عالية متعددة، والتصوير فائقة الدقة من الخلايا T باستخدام مادستورم

Summary

نحن نبرهن على طريقة لصورة الجزيئات متعددة داخل نانو الهياكل غير متجانسة في دقة جزيء واحد باستخدام ملزم متتابعة وشطف من الأجسام المضادة فلورزنتلي المسمى.

Abstract

وقد عرقل التصوير الهياكل الخلوية غير متجانسة باستخدام جزيء واحد المترجمة المجهري من قبل عدم كفاية الدقة التعريب والقدرة على مضاعفة. باستخدام الفلورسنت نانو الماس علامات فيدوسيال، ونحن تصف تصحيح الانجراف وإجراءات المحاذاة المطلوبة للحصول على دقة عالية في جزيء واحد المترجمة المجهري. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف استراتيجية تعدد الإرسال الجديدة، مادستورم، التي تستهدف جزيئات متعددة في نفس الخلية باستخدام ملتزمة متتابعة وشطف من الأجسام المضادة الفلورسنت. ويظهر مادستورم على خلية T تنشيط لتصور مواقع مكونات مختلفة داخل هيكل غشاء، متعدد البروتينات يسمى مستقبلات الخلايا الدقيقة T. وبالإضافة إلى ذلك، ويناقش تطبيق مادستورم كأداة عامة لتصور الهياكل متعددة البروتين.

Introduction

وقد وضعت مجموعة متنوعة من تقنيات فائقة الدقة المجهر للتغلب على حد حيود المجهر الضوئي (~ 200 نانومتر). من بين هذه هي فئة من التقنيات تسمى جزيء واحد المجهر توطين (سملم) الذي يتضمن الصورة تنشيط التنشيط المجهري (بالم) والموجات الدقيقة المجهر الضوئي العشوائي (ستورم). تقنيات سملم حصة في استخدام فلوروفوريس التي يمكن أن تنتقل بين (على الفلورسنت) وخارج (الظلام / صورة التبديل) الدول، مما يسمح توطين متتابعة من مضان من جزيئات واحدة ^{1 ، 2 ، 3} .

وبسبب توافقه مع الأصباغ والمجاهر المتاحة تجاريا، أصبح ستورم المباشر (دستورم) تقنية سملم المعتمدة على نطاق واسع ⁴ . دستورم يمكن أن يحقق بشكل روتيني ~ 10 نانومتر توطين الدقة، وتعرف بأنها عدم اليقين في حساب مركز من الانعكاسأيون محدود نقطة انتشار وظيفة (بسف). ومع ذلك، على الرغم من الدقة العالية المقدرة باستخدام خوارزميات توطين ^{5 ، 6 ، 7} ، وقد عرقل تحديد دقيق للموقع الفعلي من جزيئات واحدة من قبل عدد من القضايا. أولا، الحركة الميكانيكية للمرحلة المجهر أثناء الحصول على الصور يضيف عدم اليقين كبيرة لدقة التعريب. كما يتم الحصول على الصور سملم أكثر من الآلاف من الأطر الزمنية الفاصل الزمني، والحركات نانو على نطاق والمرحلة المجهر يمكن أن يضر بشكل كبير دقة الصورة النهائية فائقة الدقة ⁸ . للتعويض عن حركة المرحلة أثناء الحصول على الصور، ويقدر عادة الانجراف المرحلة من الانحدار القائم على تركيب التوطين بيند من الصورة نفسها (عبر الارتباط) أو التعريبات متتابعة من علامات فيدوسيال (تصحيح فيدوسيال) ^{1 ، 9} . Howevإيه، تتطلب هذه الأساليب التحسين من المعلمات متعددة لكل كومة الصورة، ولا يمكن أن تمثل لحركات المرحلة في جداول زمنية قصيرة مثل الاهتزاز الميكانيكي. وقد استخدمت جسيمات النانو الذهب وحبات الفلورسنت متعددة الألوان كعلامات فيدوسيال في سملم، ولكنها ليست مستقرة الصورة، وتؤدي إلى دقة أقل بكثير بعد تصحيح الانجراف من النيتروجين الشواغر مركز الفلورسنت نانو الماس (فندس) المستخدمة في مادستورم ¹⁰ .

بالإضافة إلى الحد من الحيود، والمجهر الضوئي أكثر تقييدا ​​من قبل الحدود الطيفية. التصور في وقت واحد من أهداف متعددة يتطلب تحقيقات الفلورسنت مع التشكيلات الطيفية غير متداخلة، وتقييد عموما مضان الضوء القائم على المجهر إلى 6 ألوان و سملم إلى 2-3 ألوان ^{4 ، 11 ، 12} . وعلاوة على ذلك، انحراف لوني غير الخطية يسبب عدم اتساق الصور متعددة الألوان، ثهيش تتطلب إجراءات محاذاة واسعة باستخدام علامات متعددة الألوان فيدوسيال ^{8 ، 13} . للتغلب على هذه الحدود، وقد صورت الدراسات السابقة أهداف متعددة باستخدام فوتوبلاشينغ المتكررة أو التبريد الكيميائي من فلوروفوريس ملزمة بالتتابع ^{14 ، 15 ، 16 ، 17 ، 18 ، 19} . في حين أن هذه الأساليب يمكن التغلب على الحدود الطيفية للمجهر، ومن المعروف تبييض مضان لتكون عملية سامة ²⁰ ، والتبييض لفترات طويلة أو التبريد قد يسبب آثار جانبية غير مرغوب فيها مثل فقدان التشابك. وعلاوة على ذلك، فإن تراكم تحقيقات الفلورسنت يمكن أن يؤدي إلى حجب ستيريك من مواقع الربط في العينة، ومنع تعدد الإرسال على نطاق واسع واستهداف قوي من الحواتم. ولتجنب مثل هذا التداخل الاستباقي، حدث مؤخراتيودي تحقيق تعدد الإرسال باستخدام تبادل مؤشر ستوكاستيك من شظايا البروتين نشر بحرية ²¹ . في حين أن هذا الأسلوب يسمح وضع العلامات كثيفة من الهياكل الخلوية، فإنه يتطلب إعداد البيوكيميائية واسعة لعزل شظايا الببتيد، لا يمكن تحديد مواقع جزيء واحد، ولا يسهل بسهولة متعددة النطاق على نطاق واسع باستخدام تحقيقات المتاحة تجاريا. نقدم بروتوكول فيديو مفصل يصف ملزمة متتابعة وشطف من الأجسام المضادة فلوريسنتلي لمضاعفة، والأضداد محدودة الحجم دستورم (مادستورم) التصوير، واستخدام الفلورسنت نانو الماس لتحقيق تصحيح الانجراف الدقيق والمحاذاة.

Protocol

تنبیھ: یرجی الرجوع إلی جمیع صحائف بیانات سلامة المواد ذات الصلة (مسس) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول هي سامة ومسرطنة. يرجى استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند تنفيذ البروتوكول بما في ذلك استخدام الضوابط الهندسية (غطاء الدخان، علبة القفازات) ومعدات الحماية الشخصية (نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر، والسراويل طول كامل، وأحذية مغلقة اصبع القدم).

1. التصوير المضاعف من خلايا T المنشط

1. مباشرة اقتران الأجسام المضادة مع اليكسا-647 (A647) صبغ باستخدام اليكسا 647 الأجسام المضادة وسم كيت. اتبع بروتوكول وضع العلامات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
   ملاحظة: ينصح غسيل الكلى من محلول الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني 1X قبل هذه الخطوة لزيادة كفاءة وسم الأجسام المضادة.
2. تدور الأجسام المضادة المسمى لمدة 5 دقائق في 20،800 رسف وجمع طاف لإزالة الأجسام المضادة المجمعة.
3. إعداد الفلورسنت نانو الماس كوفرسليبس المغلفة
   1. معطف 8 جيدا غرف ساترة (انظر الكاشف / قائمة المواد) مع 250 ميكرولتر 0.01٪ بولي L- يسين (بل) لمدة 15 دقيقة، نضح، وجافة عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. (لا يشطف قبل التجفيف.)
   2. إعداد التخفيف من 100 نانومتر فندس في برنامج تلفزيوني 1X. اختبار التخفيفات المختلفة لضمان ما يكفي من فندس مرئية كل حقل من وجهة نظر في الخطوة 1.2.7 (نحن نستخدم التخفيف 1: 200 من فندز المقدمة من قبل الشركة المصنعة).
   3. دوامة المخفف فندس لمدة 1 دقيقة.
   4. يصوتن طاف فند لمدة 30 ثانية في إعداد عالية الطاقة.
   5. احتضان طاف فند سونيكاتد في بل المغلفة 8 جيدا غرفة ساترة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   6. غسل 5X مع برنامج تلفزيوني 1X وتصور الغرفة المغلفة فند باستخدام 647 نانومتر الإثارة الليزر على المجهر تيرف. من الناحية المثالية، 4-10 فندز الفردية يجب أن تكون مرئية في مجال الرؤية نظرا للتخفيف المناسب من فندس في الخطوة 1.2.2 (نحن نستخدم هدف 100X مع 256 × 256 بكسل بكسل الإعداد لإنتاج 61 × 61 ميكرون مجال الرؤية) مع فيواحدة على الأقل فند موجودة في كل رباعي من مجال التصوير. إذا كان فند يبدو أن متجمعة ( أي فندس مع إشارة أعلى بكثير من المحيطة فند ودالة انتشار نقطة أكبر من 200 نانومتر)، أجهزة الطرد المركزي فندس في 6،800 رسف لمدة 1 دقيقة، وكرر إجراء الطلاء باستخدام طاف فند.
   7. إضافة 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة CD3 (10 ميكروغرام / مل) في كل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   8. إزالة الحل وإضافة برنامج تلفزيوني 1X لمدة 30 ثانية. كرر هذه الخطوة غسل 5 مرات (غسل 5X).
4. تفعيل الخلايا T جوركات
   1. تدور 1 مل من الخلايا جوركات T في 800 رسف لمدة 6 دقائق و ريسوسبيند في 300 ميكرولتر حل هبس 1X. يجب أن تكون الخلايا جوركات T مثالي في تركيز 0.5-1.0 × 10 ⁶ خلايا / مل قبل الغزل. يتكون حل هبس 1X من هيبيس العازلة المالحة مع 1٪ ألبومين المصل البقري كما هو موضح سابقا ²² .
   2. إضافة 150 ميكرولترمن 1X حل هبس في كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   3. إضافة 50 ميكرولتر معلق الخلايا جوركات T لكل بئر واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   4. إضافة 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   5. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني 1X.
   6. بيرمابيليز الخلايا بإضافة 250 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون-X الحل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   7. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني 1X.
   8. إضافة 250 ميكرولتر 1٪ حل الجيلاتين الأسماك في برنامج تلفزيوني 1X لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   9. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني 1X.
5. التصوير تنشيط الخلايا جوركات T باستخدام مادستورم
   1. إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة المسمى في 0.1-0.5 ميكروغرام / مل إلى خلايا ثابتة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   2. غسل 5X مع برنامج تلفزيوني 1X.
   3. إضافة 1 مل من العازلة ستورم وتغطية الغرفة مع ساترة الزجاج للحد من التعرض للهواء. وقد تم وصف المخزن المؤقت ستورم سابقا ¹⁰ . نوصي بماالملك الجديد ستورم العازلة لكل جولة من التصوير والغزل العازلة ستورم في 20،800 رسف لمدة 2 دقيقة لإزالة الرواسب.
   4. باستخدام منخفضة 647 نانومتر قوة الليزر في وضع تيرف، حدد خلية ملون مع ما لا يقل عن 3 فندس في مجال الرؤية. للمساعدة في تحديد موقع فندس، يمكن أن تستخدم الإثارة المصاحبة مع 568 نانومتر ليزر لزيادة سطوع إشارة فند.
      ملاحظة: يحسن أداء التصحيح فيدوسيال المتوسط ​​الموصوف في القسم 2.1 مع إدراج المزيد من فند.
   5. زيادة 647 نانومتر طاقة الليزر والحصول على الصور. نحن عادة الحصول على 10،000 إطارات في التعرض 200 مللي ثانية، 125 ميغاواط 647 نانومتر ليزر، 100X تيرف عدسة موضوعية (1.49 نا)، 100X إم كسب (5 ميغاهرتز في 16 بت، كسب التحويل 1). وقد وصفت تفاصيل الإعداد التصوير لدينا سابقا ¹⁰ .
   6. غسل 5X مع تبس 1X.
   7. إضافة 1 مل س(3.5 M مغكل ₂ ، 20 ملي أنابيب، 0.1٪ توين 20، ودرجة الحموضة 6.5) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
   8. كرر شطف 3 مرات. (شروط شطف الدقيق وعدد الشطف شطف اللازمة لإزالة إشارة يجب التحقق من كل الأجسام المضادة المستخدمة).
   9. غسل 3X مع تبس 1X وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
   10. فوتوبلاش باستخدام الليزر 647 نانومتر في الطاقة العالية (125 ميغاواط) مع ليزر 405 نانومتر في 2-5 ميغاواط إلى الصورة-تنشيط A647 الأصباغ في حالة مظلمة. انتظر حتى كل إشارة المتبقية من الأجسام المضادة غير إلوتد هو فوتوبلاشد. وعادة ما يستغرق ذلك من 2 إلى 5 ثانية من التعرض للليزر. الحصول على عينة الصور (~ 100 إطارات) باستخدام إعدادات ستورم في 1.3.5 بعد شطف و فوتوبلاشينغ يوصى لتأكيد إزالة إشارة.
       نحن عادة إزالة 99.8٪ من إشارة باستخدام هذه الطريقة. نوصي اختبار كفاءة شطف كل الأجسام المضادة قبل الاستخدام في مادستورم كما هو موضح سابقا ¹⁰ .
   11. إضافة 250 ميكرولتر 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة. هذا بيأرالأحداث عكس تشابك الجزيئات الثابتة في الخلية.
   12. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني 1X.
   13. كرر الخطوات من 1.3.1-1.3.12 لوضع علامات متتابعة لأهداف متعددة. ويبين الشكل 1 صورة مركبة من جزيئات متعددة في خلية جوركات T تنشيط المكتسبة باستخدام مادستورم.

2. الانجراف تصحيح ومحاذاة مداخن صورة متعددة

1. تصحيح الانجراف من مداخن صورة مداخن
   1. فتح الصور باستخدام إيماجيج. نوصي بتحويل ملفات الصور إلى تنسيق تيف قبل فتح في إيماجيج. استخدام عائد الاستثمار المستطيل لتحديد فند واحد. لعب الفاصل الزمني للتأكد من أن فند مرئية في كل إطار من كومة الصورة. استخدام تحليل تشغيل في البرنامج المساعد ثوندرستورم لتوطين فند. وبالنسبة إلى أسلوب التصحيح الإيقاعي المتوسط ​​الموصوف في الفقرة 2.1.5، من المهم أن تكون فند واحدة مترجمة في كل إطار صورة ( أي عدد القمم المحددة ينبغي أن يكون eكم لعدد الإطارات).
   2. إذا لم يتم التعرف على فند في كل إطار، حدد فند آخر. إذا كانت قمم متعددة تقع في إطار واحد، إزالة الذروة التي تنحرف أكثر من القمم السابقة.
   3. كرر 2.1.2 لكل فند في كومة الصورة. نضع في اعتبارنا أن بعض فندس لا ينبغي أن تدرج في عملية التصحيح الانجراف بحيث يمكن أن تكون بمثابة مقياس مستقل لدقة تصحيح الانجراف كما هو موضح في الخطوة 2.1.7.
   4. ولتصحيح الانحراف الأسرع والأقل دقة، استخدم إما خوارزميات التصحيح المتقاطع أو التصحيح الإملائي المتضمنة في ثوندرستورم لتصحيح صور فند. عادة، ونحن نستخدم 100 صناديق، 5 التكبير، و 0.1 عامل تجانس مسار لصلات الصليب و 10 مسافة كحد أقصى، 0.1 دقيقة نسبة علامة علامة، و 0.01 مسار عامل تمهيد للتصحيح فيدوسيال. وسوف يؤدي الترابط المتقاطع والتصحيح اللفظي إلى ملف تصحيحي يمكن تطبيقه على فند أخرى لاختبار دقة تصحيح الانجراف.
   5. ولتصحيح الانجراف الأكثر صرامة وأكثر دقة، استخدم خوارزمية التصحيح الإحيائي المتوسط ​​(أفك) كما هو موضح سابقا ¹⁰ . ولا تتطلب هذه العملية تحسين المعلمات وتؤدي إلى دقة توطين أعلى مما توقعته خوارزميات توطين سملم. ومع ذلك، يتطلب تصحيح الانحراف المتوسط ​​متوسطا لا يقل عن 4 ضواحي فند ولتوضع فندس في كل رتل من كومة الصورة. ويتحقق تصحيح الانجراف أفك بشكل أفضل مع إدراج المزيد من شبكات الدفاع الجوي الوطنية لأن عددا كبيرا من شبكات الدفاع الجوي المحلية المترجمة سوف يقلل من التأثير المشوه للذروة الخارجة في إطار معين.
   6. توطين جميع وظائف انتشار نقطة داخل كومة الصورة باستخدام ثوندرستورم كما هو موضح سابقا ¹⁰ . نحن عادة استخدام حجم بكسل 100 نانومتر، الضوئية لكل A / D العد من 4.28، مستوى قاعدة A / D عدد 100، إم كسب 100، بسف: التوطين غاوس المتكاملة، 5 دائرة نصف قطرها تركيب المناسب، وأقصى طريقة المناسب احتمال، و 1.3 بكسل سيغما الأولي.
   7. تطبيق عامل تصحيح الانجراف المكتسبة من فندز إلى توطين من كومة الصورة بأكملها. تفقد بصريا الصورة النهائية لضمان تصحيح الانجراف السليم ( الشكل 2 ). وينبغي اختبار عامل تصحيح الانجراف الناتج على نحو مستقل على الشبكات دون المعطيات غير المدرجة في الإجراء أفك لقياس مستوى دقة تصحيح الانجراف. وينبغي أن تكون دقة المعطيات المستقيمة المصححة بالإنجراف قريبة من متوسط ​​قيمة الدقة / عدم التيقن المحسوبة من خوارزمية التوطين المستخدمة في الخطوة 2-1-6.
   8. كرر الخطوات 2.1.1-2.1.7 لمداخن صورة مادستورم من الأجسام المضادة المسمى بالتسلسل. نضع في اعتبارنا أن توطين نفس مجموعة من فندز في كل كومة صورة مادستورم أمر بالغ الأهمية لإجراء المحاذاة التالية.
2. محاذاة الصور مادستورم
   1. حساب موقف سينترويد من فند تصحيحها الانجراف في كل صورة مادستورم. للقيام بذلك، والعثور على متوسط ​​x و y محور بولكل من فند المترجمة، ومتوسط ​​متوسط ​​x و y مواقف جميع فند في كل صورة مادستورم. تم وصف الخوارزمية التفصيلية لهذه الخطوة سابقا ¹⁰ . محاذاة الصور مادستورم متتابعة باستخدام مواقف سينترويد من علامات فند فند. لإجراء المحاذاة، وحساب الإزاحة بين اثنين من الصور مادستورم المترجمة عن طريق طرح موقف سينترويد من فندس في الصورة مادستورم الثاني من الأول. ثم طرح مبلغ الإزاحة من جميع التعريبات في صورة مادستورم الثانية.
   2. نوصي باستخدام صورة مادستورم الأولى كصورة مرجعية وتكرار هذه الخطوة محاذاة بين الأول والثالث، الأول والرابع، الخ اختبار دقة المحاذاة عن طريق قياس الإزاحة بين فندس غير المدرجة في عملية المحاذاة. قد تشير إزاحة كبيرة إلى أن مجموعات مختلفة من فند تم استخدامها عند حساب مواقف سينترويد من الصور مادستورم متتابعة.
   3. إذا كان الأمر كذلك، الخطوات 2.2.1-2.2.2 شويتم تكرار لد باستخدام نفس مجموعة من فندز لإجراء المحاذاة.
      ملاحظة: يتم توفير رموز مخصصة لكل من التصحيح الانجراف أفك وإجراءات المحاذاة.

النتائج

تم استخدام طريقة الشطف والتلطيخ المتسلسل لإنتاج صورة مادستورم المضاعفة للميكروسترات وغيرها من الهياكل في خلية T جوركات المنشطة ( الشكل 1 ، والتحقق من التحالفات الرقم). كل صورة شبه الزائفة تمثل جولة واحدة من التصوير مادستورم المكت...

Discussion

وتتيح عمليات تعدد الإرسال المتتابعة، وتصحيح الانحراف، وإجراءات المحاذاة في مادستورم تصورا دقيقا ومتعدد الإرسال للغاية للهياكل غير المتجانسة في الخلايا. ¹⁰ بالإضافة إلى ذلك، مادستورم يتجنب القيود من متعدد الألوان ستورم مثل انحراف لوني والخصائص دون الم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
8 well coverslip chamber	Lab-tek	155409
0.1% Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond	Adamas	Red FND
anti-CD3ε antibody	BD Biosciences	555329
Bovine serum albumin, Fraction V	KSE Scientific	98-100P
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
10% Paraformaldehyde	EMS	15712	Carcinogen
Gelatin from fresh water fish skin	Sigma-Aldrich	G7041
Alexa 647 antibody labeling kit	Thermo Fisher	A20186
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	138924
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7154	Highly toxic, air sensitive
Cysteamine	Sigma-Aldrich	30070	Highly toxic
Cyclooctatetraene 98%	Sigma-Aldrich	138924	Highly toxic, air sensitive
10x PBS	KD Medical	RGF-3210
10x TBS	KD Medical	RGF-3385