثغرات بينهما، الذي يحدث مرتين خلال الجناح الإنمائية^5،6.

وقد ترتيب الأوردة دائماً نمط مماثل؛ القدرة على التعرف بسهولة على كل تغيير في تشكيل الأوردة يجعل الطفرات مرئية جداً (مثلاً مفقودة أو إضافية الأوردة، تغييرات في مواقف الوريد، إلخ.). من المثير للاهتمام، اختلافات النمط الظاهري هي عادة أدلة الطفرات في المكونات المعروفة أو الرواية من إشارات المسارات ذات الصلة لتطوير الجناح. واحد من المسارات التي تلعب دوراً في تحديد الموقف والحفاظ على السياق والأراضي إينتيرفين هو القنفذ (ح ح) المسار^6،،من⁷⁸.

ونظرا لأهمية الجناح الخوادر كنظام نموذجي، سيكون من المهم الحصول على عينات ذات نوعية جيدة للعمل مع. في الماضي، لم تول العلماء التي نشرت البروتوكولات تشريح أجنحة المورفولوجية دليلاً مناسباً لتحقيق نماذج قابلة للتطبيق. دون التوجيه من باحث واحد لا يمكن تصور وضوح العملية. في هذه النهج البديل تشريح تقسيم اثنين، الفصل بين الجناح من الأنسجة المحيطة عذراء وغسلها مرارا وتكرارا لإزالة الأنقاض. يلوث هذا النوع من النهج المطالبات بمغادرة الجناح مجاناً للكن العملية أبطأ بسبب التجربة السابقة وهناك فرصة أكبر للمساس بهيكل أجنحة هشة⁹.

وقد وضعته الإجراء الموضح هنا الطلب لإيجاد وسيلة سريعة وفعالة للحصول على عينات الجناح الخوادر مناسبة للكشف عن بروتينات محددة أو النصوص باستخدام بروتوكولات إيمونوديتيكتيون أو فحوصات بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR). ولتوضيح ذلك، التعبير والترجمة من مرقع (المؤسسة العامة للاتصالات أو مستقبلات المتعارف عليه المسار سمو) تكتشف في عينات الجناح الخوادر، توفير بروتوكول يتضمن التفاصيل ذات الصلة القيام بنجاح الكامل الإجراء.

Protocol

1 يوم

1-جمع واستزراع الخوادر.

1. إزالة ح 0 بعد تشكيل بوباريوم (APF) أو بريبوباي باستخدام الرسام رطب من قنينات مثقف ووضعها في قارورة جديدة لإكمال فترة التنمية تقريبا (انظر 2-1 و 2، 2).
   ملاحظة: ينبغي الإبقاء على صحة سكان من الذباب باستخدام البروتوكولات القياسية تثقيف. بعد ثلاثة أو أربعة أيام التي وضعت البيض، يمكن إزالة الكبار من قنينات للسماح تنمية مثلى للأفراد. أنها المحافظة على درجة حرارة ثابتة حتى تبدأ يرقات الطور الثالث بوبيشن. الانتقال اليرقات/الخوادر يتسم بتشكيل بريبوبا تعتبر ح 0 الإدارة العامة الاتحادية. بريبوبا هو يرقة بيضاء غير متحرك يحتوي مستطيل، مستديرة الشكل مع بروز spiracles الأمامي.

2 يوم

2-نقل والتشريح والتثبيت.

1. نقل الخوادر (2 ح قبل الوقت التنمية كاملة) مع الرسام، إلى الشريحة المجهر مع الشريط على الوجهين التقيد بذلك. ضع الخوادر على شكل صف مع الجانبين الظهرية الرأسي وحتى ينتهي تواجه نفس الاتجاه.
2. إرجاع الشريحة المجهر إلى درجة حرارة ثابتة والسماح الخوادر لإكمال الوقت الإنمائية المناسبة (أي 24-30 ح الاتحادية).
   ملاحظة: وستكون الشريحة المجهر مع الشريط على الوجهين منصة تشريح عابرة لإزالة حالة الخوادر (انظر أدناه). مرور الوقت على الشريحة المجهر (خارج القنينة) يساعد على الجاف للقضية الخوادر يجعلها قابلة للكسر بسهولة بالملقط.
3. إزالة operculum من حالة الخوادر باستخدام الملقط.
4. كسر الحالة مع الملقط (كما هو موضح في الفيديو) مما يجعل خط على طول الجانب من الخادرة إلى نهاية والذيلية. من الممكن مع الإضاءة المناسبة للكشف عن الشكل الداخلي لعذراء مما يجعل من الواضح مساحة فقط فوق المفصل الجناح الخوادر. هذه المساحة بمثابة دليل لإجراء فتح دون الأضرار عذراء.
5. قم بإزالة أجزاء من القضية، التقاط لهم بفتح الحدود وتقلهم إلى الجانب الآخر حيث تعقد لهم الشريط على الوجهين. في نهاية التشريح سيكون الخوادر تقريبا "عارية"، فقط قطعة صغيرة من القضية سوف تغطي الحافة الخلفية.
   ملاحظة: الغرض من ترك كمية صغيرة من القضية في نهاية والذيلية العلوي لضمان إصدار سلسة من القضية على الشريحة مع الشريط على الوجهين. الأسباب الكامنة وراء هذا الإجراء لأنه إذا قمت بإزالة كثيرا القضية إلى حد كبير خطر الأضرار عذراء. من ناحية أخرى إذا قمت بإزالة القليل جداً، الخادرة لن بسهولة تأتي خالية من القضية.
6. دفع إلى الأسفل (مع الملقط) ما تبقى القضية. سوف تثير هذه الحركة نهاية الأمامي من عذراء، السماح لكل من الرأس والصدر على البقاء في وضع تفضيلي إلى الالتزام وإلى نقلها في الخطوة اللاحقة.
7. تأخذ شريحة جديدة مع الشريط على الوجهين وعكس ذلك على عذراء أو صف الخوادر. نوصي بتنفيذ هذا النهج عن طريق مراقبة التحركات مع المعونة من ستيريوميكروسكوبي منع الكسر الخوادر.
8. اضغط قليلاً لجعل الخوادر العصا إلى الشريط وتنزلق الشريحة بلطف من أجل إزالة الخوادر من بقية الحالات. عكس الشريحة المجهر: سوف يكون عالقاً في الخوادر في الجهة الظهرية على مستوى رؤوسهم/منطقة الصدر.
9. تغطي جميع الخوادر عارية مع بارافورمالدهيد 4% وانتظر 10 دقائق. في تجربتنا، هذه الفترة الزمنية مع مثبت يساعد على تغيير اتساق بشرة يجعلها ثابتة وأقل لزجة وسهلة للتعامل.
   ملاحظة: القيام باستخراج الحمض النووي الريبي (الرنا)، بارافورمالدهيد بديل للفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع رناسي مجانية المياه وإزالة أجنحة الخوادر صنع قطع (مع معونة مقص) قرب النقطة المفصل لكل طرف من أطرافهم. باستخدام الملقط، نقل الجناح الخوادر لأنبوب ميكروسينتريفوجي مع 1 مل كاشف ثيوسيانات والفينول جوانيدينيوم. بعد تجميع مجموعة أجنحة 50-80، تخزين أنبوب ميكروسينتريفوجي في-80 درجة مئوية حتى أداء^10،استخراج الحمض النووي الريبي¹¹.
10. إجراء شق صغير في منطقة المفصل الجناح أو القريبة منها. تسمح مثبت للوصول إلى ظهارة الجناح. استخدام ماصة (p200) تدفق مثبت على الجناح. عند مسح استبدال يحملق الملوثة مع الجديد. بعد التنظيف، إبقاء الجناح في مثبت لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: على الرغم من أن هذه المناورة يساعد على مسح بعيداً غالبية الأنسجة تلويث، بعض هيموسيتيس وقطرات الدهون يمكن أن تبقى حبيسة بين طبقات طلائي الظهري والبطني الجناح (انظر الشكل 1A).
11. المسيل للدموع بالملقط من حدود بشرة (كما هو موضح في الفيديو) توسيع الثقب ويتيح الإفراج عن ظهارة الجناح من الكيس بشرة. حالما يتم تحرير الأنسجة الجناح، اتركه في حل بارافورمالدهيد لإكمال التثبيت و 30 دقيقة.
12. نقل أجنحة ثابتة لواحد الصحن البلاستيك 4-وليد مليئة ببست (Triton X-100 0.05%). مخزن بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

3 يوم

3-الابتدائي جسم الحضانة.

1. بيرميبيليزي الأنسجة تفرخ أجنحة الخوادر في ببست (Triton X-100 0.2 ٪) لمدة 15 دقيقة باستخدام منصة هزاز لتسهيل حركة متوسطة سائل لطيف.
   ملاحظة: حتى تركيب العينات، ينبغي إجراء الخطوات باستخدام منصة هزاز.
2. كتلة العينات باستخدام ببستا (جيش صرب البوسنة 3 ٪، X-100 تريتون 0.1 ٪) ح 1.
3. استخدم نفس المخزن المؤقت لتمييع جسم الأولية (الماوس المضادة-المؤسسة العامة للاتصالات، 1: 100)، واحتضان أجنحة الخوادر بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

4 يوم

4-الثانوية جسم الحضانة.

1. تغسل العينات 4 × 10 دقيقة كل مع ببست (Triton X-100 0.05%)
2. احتضان مع جسم الثانوية (مثلاً، الماوس المضادة مترافق ل fluorochrome) المخفف بتركيز مناسب في ببستا (جيش صرب البوسنة 3 ٪، X-100 تريتون 0.1 ٪) في درجة حرارة الغرفة في الظلام، وعن ح 2.
   ملاحظة: إذا كان من المناسب، استخدام 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) و/أو فالويدين كونتيرستين الأنسجة. إضافة هذه المسابر مع الأجسام المضادة الثانوية مع مراعاة الطول الموجي الانبعاثات من فلوروتشروميس لمنع تداخل الإشارات.
3. تغسل العينات 4 × 10 دقيقة كل مع ببست (Triton X-100 0.05%)

5-تركيب

1. إعداد شريحة عينة بوضع النقاط 4 من طلاء الأظافر الشفاف على الشريحة المجهر كما لو كانت القمم ساحة.

تكون النقاط حيث ستقع كوفيرسليبس، المساعدة على تفادي سحق الأنسجة.

مكان 30 ميليلتر من تركيب وسائط (الجلسرين/تريس-HCl 80 في المائة) في وسط ساحة النقاط المقدمة مع طلاء الأظافر دون لمس أي من الزوايا (النقاط). تأخذ ماصة مع تلميح اقتصاص أصفر وتحميل بعض وسائل الإعلام المتزايدة ورسم ثم في عدة أجنحة الخوادر.

نقل أجنحة الخوادر إلى النقطة من تركيب وسائط على شريحة المجهر. مع المعونة من تلميح، انتشار وسائل الإعلام المتزايدة وتغرق أجنحة الخوادر لمنعها من الطفو. وستبقى مورفولوجية النسيج إذا بقيت الأجنحة شقة عندما يتم وضع زجاج الغطاء على. قبل وضع زجاج الغطاء، قم بإزالة فقاعات الهواء.

أقل ساترة على العينات التي تحاول منع توليد فقاعات الهواء. يمكن أن يتم هذا التحرك بمساعدة الملقط.

النتائج

ويوفر البروتوكول وسيلة مباشرة للحصول على عينات الجناح الخوادر التي تحتفظ مورفولوجية مألوفة للجناح. من هذه الأعمال التحضيرية من الممكن الحصول على أكوام من الصور التي يمكن أن يكون المتوقع كثنائي الأبعاد أو ثلاثي الأبعاد، للتحقيق في توزيع و/أو في إثراء البروتينات خلال الت...

Discussion

يمكن استخدام طريقة التشريح الموصوفة في هذا الفيديو لتحضير عينات ذات جودة عالية من أجنحة المورفولوجية الخوادر من مراحل التنمية المختلفة لأنواع كثيرة من التقنيات (مثلاً، الفلورة، كدنا توليف لفحوصات بكر، في المختبر الجناح التنمية). فيما يتعلق بهذه الطريقة قد استخدمت العلماء...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope with cool light illumination	Nikon	SMZ1000
Rocking platform	Biometra (WT 16)	042-500
Microscope slides	StarFrost	8037/1
Cover glasses (24 x 32 mm)	Deltalab	D102432
Forceps	F.S.T	11252-00
Scissors	Lawton	63-1400
Multi-well plastic dish	Thermo Scientific	144444
p100 or p200 pipette	Finnpipette (Labsystems)	9400130
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
4% paraformaldehyde	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
Glycerol	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
TRIzol Reagent	Ambion	15596026
DEPC treated water	MO.BIO	17011-200
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800)	Invitrogen	A11030
Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)		By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.
DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000)	Invitrogen	62248
Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution)	Invitrogen	A12379
Canton S (fly stock)	Bloomington Drosophila Stock Center