تصحيح شريحة المشبك تقنية لتحليل اللدونة المستحثة بالتعلم

Summary

تقنية شريحة المشبك التصحيح طريقة فعالة لتحليل التغيرات المستحثة بالتعلم في الخصائص الجوهرية واللدونه من نهايات ضادات أو المثبطة.

Abstract

تقنية شريحة المشبك التصحيح أداة قوية للتحقيق اللدونة العصبية الناجمة عن التعلم في مناطق محددة من الدماغ. لتحليل التعلم موتور اللدونة المستحث، قمنا بتدريب الفئران استخدام مهمة رود دوار المعجل. الفئران أداء المهمة 10 مرات على فترات 30-s لأيام 1 أو 2. تم تحسين الأداء كثيرا في أيام التدريب مقارنة بالمحاكمة الأولى. ثم أعددنا شرائح الدماغ الحادة من القشرة الحركية الأولية (M1) في الفئران غير مدربين والمدربين. أظهر التحليل الحالي-المشبك التغيرات الدينامية في استراحة غشاء المحتملة، وعتبة سبايك، أفتيرهايبربولاريزيشن، ومقاومة الغشاء في طبقة الثاني/الثالث من الخلايا العصبية الهرمية. الحقن الحالية الناجمة عن العديد من المسامير أكثر في الفئران مدربين 2 يوم من الضوابط غير مدربين.

لتحليل التعلم حسب السياق اللدونة المستحث، وقمنا بتدريب الفئران باستخدام مهمة إبطال مثبطة (IA). بعد أن عانى من صدمة القدم في الجانب المظلم من مربع، تعلمت الفئران لتجنب ذلك، البقاء في الجانب المضاء. نحن على استعداد شرائح هيبوكامبال الحادة غير مدربين، تدريب IA، مزاوج، والفئران التي يمر عبرها. تحليل الجهد-المشبك استخدمت لتسجيل مصغرة عليه والمثبطة بوستسينابتيك التيارات (ميبسكس وميبسكس) من الخلايا العصبية CA1 نفس التسلسل. وجدنا مختلفة ستريك يعني ميبسك وميبسك في كل CA1 الخلايا العصبية، مما يوحي بأن كل الخلايا العصبية القوة بوستسينابتيك مختلفة في نهايات ضادات والمثبطة لها. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع عناصر التحكم غير مدربين، IA-بتدريب الفئران قد ستريك ميبسك وميبسك أعلى، مع التنوع الواسع. واقترحت هذه النتائج أن التعلم السياقية يخلق التنوع بوستسينابتيك في نهايات كل ضادات والمثبطة في كل CA1 الخلايا العصبية.

مستقبلات_A امبا أو GABA التوسط التيارات بوستسينابتيك، منذ حمام العلاج مع كنقكس على ما يبدو، أو حظر بيكوكوليني أحداث ميبسك أو ميبسك، على التوالي. يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة أنواع مختلفة من التعلم في مناطق أخرى، مثل القشرة الحسية واللوزة.

Introduction

وقد استخدمت تقنية المشبك التصحيح، التي وضعتها نيهر وزاكمان، على نطاق واسع للتجارب الكهربية¹. يمكن أن تستخدم تقنية المشبك تصحيح كامل الخلية² لتسجيل الحالية داخل الخلايا أو الجهد باستخدام ختم جيجاوهم لغشاء الخلية. تقنية المشبك الحالي يسمح لنا بتحليل الاختلافات في خصائص الغشاء مثل يستريح المحتملة والمقاومة والسعة³. تقنية الجهد-المشبك يسمح لنا بتحليل المستحثة بالتعلم اللدونة متشابك في نهايات ضادات والمثبطة على حد سواء.

القشرة الحركية الأولية (M1) هي منطقة مركزية أمر بالغ الأهمية لجعل الحركات الطوعية المهرة. وأظهرت دراسات الكهربية السابقة تنمية طويلة الأجل التقوية (الكمونية)-مثل اللدونة في طبقة سينابسيس الثاني/الثالث عليه بعد التدريب الحركي المهرة⁴. وعلاوة على ذلك، في فيفو التصوير دراسات أخرى أظهرت إعادة عرض العمود الفقري الجذعية M1 بعد مهمة التوصل إلى مهرة^5،6. ومع ذلك، لم يتم إظهار اللدونة متشابك والجوهرية الناجمة عن التعلم في الخلايا العصبية M1.

نحن ذكرت مؤخرا أن مهمة رود دوار شجعت التغيرات الدينامية في جلوتاماتيرجيك وجابايرجيك سينابسيس وغيرت اللدونة المتأصلة في M1 طبقة الثاني/الثالث من الخلايا العصبية⁷. هنا استخدمنا تقنية المشبك التصحيح شريحة للتحقيق اللدونة المستحثة بالتعلم. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية للتحقيق في أنواع أخرى من اللدونة تعتمد على التجربة في مناطق أخرى في الدماغ. على سبيل المثال، يمكن تعزيز مدخلات الحسية في قشرة البرميل امبا بوساطة مستقبلات مدخلاً عليه في طبقة الخلايا العصبية الثاني/الثالث⁸، ويعزز الخوف ملقن تكييف المدخلات ضادات على الخلايا العصبية اللوزة الأفقي، مما هو مطلوب ويخشى الذاكرة⁹. وعلاوة على ذلك، يقوم التعلم السياقية التنوع من حيث مدخلات متشابك ضادات والمثبطة للخلايا العصبية CA1 هيبوكامبال^10،11.

Protocol

جميع المساكن الحيوانية والعمليات الجراحية كانت وفقا للمبادئ التوجيهية "الحيوان التجريب من ياماغوتشي كلية الطب بجامعة" ووافقت عليها رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة ياماغوتشي جامعة-

1-الحيوانات

1. استخدام الفئران سبراغ داولي الذكور 4-5 أسبوع (28 إلى 31 يوما بعد الولادة من العمر)-
بيت
2. على الفئران في أقفاص بلاستيكية فردية (40 سم × 25 سم × 25 سم) الحفاظ على درجة حرارة ثابتة (23 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية) تحت دائرة الضوء/الظلام 12-ح. إعطاء الفئران إعلانية libitum الوصول إلى الماء والغذاء-

2. اختبار رود الدوار

1. للتحقيق في المهارات الحركية التعلم، و إخضاع كل الفئران لاختبار رود الدوار (قضيب القطر 7 سم؛ العرض لين 8.9 سم؛ الارتفاع سقوط 26.7 سم) لأيام متتالية 1 أو 2 ( الشكل 1A في كيداً et al., 2016 < سوب الطبقة = "xref" > 7). تنفيذ المهمة في غرفة هادئة، والتحكم في درجة الحرارة (23 ± 1 درجة مئوية). لا تخل أو التعامل مع الفئران قبل test.
2. تعيين رود الدوار لتسريع الوضع، مما يزيد خطيا من تناوب 4/دقيقة إلى 40 تناوب/دقيقة (8 π/دقيقة إلى 80 π/دقيقة) في الحد الأدنى 5
3. وضع الفئران على قضيب الدورية يستريح. التأكد من أن جميع أطرافه على القضيب.
4. قياس زمن الوصول السقوط من على قضيب الدورية لتقييم الأداء الحركي.
5. تسمح لكل فأر 10 محاولات (تجارب) مع فواصل 30-s-
6. إذا كان يقع الفئران من قضيب الدورية، تعيين على القضيب مرة أخرى بعد فاصل زمني s 10-20-
7. التضحية الفئران بجرعة زائدة من بينتوباربيتال (400 مغ/كغ) و 30 دقيقة بعد المحاكمة النهائية. حقن الفئران التحكم غير مدربين بنفس جرعة التخدير في اقفاصها المنزل-

3. اختبار الأبطال المثبطة

1. للتحقيق التعلم السياقية، موضوع الجرذان لاختبار إبطال مثبطة (IA) ( الشكل 1 في ميتسوشيما et al., 2011, 2013 ^{10 ، 11}) تجنب أي تجارب عرضية في يوم التجربة مثل الاتصال مع الآخرين، التغييرات قفص أو التنظيف. تنفيذ المهمة في غرفة هادئة، والتحكم في درجة الحرارة (23 ± 1 درجة مئوية)-
   ملاحظة: جهاز التدريب IA مربع اكريليك غرف اثنين (الطول 33 سم؛ العرض 58 سم؛ الارتفاع 33 سم). أنها جانب آمنة مضاءة وجانب مظلم صدمة مفصولة بفخ باب ( الشكل 1).
2. وضع الفئران في الجانب (مضاءة) آمنة في مربع مضيئة. التعامل مع الفئران بلطف دون الضغط.
3. الانتظار فترة زمنية قصيرة (10 إلى 20 s) إلى تأقلم الفئران للبيئة-
4. فتح الباب انزلاق للسماح للفئران لإدخال مربع الظلام في الإرادة.
5. قياس زمن الوصول (s) قبل دخول الفئران رواية الجانب المظلم من المربع. زمن الوصول للمحاكمة الأولى يمثل الفئران ' s الأداء قبل التدريب-
6. بعد الدخول إلى الجانب المظلم، أغلق الباب وتطبيق صدمة قدم كهربائية مجمعة (2 ق، 1.6 mA) عبر قضبان الصلب الكهربائية إلى الكلمة المربع. السماح للفئران التي يمر عبرها لاستكشاف جهاز التدريب لمدة 1 دقيقة دون أن الصدمة. بيت الفئران مزاوج في قفص صدمة مضاءة لعدة أيام وفجأة إعطاء الصدمة دون تجارب عرضية. التعامل برفق دون الإجهاد في أي المجموعات.
7. تبقى كل الفئران في مربع الظلام لمدة 10 ق قبل إعادته إلى القفص المنزل.
8. في 30 دقيقة بعد الصدمة سيرا على الأقدام، مرة أخرى وضع الفئران في الجانب المضاء من المربع. قياس زمن الوصول إدخال الجانب المظلم.
9. تعود الفئران إلى القفص المنزل-
10. في 60 دقيقة بعد الصدمة، التضحية الفئران بجرعة زائدة من بينتوباربيتال (400 مغ/كغ). التعامل مع الفئران بلطف وحقن التخدير إينترابيريتونيلي. في الجرذان التحكم غير مدربين، وحقن التخدير في اقفاصها المنزل دون التجربة المذكورة أعلاه-

4. المخزن المؤقت لتشريح

1. تذوب بلورات 0.195 ز نة ₂ بو ₄-2 ح ₂ س، ز 0.188 بوكل، 0.074 غ كاكل ₂، ز 1.423 مجكل ₂-6 ح ₂ س، وكلوريد الكولين ز 12.579 في الماء عالي النقاوة (مل 900 إلى 950 مل) . انظر الجدول 1-
2. تذوب بلورات حامض الأسكوربيك ز 2.340 وملح الصوديوم حمض بيروفك 0.342 ز، ز 2.100 ناكو ₃ والجلوكوز 4.500 ز.
3. إضافة الماء يصل إلى 1000 مل. مجموعة أوسمولاليتي سيكون بين موسم 290/لتر، وموسم/l. 300 ضبط osmolality بإضافة الماء عالي النقاوة، إذا كان على المدى.
4. فقاعة الحل مع 5% CO ₂/95% O ₂ الغاز المخلوط في درجات حرارة المثلج لمدة 5 دقائق قبل الاستخدام.

5. السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام)

1. تذوب بلورات 0.186 غرام بوكل، 6.700 ز كلوريد الصوديوم، و 0.156 ز نة ₂ بو ₄-2 ح ₂ س في الماء عالي النقاوة (مل 900 إلى 950 مل). انظر الجدول 2-
2. فقاعة مع خليط الغاز للحد الأدنى 5
3. تذوب بلورات ز 1.800 الجلوكوز وز 2.184 ناكو ₃ ثم قم بإضافة 4 مل مجكل ₂ و 4 مل كاكل ₂ من م 1 الأسهم الحلول.
4. إضافة الماء يصل إلى 1000 مل. مجموعة أوسمولاليتي سوف تكون بين موسم/لتر 290 و 295 osmolality ضبط موسم/ل. بإضافة الماء عالي النقاوة، إذا كان على المدى.
5. فقاعة مع الغاز المخلوط قبل استخدام.

6. حلول داخل الخلايا

1. للتسجيلات الحالية-المشبك (الجدول 3)، حل ز 0.0746 بوكل، 6.089 ز كغلوكونات ز 0.476 هيبيس، 0.0456 ز اجتا و مجكل ميليلتر 500 ₂ من م 1 الأسهم الحل في 180 مل ماء عالي النقاوة (ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.2 مع كوه).
   إضافة
   1. ز 0.4408 نا ₂-ATP، 0.0418 ز غ ₃-أنشئ، و 0.510 ز نا-فوسفوكريتيني. إضافة الماء إلى 200 مل وضبط درجة الحموضة إلى 7.35 مع كوه.
   2. ضبط أوسمولاليتي لموسم حوالي 290/لتر بإضافة الماء عالي النقاوة.
   3. المخزن كمختبرين 1 مل في الثلاجة (-30 درجة مئوية).
2. لتسجيلات المشبك الجهد (الجدول 4)، حل 5.244 غ كسميسو ₃، غ 0.672 CsCl، 0.476 ز هيبيس وز 0.0456 اجتا مجكل ميليلتر 500 ₂ من م 1 الأسهم الحلول في 180 مل ماء عالي النقاوة. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع CsOH. للتسجيلات، ميبسب وميبسب واستخدام تركيز معدلة 5.814 ز كسميسو ₃ وز 0.252 CsCl لضبط إمكانية عكس استجابة مستقبلات GABA _A ¹¹.
   إضافة
   1. ز 0.4408 نا ₂-ATP، 0.0418 ز غ ₃-أنشئ، و 0.510 ز نا-فوسفوكريتيني. إضافة الماء إلى 200 مل وضبط درجة الحموضة إلى 7.35 مع CsOH.
   2. ضبط أوسمولاليتي لموسم حوالي 290/لتر بإضافة الماء عالي النقاوة.
   3. المخزن كمختبرين 1 مل في الثلاجة (-30 درجة مئوية).

7. شريحة إعداد

1. مسبق للتضحية، وتهدئة جميع أدوات تشريح مع الثلج المجروش ( الشكل 2A). إضافة حوالي 500 مل ماء البارد في وعاء الثلج المجروش لزيادة مساحة السطح الاتصال. ووصفت هذا الإجراء قبل ^{10 ، ،} من ^{11 12}-
   ملاحظة: أدوات هنا: مقص كبير، مقص آيريس، ملعقة، ملعقة صغيرة، الملقط، ملاقط، كوب 200 مل فولاذ المقاوم للصدأ، وشفرة للدماغ التشذيب، 120 مل القلب نضح حقنه مليئة بتشريح المخزن المؤقت تعامل مع خليط الغاز، أنبوب سيليكون (20 سم) متصل بإبرة عيار 18 مسطح، مرحلة تشريح الدماغ غير القابل للصدأ (سمك = 3 مم، ϕ = 12 سم)، ومرحلة تصاعد فيبرتوم (ϕ = 5 سم)-
2. التضحية الفئران 30 دقيقة بعد إكمال نموذج السلوكية التي أنيسثيتيزينج ذلك مع جرعة زائدة من بينتوباربيتال (400 مغ/كغ وزن الجسم). القيام بإعداد شريحة سريعاً للتأكد من أن الشرائح بصحة جيدة كما يمكن ^{10 ، ،} من ^{11 12}. إكستر الدماغبروتوكول عمل يفي بجميع المعايير البيطرية لجامعتنا.
3. تعبئة bubbled حقنه 120 مل مع المخزن المؤقت لتشريح المثلج (الجدول 1) مع شركة 5% ₂/95% O ₂ الغاز المخلوط. إزالة أي فقاعات الهواء قبل التروية.
4. بعد تعريض القلب، أدخل الإبرة في الجزء الخلفي من البطين الأيسر-
5. إجراء ترانسكارديال التروية للدماغ يدوياً باستخدام المحاقن. الفئران أكبر تتطلب أكثر من المخزن المؤقت تشريح التروية. تغرق في الدماغ مع المخزن المؤقت لتشريح المثلج لأدنى 5 فقاعة المخزن المؤقت بشكل مستمر خلال غمر.
تقليم
6. على الجانب الخلفي من الدماغ في موازاة زاوية اتجاه المنطقة القشرية المستهدفة باستخدام شفرة الجذعية. منذ الدماغ هو الوقوف على مرحلة تشريح مع أسفل نهاية قص، الزاوية الأولى يحدد زاوية جميع شرائح المخ اللاحقة. هذه الخطوة من الأهمية بمكان ( الشكل 2). قد قطع بزاوية غير صحيحة من خلال الخلايا العصبية الهرمية الهدف.
   ملاحظة: الأدوات هنا: شفرة للتشذيب الدماغ، ورقة تصفية (ϕ = 10 سم)، مرحلة تشريح الدماغ غير القابل للصدأ (سمك = 3 مم، ϕ = 12 سم)، ملعقة، superglue، قطارة، ومرحلة تصاعد فيبرتوم (ϕ = 5 سم)-
7. قص 350-ميكرومتر سميكة الدماغ الاكليلية شرائح استخدام فيبرتوم. ملء قاعة التشريح مع المخزن المؤقت المثلج bubbled مع شركة 5% ₂/95% O ₂ الغاز المخلوط ( الشكل 2). فقاعة المخزن المؤقت بشكل مستمر خلال شريحة الدماغ.
8. تقليم محيط المنطقة المستهدفة باستخدام مقص آيريس.
9. يغسل الشرائح المشذبة برفق في درجة حرارة الغرفة قام bubbled مع 5% CO ₂/95% (الجدول 2) س ₂-
10. قلصت المحافظة على الشرائح في دائرة لواجهة حتى يتم التسجيل إجراء ( الشكل 2D و E). حضانة ح 1 في قاعة يحسن الحالة للخلايا، ولكن تعمل تغيير حالة الشرائح هي المحتضنة لأكثر من 10 ساعات. أغلق غطاء الدائرة أن أرفق الغازات وقطرات السائل الصغيرة من قام-

8. تصحيح كامل الخلية المشبك

ملاحظة: تسجيلات كامل الخلية تحتاج إلى مكبر للصوت والمنخفضة تمرير مرشح تم تعيينه إلى تردد استقطاع 5 كيلوهرتز. الإشارات الرقمية والمخزنة في جهاز كمبيوتر. ويتم تحليل البيانات المخزنة دون اتصال ( الشكل 3A).

1. إنشاء أقطاب الزجاج ساحبة أفقية باستخدام. ملء الأقطاب مع حل مناسب (الجداول 3 و 4) استخدام المحاقن 1 مل البولي إثيلين عادية الملحقة بأنبوب زجاج غرامة وعامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
2. قبل الاتصال مع الخلية، المحافظة على الضغط الإيجابي وضبط ماصة الحالية إلى الصفر.
3. بعد تشكيل ختم جيجاوهم، تطبيق الضغط السلبي تمزق غشاء الخلية (التكوين كامل الخلية في الشكل 3F)-

9. التحليل الحالي-المشبك

ملء خصائص

1. لغشاء الخلية
   1. التصحيح تسجيل الماصات مع الحل داخل الخلايا لتسجيلات المشبك الحالية (الجدول 3). مقاومة الماصة بين 4 MΩ و 7 MΩ في قام-
   2. بعد تصدعات الغشاء، تعقد الجهد غشاء-60 أم في وضع المشبك الخامس. ثم، قم بالتبديل من " حمام " الوضع إلى " خلية " الوضع في غشاء الاختبار باستخدام البرمجيات لقياس خصائص الخلية الجوهرية مثل السعة الغشاء، والمقاومة، ووقت ثابت.
2. الدراسة الحالية حقن
   1. بعد تسجيل خصائص الخلية الجوهرية، تبديل الوضع من الخامس-المشبك إلى المسار (أنا = 0)/I-CLAMP عادي للحقن الحالية. لاحظ أن إمكانية تقاطع السائل لا ينبغي تصحيحها ¹⁰-
   2. الحالي في الخلية للسيدة 300 إدخال تغيير كثافة الحالية التدرجي من − السلطة الفلسطينية 100 إلى السلطة الفلسطينية +550 مع زيادات 50-السلطة الفلسطينية. حساب العدد المسامير (إمكانات العمل) بالحقن الحالية-
   3. قياس الجهد الحد الأدنى اللازم للحث على إمكانية العمل (وهذا هو الجهد العتبة).
   4. حساب السعة أفتيرهايبربولاريزيشن كالفرق بين الجهد في بدء سبايك والجهد أقل بلغت خلال أفتيرهايبربولاريزيشن ⁷-

10. تحليل الجهد-المشبك

1. امبا/نمدا نسبة
   ملاحظة: نسبة امبا/نمدا طريقة تقليدية لتقييم اللدونة بوستسينابتيك في نهايات ضادات جلوتاماتيرجيك ^{7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11}-ومع ذلك، ملاحظة أن ما يصاحب ذلك زيادات في كل من مكونات قد لا يتغير نسبة ¹³.
   1. بيرفوسي قاعة تسجيل مع الحل الفسيولوجية bubbled مع خليط الغاز والحفاظ على درجة حرارة 22 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية. إضافة 0.1 مم بيكروتوكسين للحل كتلة GABA _A-بوساطة استجابة وإضافة 4 ميكرومتر 2- تشلوروادينوسيني لتثبيت مقولة الاستجابة العصبية ¹⁴-
   2. ملء التصحيح تسجيل الماصات مع الحل داخل الخلايا للجهد-المشبك التسجيلات (الجدول 4). فحص مقاومة ماصة التسجيل في قام. المقاومة ما بين 4 MΩ و 7 MΩ.
   3. لتسجيل في طبقة الثاني/الثالث الخلايا العصبية الهرمية في M1، وضع تنغستن قطبين حفز ميكرومتر القطب 200 إلى 300 ميكرون الجانبي للخلايا التي سيتم تسجيلها، تحت السطح بيل في المنطقة لتمثيل فوريليمب (الجانبي 2 مم خط الوسط) ^{15 ، ،} من ^{16 17}-
   4. للتسجيل في خلية CA1 الهرمية، ضع ميكرومتر القطب 200 حفز إلى 300 ميكرون الجانبي (شافر الألياف الجانبية) أو الآنسي (الطريق تيمبوروامونيك) إلى الخلايا التي سيتم تسجيلها ( الشكل 3B).
   5. زيادة كثافة التحفيز حتى رد متشابك > 10 بنسلفانيا
   6. حساب نسبة امبا/نمدا كما تقاس نسبة الذروة الحالية في − 60 أم الحالية إذا قيست عند 40 أم 150 مللي ثانية بعد بداية التحفيز. ملاحظة أن آثار 50 إلى 100 يجب أن يكون متوسط لحساب النسبة.
2. بوستسينابتيك التسجيلات الحالية مصغرة
   ملاحظة: مصغرة التيارات بوستسينابتيك ضادات (ميبسكس) ويعتقد أن تتوافق مع الردود التي أثارت بالإفراج عن بريسينابتيك حويصلة واحدة من غلوتامات ¹⁸ . في المقابل، يعتقد مصغرة التيارات بوستسينابتيك المثبطة (ميبسكس) لتتوافق مع الردود التي أثارت بالإفراج عن بريسينابتيك حويصلة واحدة من GABA ¹⁸. الزيادات في الاتساع من ميبسكس وميبسكس ويعكس تعزيز انتقال بوستسينابتيك، مع زيادات في حال التردد وتعكس الزيادات في عدد الاشتباكات العصبية الوظيفية أو احتمال الإفراج عن بريسينابتيك ¹¹ .
   1. تعبئة ماصة تسجيل التصحيح مع الحل داخل الخلايا المحورة (الجدول 4) لضبط إمكانية عكس التيار بوساطة مستقبلات GABA _A إلى-60 أم.
   2. إضافة 0.5 ميكرومتر تيدرودوتاكسين إلى حمام لعرقلة إمكانات العمل العفوي.
   MV
   3. عقد الجهد في-60 للبحث والتطويرأكورد الأحداث ميبسك للحد الأدنى 5
   4. تغيير عقد المحتملة إلى 0 mV ميبسك سجل الأحداث لمدة 5 دقائق. لأن الخلايا العصبية M1 إظهار عكس أعلى قليلاً المحتملة للتيارات بوساطة مستقبلات امبا، ميبسكس من الخلايا العصبية M1 وتسجل في + 15 mV مع 0.1 مم APV-
   5. الانتظار لبضع دقائق للحالية لتحقيق الاستقرار.
   6. تسجيل الأحداث ميبسك للحد الأدنى 5
   7. الكشف عن أحداث مصغرة باستخدام البرمجيات، واستخدام الأحداث أعلاه السلطة الفلسطينية 10 للتحليل. حساب عدد الأحداث ميبسكس أو ميبسكس لمدة 5 دقائق لتحديد التواتر. متوسط الاتساع الأحداث للحصول على السعة يعني.
   8. تأكيد ما إذا كان العلاج حمام مع 10 ميكرون كنقكس أو مع 10 ميكرون بيكوكوليني ميثيوديدي كتل الأحداث ميبسكس وميبسكس، على التوالي.
3. تحليل الزوجي--نبض
   ملاحظة: اللدونة Presynaptic يمكن تحليلها باستخدام تحليل نبض إقران. زيادة في معدل النبض إقران تشير إلى انخفاض في الغلوتامات presynaptic أو GABA الإفراج عن احتمال ^{7 ، ،} من ^{10 11}.
   1. لتحليل ضادات نقاط الاشتباك العصبي وإضافة بيكروتوكسين 0.1 ملم وتسجيل الاستجابة على-60 أم. على الرغم من أن أضفنا 4 ميكرومتر 2-تشلوروادينوسيني إلى الحمام، نحن بحاجة إلى أن نضع في اعتبارنا أن المخدرات تؤثر على احتمال الإفراج عن بريسينابتيك ¹⁴-
   2. لتحليل الاشتباكات العصبية المثبطة، إضافة 0.1 مم APV و 4 ميكرومتر 2-تشلوروادينوسيني إلى الحمام وتسجيل الاستجابة على 0 أم. في الخلايا العصبية M1، تسجيل الاستجابة على + 15 mV.
   3. تطبيق نبضات المقترنة مع فاصل زمني بين تحفيز 100 ms أو 200 السيدة
   4. تسجيل 50-100 آثار متتابعة في كل عقد محتمل ومتوسط القيم.
   5. حساب نسبة نبض المزدوجة كالنسبة الذروة الثانية إلى أول ذروة الحالي بوستسينابتيك.

النتائج

كما وصفت لنا مؤخرا⁷، دوار رود التدريب (الشكل 1A) الناجم عن التغيرات الدينامية في اللدونة الجوهرية من M1 طبقة الثاني/الثالث الهرمية الخلايا العصبية. قياس زمن الوصول حتى تسقط الفئران من قضيب الدورية يسمح لنا بتقدير أداء مهارات التعلم من الفئران. زمن أطول يشير إلى تحسين أداء المحرك. في اليوم الأول من التدريب، الفئران تحسن أدائها رود الدوار حتى انتهاء المحاكمة. في يوم 2، الفئران حققت مستويات مقارب تقريبا في الدورة متوسط عشرات (الشكل 1B). بالمقارنة مع الكمون في المحاكمة الأولى، أظهر تحليل الوظائف المخصصة تحسينات كبيرة في محاكمات النهائي في أيام التدريب (الشكل 1).

يبين الشكل 4A مثالاً للتحليل الحالي-المشبك فيه تغيير خصائص الخلايا العصبية بعد تعلم المهارات الحركية. حقن للسلطة الفلسطينية 400 و 500 السلطة الفلسطينية التيارات ضرورية للحث على إمكانات العمل في المجموعة غير مدربين وفي الفئران المدربة اليوم 1، على التوالي. في المقابل، كان حقن فقط السلطة الفلسطينية 150 الحالية كافية للحصول على إمكانات العمل في الفئران المدربة 2 يوم. ويبين الشكل 4Bالعلاقة بين كثافة الحالية والعدد من إمكانات العمل. 50 أقل قدر من السلطة الفلسطينية الحالية كانت كافية للحصول على طفرات في الفئران المدربة 2 أيام؛ على النقيض من ذلك، رد الجرذان المدربة 1-يوم مع إمكانات العمل أقل من الفئران غير مدربين على 350 من السلطة الفلسطينية والتيارات أعلى. وعلاوة على ذلك، يبين الشكل 4 أن الفئران المدربة 1 أيام أظهرت يستريح أقل المحتملة، وأعلى ارتفاع العتبة، وأعمق أفتيرهايبربولاريزيشن، بينما 2 يوم تدريب الفئران أظهرت أعلى إمكانات يستريح (الشكل 4) و (مقاومة الغشاء الشكل 4).

كما وصفناها سابقا¹¹، IA التدريب (الشكل 1) التي يسببها اللدونة بوستسينابتيك في نهايات ضادات والمثبطة للخلايا العصبية CA1 هيبوكامبال. عن طريق قياس زمن الوصول في ضوء مربع، يمكن أن نقدر أداء التعلم السياقية للفئران. ويبين الشكل 1E نتائج المهمة IA. بعد الصدمة الكهربائية المزدوجة، تعلم الفئران لتجنب الجانب المظلم من المربع والبقاء في الجانب المضاء الذي لا يفضل عادة. ولذلك يشير الميل إلى تجنب الجانب المظلم إلى اقتناء ذكريات السياقية.

يبين الشكل 5 مثال على تحليل الجهد-المشبك في أي مصغرة التيارات بوستسينابتيك كانت تغيرا بعد التعلم السياقية. التحقيق اللدونة المستحثة بالتعلم وعفوية ميبسكس امبا بوساطة وغابا_A-ميبسكس وساطة تسلسلياً سجلت حضور 0.5 ميكرومتر تيدرودوتاكسين (الشكل 5 أ و ب). كما هو موضح في مؤامرات ثنائي الأبعاد (الشكل 5)، كان كل العصبية CA1 ستريك يعني مختلفة ميبسكس وميبسكس. على الرغم من الاتساع منخفضة وأظهرت مجموعة توزيع ضيق غير مدربين، مزاوج، والفئران التي يمر عبرها، تلك كانت متباينة في الفئران التي دربت IA (الجدول 5). ANOVA متبوعاً بتحليل الوظائف المخصصة أظهر زيادة كبيرة في الاتساع يعني من ميبسك وميبسك في الفئران التي دربت IA (الشكل 5E)، مما يوحي اللدونة بوستسينابتيك المستحثة بالتعلم في CA1 الخلايا العصبية.

وعلاوة على ذلك، أظهرت كل العصبية CA1 ترددات مختلفة ميبسك وميبسك (الشكل 5). على الرغم من الترددات المنخفضة وأظهرت مجموعة توزيع ضيقة غير مدربين، مزاوج، والفئران التي يمر عبرها، تلك كانت متباينة في الفئران التي دربت IA (الجدول 6). ANOVA متبوعاً بتحليل الوظائف المخصصة أظهر زيادة كبيرة في تواتر الأحداث ميبسك وميبسك في الفئران التي دربت IA (5F الشكل). وهناك تفسيران المحتملة لهذه النتائج. الأول أن التعلم السياقية بزيادة عدد الاشتباكات العصبية الوظيفية للخلايا العصبية. والآخر أن التعلم السياقية زاد احتمال الإفراج عن presynaptic الغلوتامات وغابا.

لمواصلة دراسة اللدونة presynaptic، أجرينا أيضا إقران نبض التحفيز، وكما ذكرت سابقا^10،11.

الشكل 1 : تعلم الأداء بعد التدريب-
A: يظهر التصميم التجريبي تدريب رود الدوار وشريحة الدماغ الاكليلية. ب: الكمون يعني السقوط من فوهة قضيب الدوار المتسارع. ج: الكمون يعني أن تقع قبالة القضيب على الأولى والتجارب النهائية على تدريب أيام 1 و 2⁷. ف< 0.01 مقابل المحاكمة الأولى. د: مخطط الشريحة الدماغ المهمة وكرونال الأبطال المثبطة (IA). ﻫ: الكمون يعني الدخول في مربع الظلام قبل وبعد التدريب IA¹¹. ف< 0.01 مقابل قبل التدريب IA. عدد أقسام الاكليلية تشير إلى المسافة التي عرفت بريجما مم. ويرد العدد من الحيوانات في الجزء السفلي من القضبان. أشرطة الخطأ تشير إلى sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : شريحة الإجراءات.
A: تظهر الصور الفوتوغرافية إعداد شرائح الدماغ الحادة. تم تبريد أدوات التشريح في الثلج المجروش قبل الاستخدام. ب: الدماغ التشريح والتشذيب. لاحظ أنه يجب التوجه زاوية التشذيب على الجانب الخلفي بالتوازي مع الاتجاه الجذعية. ج: تشريح الدماغ في دائرة فيبرتوم. حمم في المخزن المؤقت لتشريح الدماغ و bubbled باستمرار مع مزيج غاز₂ 95% O₂5% أول أكسيد الكربون. د: دائرة لواجهة مصنوعة من أواني الطعام البلاستيكية اثنين وأنبوب سيليكون. قاعة مليئة بالسائل النخاعي مصطنعة و bubbled باستمرار مع خليط الغاز. ﻫ: وضعت شرائح المخ على الورق تصفية الرطب في الدائرة.بار = 5 ملم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : إجراءات التصحيح المشبك.
أ: نظام التصحيح-المشبك المستخدمة لتسجيل الإشارات الكهربائية من خلية. ويبين الموقع تنشيط وتسجيل كهربائي في طبقة الخلايا العصبية الثاني/الثالث في القشرة الحركية الفئران. ب: لتحليل نهايات شافر من خلية CA1 الهرمية، وضعت قطب محفزة في رادياتوم الطبقة. لتحليل تيمبوروامونيك الاشتباكات العصبية، وضعت قطب محفزة في موليكولاري الطبقة. آثار الممثل من مقولة امبا وتظهر نمدا بوساطة مستقبلات التيارات بوستسينابتيك ضادات في العصبية CA1 نفسه. ج: نقطة ربط شريحة تم استخدامه لتثبيت الشريحة في قاعة التسجيل. د: خريطة تمثيل في القشرة الحركية، استناداً إلى الورقات المنشورة^15،،من¹⁶¹⁷. مل = خط الوسط. هاء: ميكروجرافس الأشعة تحت الحمراء-DIC من M1 طبقة الخلايا العصبية الثاني/الثالث قبل (العلوي) وأثناء التسجيل (السفلي). بار = 10 ميكرون. F: التغييرات في ماصة الحالية قبل اللمس (أعلى) وفي تمزق الأغشية (أسفل). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : الممثل نتائج التحليل الحالي-المشبك⁷ .
A: آثار الممثل لإمكانات العمل المسجلة بعد التعريفي بالحقن الحالية. ب: العلاقات بين المدخلات الحالية يعني (السلطة الفلسطينية) مقابل إمكانات العمل الناتج (عدد المسامير) شرائح الدماغ من غير مدربين (الحانات مفتوحة) ويوم واحد المدربين (الأشرطة الرمادية) 2 يوم تدريب الفئران (تملأ القضبان). ج: يستريح المحتملة، وعتبة، وأفتيرهايبربولاريزيشن من الخلايا العصبية طبقة الثاني/الثالث. د: غشاء المقاومة والمقاومة سلسلة من الخلايا العصبية. كنا 9-10 الفئران في كل مجموعة. ويرد العدد الخلايا داخل كل شريط. أشرطة الخطأ تشير إلى sem. *ف< 0.05، * *ف< 0.01 مقابل غير مدربين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 : الممثل نتائج التحليل المشبك الجهد¹¹ .
آثار الممثل مصغرة عليه والمثبطة بوستسينابتيك التيارات (ميبسكس وميبسكس) غير مدربين (A) وتجنب المثبطة (IA)-تدريب الفئران (ب). ميبسكس في أم-60، وميبسكس في 0 mV قيست تسلسلياً في الخلايا العصبية الهرمية نفس CA1 حضور تيدرودوتاكسين (0.5 ميكرومتر). شريط عمودي = السلطة الفلسطينية 20، أفقي شريط = 200 مللي ثانية. ج: مؤامرات الأبعاد يعني لي (ط) PSC ستريك غير مدربين، تدريب IA، مزاوج، والفئران التي يمر عبرها. د: مؤامرات ثنائي الأبعاد للي (ط) PSC الترددات في 4 مجموعات. علما أن كل الخلايا العصبية CA1 معارضها المختلفة يعني لي (ط) ستريك PSC والترددات. ليس فقط تعزيز التدريب IA ستريك يعني (E) ولكن أيضا زيادة الترددات للي (ط) الأحداث PSC (و). كنا 4-6 الفئران في كل مجموعة. ويرد العدد الخلايا في أسفل القضبان. علامات الجمع الأحمر (ج، د) وأشرطة مع خطوط عمودية (ه، و) تشير إلى ± يعني sem. * *ف< 0.01 مقابل مدربين الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تشريح المخزن المؤقت (مجموع 1 لتر)
نة2بو4 • 2 ح2س	ز 0.195	1.25 mmol/لتر
بوكل	ز 0.188	2.5 ملمول/لتر
كاكل2	ز 0.074	0.5 مليمول/لتر
مجكل2 • 6 ح2س	1.423 ز	7.0 mmol/لتر
كلوريد الكولين	ز 12.579	90 ملمول/لتر
حمض الأسكوربيك	ز 2.340	11.6 ميللي مول/لتر
حمض بيروفك	ز 0.342	3.1 مليمول/لتر
NaHCO3	ز 2.100	25 mmol/لتر
الجلوكوز	ز 4.500	25 mmol/لتر

الجدول 1: وصفه لتشريح المخزن المؤقت

CSF الاصطناعية (المجموع 1 لتر)
بوكل	ز 0.186	2.5 ملمول/لتر
كلوريد الصوديوم	ز 6.700	114.6 mmol/لتر
نة2PO4 •2H2س	ز 0.156	1 ملمول/لتر
الجلوكوز	ز 1.800	10 ملمول/لتر
NaHCO3	2.184 ز	26 mmol/لتر
مجكل م 12	4 مل	4 ملمول/لتر
كاكل م 12	4 مل	4 ملمول/لتر

الجدول 2: وصفه الاصطناعي السائل الدماغي النخاعي (CSF)

الحل داخل الخلايا المشبك الحالية (إجمالي 200 مل)
بوكل	ز 0.0746	5 mmol/لتر
كغلوكونات	6.089 ز	130 ملمول/لتر
هيبيس	ز 0.476	10 ملمول/لتر
عطا	ز 0.0456	0.6 ميللي مول/لتر
مجكل م 12	500 ميليلتر	2.5 ملمول/لتر
غ2 ATP	ز 0.4408	4 ملمول/لتر
أنشئ نا3	ز 0.0418	0.4 ملمول/لتر
فوسفوكريتيني نا	ز 0.510	10 ملمول/لتر

الجدول 3: تسجيل وصفه للتوصل إلى حل داخل الخلايا المشبك الحالية

الحل داخل الخلايا للجهد المشبك (إجمالي 200 مل)
كسميسو3	5

ز.244 (5.814) ^* 115 mmol/لتر (127.5) ^* CsCl ز 0.672 (0.252) ^* 20 ملمول/لتر (7.5) ^* هيبيس ز 0.476 10 ملمول/لتر اجتا ز 0.0456 0.6 ميللي مول/لتر مجكل م 1₂ 500 ميليلتر 2.5 ملمول/لتر غ₂ ATP ز 0.4408 4 ملمول/لتر أنشئ نا₃ ز 0.0418 0.4 ملمول/لتر فوسفوكريتيني نا ز 0.510 10 ملمول/لتر * انخفاض تركيز Cl^– للتسجيلات مصغرة

الجدول 4: تسجيل وصفه للتوصل إلى حل داخل الخلايا للجهد المشبك

معلمات		غير مدربين	ألف درب	مزاوج	سيرا على الأقدام
السعة ميبسك	الفرق	5.8	32.1	4.7	5.9
	الانحراف المعياري	2.4	5.7	2.2	2.4
	معامل التباين	0.189	0.326	0.177	0.190
السعة ميبسك	الفرق	17.1	56.7	31.8	20.7
	الانحراف المعياري	4.1	7.5	5.6	4.5
	معامل التباين	0.279	0.387	0.367	0.286

الجدول 5: تنوع مصغرة عليه والمثبطة بوستسينابتيك الحالي (ميبسك وميبسك) ستريك في تجنب المثبطة (IA)-تدريب الفئران

معلمات		غير مدربين	ألف درب	مزاوج	سيرا على الأقدام
التردد ميبسك	الفرق	278	2195	188	195
	الانحراف المعياري	17	47	14	14
	معامل التباين	0.902	1.198	0.893	0.874
التردد ميبسك	الفرق	3282	27212	1385	5135
	الانحراف المعياري	57	165	37	72
	معامل التباين	1.195	1.006	0.955	0.836

الجدول 6: تنوع مصغرة عليه والمثبطة بوستسينابتيك الحالي (ميبسك وميبسك) الترددات في تجنب المثبطة (IA)-تدريب الفئران

Discussion

القيد الرئيسي تقنية المشبك التصحيح شريحة هو التسجيل في إعداد شريحة، التي قد لا تعكس ما يحدث في الجسم الحي. على الرغم من أن التحليل الحالي-المشبك في فيفو أكثر موثوقية، فإنه يمثل تحديا تقنيا للحصول على بيانات كافية من الحيوانات واعية. وبكل العصبية الهرمية الخصائص الخلوية المختلفة، يلزم عدد كاف من الخلايا بشكل صحيح تحليل الاختلافات في الخلايا العصبية بعد التدريب. وعلاوة على ذلك، يتطلب تحليل الجهد-المشبك العلاج من تعاطي المخدرات مستمر مع كنقكس أو أبف أو بيكوكوليني لتحديد طبيعة الاستجابات بوستسينابتيك. لتحليل الردود مصغرة الناجم عن حويصلة واحدة غلوتامات أو GABA، مطلوب علاج متواصل مع تيدرودوتاكسين لعرقلة إمكانات العمل العفوي. على الرغم من أن تقنية التصوير المتعدد فوتون وضعت مؤخرا قوية لتحليل التغييرات الشكلية في نهايات ضادات¹⁹، مطلوب تقنية المشبك تصحيح مجتمعة لتحليل الدالة من نقاط الاشتباك العصبي في الجسم الحي. من الصعب جداً حاليا لتحليل التغييرات الشكلية في الاشتباكات العصبية المثبطة، منذ نهايات معظم المثبطة لا تشكل العمود الفقري. وفي هذا الوقت، سيكون المشبك التصحيح شريحة الأسلوب الأكثر ملاءمة لتحليل خصائص الخلية أو مهام نهايات ضادات/المثبطة في الحيوانات المدربة.

استخدام التحليل الحالي-المشبك (الشكل 4)، أبلغنا مؤخرا موتور اللدونة المتأصلة الناجمة عن التعلم في طبقة الثاني/الثالث من الخلايا العصبية. على وجه التحديد، 1 أيام المدربين الفئران أظهرت انخفاضا كبيرا في استراحة غشاء المحتملة وزيادة في عتبة سبايك. 2-يوم تدريب الفئران أظهرت زيادة كبيرة في استراحة غشاء المحتملة التي أدت إلى زيادة حدة. واقترحت هذه النتائج أن هناك كانت التغيرات الدينامية في اللدونة الجوهرية M1 طبقة الثاني/الثالث الخلايا العصبية في الفئران المدربة. وكشف تحليل المشبك الجهد الإضافي زيادة في نسبة النبض إقران في الفئران المدربة 1 يوم، مما يوحي بأنه كان هناك انخفاض عابر في احتمال الإفراج عن⁷غابا presynaptic. ولذلك فمن الممكن أن إزالة التثبيط من GABA في طبقة سينابسيس الثاني/الثالث قد تؤدي اللدونة المستحثة بالتعلم الناتجة في M1. ودعما لذلك، يتطلب إعداد شريحة M1 حمام العلاج مع حظر الإطارات مستقبلات GABA_A لحمل LTP²⁰.

تحليل إمكانيات بوستسينابتيك مصغرة وسيلة قوية لكشف اللدونة متشابك في IA-تدريب الحيوانات. متسلسلة من تسجيل ميبسكس وميبسكس في واحد CA1 الخلايا العصبية يسمح تحليل قوة ضادات/المثبطة متشابك لكل الخلايا العصبية الفردية. منذ واحد لي (ط) PSC استجابة يعزى إلى حويصلة واحدة غلوتامات أو غابا، زيادة لي (ط) PSC في السعة وتقترح تعزيز بوستسينابتيك. استخدام لي (ط) تحليل PSC، وجدنا الفروق الفردية في قوام ضادات/المثبطة مدخلات كل CA1 الخلايا العصبية (الشكل 5). تعزيز التدريب IA وضوح التنوع في قوة متشابك، ولكن هذا لم يلاحظ في المجموعات الأخرى (الجدول 5).

يمكن تحليل التنوع متشابك المستحثة بالتعلم رياضيا. بحساب احتمال ظهور كل نقطة، يمكن تحويل البيانات من كل الخلايا العصبية بالذات-الانتروبيا (بت) باستخدام معلومات نظرية كلود شانون هاء²¹. نقطة مع احتمال ظهور عالية (حول مستوى متوسط) يشير إلى المتمتعة بالحكم الذاتي-الانتروبيا منخفضة، بينما يشير إلى نقطة مع احتمال نادر جداً (نقطة انحرفت) المتمتعة بالحكم الذاتي-الانتروبيا عالية. بالمقارنة مع الفئران غير مدربين، المتمتعة بالحكم الذاتي-القصور حراري كل الخلايا العصبية زيادة وضوح في الفئران التي دربت IA لكن مزاوج ليس في أو يمر عبرها الفئران²². هذا التحليل يشير إلى أن هناك زيادة في المعلومات داخل CA1 بعد التعلم السياقية.

يمكن أيضا استخدام تقنية المشبك التصحيح شريحة ملقن خوفاً من تكييف الدراسات في اللوزة الجانبي⁹ والدراسات التجربة الحسية في قشرة البرميل⁸. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية مع تقنيات أخرى مختلفة لإجراء مزيد من التحقيقات. على سبيل المثال، الفيروس بوساطة أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل)-يمكن الجمع بين تقنية إيصال الجينات المعلمة مع تقنية المشبك التصحيح لتحليل وظيفة جزيئات محددة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام microinjection المحورية للراسم الوراء لتصور ذلك المشروع إلى منطقة معينة محددة من الخلايا العصبية. ثم، باستخدام تقنية المشبك الحالية، يمكن تحليل الخصائص الخاصة بالخلية في الخلايا العصبية تصور²³. علاوة على ذلك، استخدمت الجمع بين اثنين-فوتون ليزر المسح المجهري مع الليزر اثنين-فوتون أونكاجينج الغلوتامات لإظهار النمو الخاصة بالعمود الفقري ورد ابسك في الماوس القشرية طبقة الخلايا العصبية الهرمية الثاني/الثالث¹⁹. وهكذا، يجري تحسين تقنية المشبك التصحيح شريحة بالجمع بينها وبين رواية من المواد الكيميائية وإيصال الجينات وتقنيات معالجة الصور.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rota-Rod Treadmills	Med Associates Inc.	ENV577
inhibitory avoidance box	Shinano Seisakusho
Pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku
Blade	Nisshin EM Co., Ltd	LC05Z
Cardiac perfusion syringe	JMS Co., Ltd	JS-S00S
Vibratome	Leica Microsystems	VT-1200
Horizontal puller	Sutter Instrument	Model P97
Microfilm 34 gauge	World Precision Instruments, Inc	MF34G-5
0.22 µm filter	Millipore	SLGVR04NL
Axopatch–1D amplifier	Axon Instruments
Digidata 1440 AD board	Axon Instruments
pCLAMP 10 software	Axon Instruments
Upright Microscope	Olympus	BX51WI
CCD camera	Olympus	U-CMAD3
Camera controller	Hamamatsu Photonics K.K.	C2741
Stimulator	Nihon Kohden	SEN-3301
Isolator	Nihon Kohden	SS-104J
Motorized manipulator	Sutter Instrument	MP-285
Micromanipulator	Narishige	NMN-21
Peristaltic Pump	Gilson, Inc	MINIPULS® 3
Glass capillary	Narishige	GD-1.5
Ag/AgCl electrode	World Precision Instruments, Inc	EP4
Slice Anchor	Warner instruments	64-0252
Stimulus electrode	Unique Medical Co., Ltd	KU201-025B
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Dissection buffer/ artificial CSF
NaH2PO4 • 2H2O	Sigma-Aldrich Co.	C1426
KCl	Wako Pure Chemical Industries	163-03545
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries	039-00475
MgCl2 • 6H2O	Wako Pure Chemical Industries	135-00165
Choline chloride	Sigma-Aldrich Co.	C7527
Ascorbic acid	Wako Pure Chemical Industries	190-01255
Pyruvic acid Na	Wako Pure Chemical Industries	199-03062
NaHCO3	Sigma-Aldrich Co.	28-1850-5
Glucose	Sigma-Aldrich Co.	07-0680-5
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
K-Gluconate	Sigma-Aldrich Co.	G4500
HEPES	Wako Pure Chemical Industries	346-01373
EGTA	Wako Pure Chemical Industries	348-01311
Na2 ATP	Nacalai Tesque	01072-24
Na3 GTP	Sigma-Aldrich Co.	G-8877
Na phosphocreatine	Sigma-Aldrich Co.	P-7936
CsMeSO3	Sigma-Aldrich Co.	C1426
CsCl	Wako Pure Chemical Industries	033-01953
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Drugs in aCSF
2-Chloroadenosine	Sigma-Aldrich Co.	C5134
Picrotoxin	Sigma-Aldrich Co.	P-1675
Tetrodotoxin	Wako Pure Chemical Industries	207-15901
CNQX	Sigma-Aldrich Co.	C239
APV	Sigma-Aldrich Co.	A5282