تقنيات الفحص المجهري [كنفوكل] لدراسة تفاعلات البروتين البروتين وحركية في الحمض النووي آفات متقدمة

Summary

ميكرويرادييشن الليزر أداة مفيدة لإجراء دراسات لإصلاح الحمض النووي في الخلايا الحية. يتم عرض نهج منهجي لاستخدام أشعة الليزر فوق البنفسجية للحث على مختلف الآفات الحمض النووي. ونحن قد الأمثل طريقة ميكرويرادييشن المحلية أن يحافظ على دورة الخلية الطبيعية؛ وهكذا، خلايا المشع المضي قدما من خلال الانقسام.

Abstract

ميكرويرادييشن المحلية مع الليزر يمثل أداة مفيدة للدراسات المتعلقة بالعمليات المتصلة بإصلاح الحمض النووي في الخلايا الحية. وهنا يصف لنا منهجية لتحليل حركية البروتين في الآفات الحمض النووي عبر الوقت أو البروتين-بروتين تفاعلات على الكروماتين ميكرويرادياتيد محلياً. ونحن أيضا إظهار كيفية التعرف على كل مراحل دورة الخلية استخدام نظام الهاتف الخلوي فوكسي لدراسة حركية الخلية-دورة-تعتمد على البروتين في الآفات الحمض النووي. وصف منهجية لاستخدام أشعة الليزر فوق البنفسجية اثنين (355 نانومتر و 405 نانومتر) للحث على أنواع مختلفة من تلف الحمض النووي ويرد أيضا. انتقل من خلال الانقسام عادة فقط ميكرويرادياتيد الخلايا بليزر صمام ثنائي 405 نانومتر وكانت تخلو من سيكلوبوتاني بيريميدين dimers (وثائق). نعرض أيضا كيف يمكن أن تكون ثابتة الخلايا ميكرويرادياتيد في نقطة زمنية معينة لأداء إيمونوديتيكتيون البروتينات الذاتية للفائدة. دراسات إصلاح الحمض النووي، بالإضافة إلى ذلك يمكننا وصف استخدام الأساليب الفيزيائية الحيوية بما في ذلك فراب (Fluorescence الانتعاش بعد فوتوبليتشينج) وفليم (Fluorescence عمر التصوير المجهري) في الخلايا بصورة عفوية تحدث بؤر تلف الحمض النووي. نعرض أيضا طلبا من فليم-الحنق (Fluorescence الرنين الطاقة نقل) في الدراسات التجريبية لتفاعلات البروتين البروتين.

Introduction

أضرار الحمض النووي يؤدي إلى ظهور آفات الحمض النووي يتألف من سيكلوبوتاني بيريميدين dimers (وثائق البرامج القطرية)، 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine، وحبلا واحد أو مزدوج-حبلا فواصل^1،2. أشعة γ هي الشكل الإشعاع المؤين بالطاقة أعلى و penetrance عالية، وبالتالي مصدر هذا الإشعاع يستخدم على نطاق واسع في العلاج الإشعاعي³. من ناحية أخرى، التي يسببها تجريبيا الحمض النووي الأضرار الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية أشعة الليزر يقلد التعرض الطبيعي لضوء الأشعة فوق البنفسجية. ميكرويرادييشن فوق البنفسجية، كطريقة مجهرية، يمثل أداة تجريبية لدراسة أضرار الحمض النووي في الخلايا الحية الفردية. واستخدمت ميكرويرادييشن لأول مرة منذ 40 عاماً من أجل الكشف عن تنظيم المناطق كروموسوم^4،5. هذا الأسلوب يعتمد اعتماداً كبيرا على أما الخصائص الوظيفية لمجاهر [كنفوكل] أو حدود التقنية الحديثة نانوسكوبي. للحث على آفات الحمض النووي، يمكن بريسينسيتيزيد الخلايا 5 ' بروموديوكسيوريديني (بردو) أو هويشت 33342 قبل إشعاع الأشعة فوق البنفسجية. Bártová et al. ⁶ الموصوفة سابقا في الخطوة بريسينسيتيزيشن، ومؤخرا أننا الأمثل هذا الأسلوب ميكرويرادييشن لتفادي موت الخلية، أو المبرمج. على سبيل المثال، استخدام الليزر الأشعة فوق البنفسجية 405 نانومتر (دون هويشت 33342 بريسينسيتيزيشن) يؤدي إلى تنصيب 53BP1 إيجابية مزدوجة-حبلا فواصل (دسبس) على حساب سيكلوبوتاني بيريميدين dimers (وثائق البرامج القطرية). من ناحية أخرى، خطوات بريسينسيتيزيشن جنبا إلى جنب مع ميكرويرادييشن الأشعة فوق البنفسجية تحفز مستويات عالية جداً من مشاريع وثائق البرامج القطرية ودسبس في نفس الوقت^7،8. هذه المنهجية من الصعب تطبيقه لدراسة مسار إصلاح الحمض النووي واحد.

مع ميكرويرادييشن، من الممكن تحليل البروتين التوظيف، والحركية، والتفاعل في الآفات الحمض النووي في الخلايا الحية. مثال على هذا الأسلوب ونشرت لويجستيربورج et al. ⁹ heterochromatin البروتين 1β، ونحن مؤخرا أظهرت للمرة الأولى أن توظيف عامل بلوريبوتينسي Oct4 وبروتين المرتبطة بالهيئات كاجال، كويلين،^6،الآفات المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية الحمض النووي¹⁰. حركية البروتين في هذه الآفات الحمض النووي يمكن أن تدرس أيضا استخدام ال^12،11،فراب (Fluorescence الانتعاش بعد فوتوبليتشينج)¹³ أو تآكل (Fluorescence الرنين الطاقة نقل) تقنيات^{14 ،15}. هذه الأساليب قد يحتمل أن تكشف عن نشر بسيطة من البروتينات في الآفات الحمض النووي أو تفاعلات البروتين البروتين. هو أداة مفيدة لتحديد خصائص إضافية من البروتينات فليم (Fluorescence عمر التصوير المجهري) أو في التركيبة مع الحنق التكنولوجيا (الحنق-فليم)¹⁶. تمكن هذه الطرق دراسة العمليات في تعيش الخلايا التي يتم ثابت أو عابر التعبير عن البروتين التي تهم معلم ب جزيء فلوري¹⁷. وهنا يظهر مثال وقت تحلل أسي (τ) للبروتين p53 معلم بروتينات فلورية خضراء وشريكتها التفاعل، 53BP1 معلم مشري، لعب دوراً هاما في الحمض النووي الضرر استجابة^18،19 . Τ المعلمة، عمر فلوروتشرومي المقدمة من حسابات فليم، محددة لصبغة fluorescence معينة ولها قدرات الربط وبيئتها الخلوية. ولذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تبين لنا الفروق بين الفئات السكانية الفرعية البروتين وقدراتهم ملزمة وخصائصها الفنية بعد، على سبيل المثال، الحمض النووي الضرر.

هنا، مخططا للأساليب المنهجية لتقنيات متقدمة في الفحص المجهري الذي يستخدم في المختبر لدراسة التوظيف البروتين محددة زمنياً وحركية، ونشر، وتفاعلات البروتين البروتين في الموقع الكروماتين ميكرويرادياتيد ويرد. وترد المنهجية خطوة بخطوة لاستحثاث المحلية آفات الحمض النووي في الخلايا الحية، ووصفاً لمنهجيات مفيدة لإجراء دراسات للأحداث المتعلقة بالحمض النووي-الضرر في المستحثة محلياً آفات الحمض النووي الناجم عن أشعة الليزر الأشعة فوق البنفسجية.

Protocol

1. "زراعة خطوط الخلايا"

1. خطوط الخلايا المستمدة من هيلا
   ملاحظة: "هيلا استخدام" خلايا سرطان عنق الرحم: أما خلايا هيلا ستابلي معربا عن هيستون H2B معلم مع الخلايا بروتينات فلورية خضراء أو هيلا فوكسي الإعراب عن طلب تقديم العروض-Cdt1 في G1 والمراحل S الأولى والتجارة والنقل-جيمينين في مراحل S/G2-م ( الشكل 1).
   1. لزراعة جميع خطوط الخلايا المستمدة من الحلة، استخدم دولبيكو ' s تعديل النسر ' s المتوسطة (دميم) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين والمضادات الحيوية المناسبة في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO ₂. استبدال متوسط 2-3 مرات في الأسبوع.
   2. إزالة الثقافة المتوسطة، وشطف الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني x 1 للقضاء على كل أثر للمصل الذي يحتوي على مثبط التربسين. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء واقية في درجة حرارة الغرفة-
   3. إضافة 1 مل من بريوارميد التربسين-يدتا حل لتغطية طبقة الخلية، وإبقاء الخلايا في 37 درجة مئوية. تريبسينيزي الخلايا حتى طبقة الخلايا موزعة (عادة 3-5 دقائق).
   أضف 3 مل متوسط النمو الكامل بريوارميد لإلغاء تنشيط يدتا التربسين
   4. ، وتفريق المتوسطة بلطف بيبيتينج عدة مرات-
      ملاحظة: يجب أن يتم هذا الإجراء بغطاء واقية من أجل حماية المشغل من الملوثات والحفاظ على ظروف زراعة الخلية أمثل.
   حساب عدد الخلايا استخدام العداد خلية التلقائي أو دائرة Bürker
   5. . تمييع تعليق الخلية إلى 1 × 10 ⁵ خلايا/مل و 5 مل بيبيت في طبق جديد. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO ₂-
2. زراعة الماوس الخلايا الجذعية الجنينية (ميسكس)، خط الخلية D3
   1. ميسكس الثقافة في خلية ثقافة أطباق مغطاة بطبقة متوسطة صيانة الجيلاتين ومسك 0.2%. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO ₂-
      ملاحظة: يوصي إعداد وسيلة زراعة وصيانة ميسكس في مختبرين 50 مل وتخزينها في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. المتوسطة ©جميع يحتوي على 75 مل دإط الخلايا FBS، 5 مل البنسلين G وستربتوميسين، 5 مل "الأحماض الأمينية" الأساسية عدم (10 ملم) (تركيز النهائي 0.1 ملم)، 50 ميليلتر الفأر "عامل مثبط لسرطان الدم" (مليف؛ 100 ميكروغرام/مل) (تركيز نهائي 10 نانوغرام/مل)، ميليلتر 430 قهوة (1- ثيوجليسيرول؛ 1: 100 تمييع في دميم) (تركيز نهائي 100 ميكرومتر) والمتوسطة دميم الجلوكوز عالية تصل إلى 500 مل.
   2. نضح المتوسطة زراعة ©جميع من طبق الثقافة وشطف الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 س.
   إضافة 0.5 مل يدتا التربسين
   3. واحتضان في 37 درجة مئوية فقط حتى تبدأ الخلايا لفصل من الطبق. ثم إلغاء تنشيط التربسين غسل الخلايا مع 2 مل من مسك زراعة المتوسطة وتستكمل مع 15% مصل بقرى الجنين.
   4. استخدام ماصة إزاحة الخلايا المتبقية من طبق الثقافة-
      ملاحظة: من المهم الحصول على الخلايا المفردة، نظراً لكتل الخلية تعزيز التفريق بين الخلايا.
   5. انقسام الخلايا 01:10 على أطباق مهيلم مع مسك الصيانة المتوسطة-
      ملاحظة: إذا كانت كثافة الخلايا ©جميع منخفضة جداً، أنها لا تنمو جيدا؛ إذا كانت الكثافة عالية جداً، ويتم تشجيع التمايز.
   6. ضمان الإبقاء على ميسكس في حالة غير متمايزة بأداء المرور مسك كل يوم الثاني عن طريق تقسيم الخلايا من صحن بيتري واحد إلى أربعة أطباق جديدة. تفقد المستعمرات مسك مع مجهر مقلوب تحت 100 X أو 200 X التكبير، وإذا لم يكن هناك دليل على مس عفوية تمايز الخلية، أداء البقع الغربية لتقييم استنزاف البروتين Oct4.
      ملاحظة: مع الخلية الأمثل باساجينج، التفريق عفوية في ميسكس في المختبر ويمكن تخفيض-

2. خلية تعداء

1. بذور الخلايا 48 ساعة قبل تجارب على الأطباق الشبكية مجهرية (قطرها 35 ملم) بغية العثور على خلايا ميكرويرادياتيد حسب إحداثياتها على طبق بيتري.
   ملاحظة: هذا هو مثال في ميكرويرادييشن الذي هو أول خطوة تجريبية وهو إيمونوستاينينج الثاني ( الشكل 2A).
   1. للبذر، استخدم بتركيز من 5 × 10 ⁴ خلايا/مل لخطوط الخلايا المستمدة من الحلة (أو 1 × 10 ⁴ خلايا/مليلتر بالنسبة D3 مس الخلايا). استخدام ما يصل إلى 2 مل المتوسطة كاملة كل طبق. وأثناء زراعة وميكرويرادييشن، الحفاظ على الخلايا في غرفة الحرارة أو زراعة في 37 درجة مئوية و 5% CO ₂-
   2. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا تلقائية.
      ملاحظة: لا تستخدم أعلى تركيز للخلايا. لا سيما في حالة كثافة مستعمرات ميسكس D3، يمنع خلية عالية الكثافة تحديد الخلايا ميكرويرادياتيد محلياً بعد إيمونوستينينج-
2. تحضير كاشف بلازميد الحمض النووي وتعداء الاختيار على النحو التالي. إعداد الحل استخدام 2-3 ميكروغرام من المحدد بلازميد الحمض النووي (انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل) و 150 برنامج تلفزيوني 1 x ميليلتر. إعداد ب الحل باستخدام كاشف تعداء ميليلتر 3.5 في 150 برنامج تلفزيوني 1 × ميليلتر. التأكد من أن كل حل جيد مختلطة بعناية بيبيتينج.
   ملاحظة: نسبة مثلى لكاشف الحمض النووي وتعداء يجب تجريبيا يتحدد لكل خط الخلية والفردية بلازميد.
3. في 24 ح قبل الملاحظة التجريبية الحية عابر transfected الخلايا، الجمع بين حل أ وحل ب دون فورتيكسينج. تبني الحلول المدمجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة. بطريقة دروبويسي والبلوتينيوم تفريق هذا إكمال خليط تعداء (300 ميليلتر، كما هو موضح في النقطة 2، 2) على طبقة الخلية تنمو في الطبق مجهرية.
4. إينكوباتي الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO ₂ لح 4-6، ثم استبدال خليط تعداء مع متوسطة جديدة. زراعة الخلايا تحت ظروف قياسية.
   ملاحظة: عند استخدام ليزر 405 نانومتر، لا بريسينسيتيزي الخلايا مع أي كاشف، ولكن عند استخدام ليزر 355 نانومتر، تنفيذ بريسينسيتيزيشن الخلية مع 10 ميكرون 5-برومو-2 '-ديوكسي-أوريديني (بردو) ^{7 ، 8} . الوقت بريسينسيتيزيشن يعتمد على نوع الخلية وطول دورة الخلية. لخلايا هيلا، أضف بردو ح 16 إلى 20 قبل ميكرويرادييشن المحلية. وفي حالة ميسكس، أضف بردو ح 6 إلى 8 قبل ميكرويرادييشن-

3. التعريفي "المحلي الحمض النووي آفات" والفحص المجهري [كنفوكل]

1. وضع الطبق على مرحلة مجهر وتسجيل الموقف الخلايا المحددة على الطبق؛ إحداثيات الخلية ستكون هناك حاجة لمزيد من التحليل ( الشكل 2 ألف أ-ج)-
2. تجد transfected الخلايا في ساحة المسمى برقم أو حرف ( الشكل 2 ألف د-f، أسهم في إظهار الإعلانات تضخيم موقع الخلية في لوحات عبد اللطيف والعربية). الحصول على صورة للخلايا باستخدام مجهر الحقل مشرق واكتساب صورة الأسفار من أجل تحديد موقف كل من الخلايا وساحة المسمى ( الشكل 2A).
3. للحصول على الصور قبل التشعيع، استخدام ليزر الضوء الأبيض (ذ) (470-670 نانومتر بزيادات 1 نانومتر) متصل بالمجهر [كنفوكل] (أو الليزر متاحة أخرى متصلة أسيوطمجهر عقل)-
استخدم الإعدادات التالية في
4. : 512 × 512 بكسل، بكسل حجم 64 شمال البحر الأبيض المتوسط، 400 هرتز، ووضع ثنائي الاتجاه (المسح الضوئي في اتجاهين)، وخط متوسط مجموعة 8، تكبير 8 x إلى 12 عاشرا-
   ملاحظة: يمثل خط متوسط عدد معين من الأشعة؛ يتم تفحص السطر نفسه عدة مرات قبل المتابعة إلى السطر التالي. تكرار عمليات الفحص لجميع خطوط إنتاج الإطار النهائي للصورة-
5. المراقبة الصورة وحيازتها، استخدام هدفا نفط 63 × مع فتحه عددية من 1-4 والتتابع الحصول على صور الأسفار. القضاء عبر الحديث بين فلوروتشروميس اثنين باستخدام وضع المسح الضوئي متسلسلة من البرنامج المناسب.
   ملاحظة: جميع مجهر البرنامج يتيح تحديد وضع المسح الضوئي متسلسلة ما يسمى. المشغل يمكن تحديد ما إذا كنت تريد الحصول فلوروتشروميس ' المعلومات في وقت واحد (مثلاً، في ومضان أحمر-أخضر-أزرق)، أو كما هو مذكور هنا، على حدة (تسلسلياً)، فلوروتشرومي من فلوروتشرومي. تأخذ في الاعتبار المعلومات العامة أن الإثارة/انبعاث الحد الأقصى للتجارة والنقل هي 395/509 نانومتر والإثارة/انبعاث الحد الأقصى مشري هو 587/610 نيوتن متر (انظر فلوروتشروميس المستخدمة هنا في الشكل 2). وبناء على هذه المعلومات، حدد الإثارة المناسبة ومرشحات الانبعاثات فلوروتشروميس المطلوب. تصفية التحديد والمسح الإجراءات يجب أن يكون الأمثل لكل مجهر [كنفوكل]-
6. لتحريض آفات الحمض النووي، استخدام 64 خط المسح الضوئي الوضع، إيقاف ذ (في ' اقتناء ' الوضع)، التبديل على مصدر الأشعة فوق البنفسجية الخارجية (في " الليزر الأشعة فوق البنفسجية " زر)، تعيين المنطقة التي تهم (ROI) (في ' اقتناء ' الوضع)، وتعيين 355-نانومتر الليزر بقوة 100%، أو بدلاً من ذلك، استخدام مصدر ليزر 405 نانومتر.
   ملاحظة: عموما، يعدل قوة الليزر بالزر التكيف الليزر المناسبة في وضع اقتناء الصورة.
7. على ميكرويرادييشن المحلية، تستخدم أشعة الليزر التي تنبعث منها في الطيف فوق البنفسجية القريب. ميكرويرادييشن دوروا في النواة والتقاط الصورة، تعيين الخلفية إلى الصفر في وضع اقتناء الصور لتنظيم كثافة الليزر خارج العائد على الاستثمار؛ إذا كانت الخلية هي المشع بشكل صحيح، وسوف تختفي إشارة H2B هستون بروتينات فلورية خضراء، وعلى سبيل المثال، سيتم تعيين معلم متشيري البروتين منها لآفات الحمض النووي فورا بعد التشعيع ( الشكل 2B و 1 فيديو )-
   ملاحظة: إصابة الحمض النووي المستحث في العائد على الاستثمار من أحد كما يظهر المقطع [كنفوكل] في الإسقاط (3D) ثلاثي الأبعاد (انظر الاستدارة ثلاثية الأبعاد و x-y، x-z، إسقاطات y-z في الشكل 2 و 2 فيديو). للحصول على وصف كامل المعايير الفنية لأشعة الليزر 355-شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط-405، انظر Stixová et al. ⁷
8. قد تم المشع "بعد دوروا" وإيقاف مصدر الأشعة فوق البنفسجية الخارجية وإيقاف العائد على الاستثمار، والتبديل على ذ، تغيير خط المسح الضوئي إلى 8 والعثور على خلية أخرى التشعيع. لتحديد العائد على الاستثمار، استخدم الزر المطبقة في البرنامج ' وضع اقتناء الصور s-
   ملاحظة: قد مشري-منها ذروتها أقصى لتراكم في الآفات الحمض النووي بين 2 و 20 دقيقة ( الشكل 2). للتحقق من النتيجة على مستويات البروتين خارجية، المضي قدما في الفلورة تلطيخ فور ميكرويرادييشن المحلية. حدد الفاصل الزمني تشعيع وفقا للمصلحة.
9. التحقق من أن يمكن الكشف عن تراكم البروتينات الخارجية في معظم الخلايا ميكرويرادياتيد. للتحقق من هذا، استخدام المعايير في الخطوات التالية.
   1. الاختيار أنه لا يوجد أي overexpression خارجية من البروتين في خلايا transfected عابر. كحل ممكن، اختر الخلايا مع تعبير ضعيف فقط من البروتينات الفلورية (مثلاً، مشري-منها أو مشري-53BP1)-
   2. تقييم الضيائية للتعرض ذ المستخدمة للحصول على الصور-
      ملاحظة: لاختبار الضيائية، فضح transfected الخلايا ميكرويرادييشن الليزر طويلة والتحقق من أن تشرع الخلايا للانقسام كما هو موضح في الشكل 3 ألف -ب. كحل ممكن، تقليل وقت المسح وعدد الشرائح [كنفوكل] كل خلية، وتحسين المسح ثلاثي الأبعاد بالتحديد الخطوة المحورية الأمثل (0.3 ميكرومتر ينصح) وتعيين الليزر ' الطاقة s في حدها الأدنى. وبدلاً من ذلك، يمكن القضاء الضيائية باستخدام ترولوكس (حمض 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic، والنظير للذوبان في الماء فيتامين (ه)) التي حلت في الأجلين المتوسط وزراعة. للتجارب المتعلقة بالحمض النووي-الضرر، لا ينصح باستخدام ترولوكس سبب لها تأثير وقائي ضد الأشعة فوق البنفسجية.
   3. في حالة الإشعاع مع ليزر 355 نانومتر، تحقق من إدراج كافية لاستخدام جسم مضاد بردو كشف مناسبة من إدماج بردو بردو كيت (انظر الجدول للمواد). حيث أدمجت بردو في الحمض النووي خلال المرحلة S من دورة الخلية، يجب أن يمضي معظم الخلايا من خلال المرحلة S أثناء بريسينسيتيزيشن. كحل ممكن، النظر في طول دورة الخلية، ونوع من الخلايا المحددة.
   4. تحليل قد عما إذا كان إصلاح الحمض النووي البروتينات ذات الاهتمام قدرة على التعرف على الآفات الدنا في دورة الخلية المحددة phase(s). حل ممكن: للتحقق من أن تجنيد بروتينات المحددة لآفات الحمض النووي يقتصر على مراحل دورة الخلية المحددة (G1/S/G2)، استخدام خلايا هيلا-فوكسي. التعبير عن هذه الخلايا Cdt1 طلب تقديم العروض في G1 والمراحل المبكرة من S وجيمينين معلم بروتينات فلورية خضراء في S/G2-م دورة الخلية مراحل ²² ( الشكل 1).
   5. لتجنب المبرمج، موت الخلية، حدد مصدر ليزر مناسبة والليزر السلطة الإعداد ²³. نضع في اعتبارنا أن المشع الخلايا أن تشرع في الانقسام ( الشكل 3 ألف -ب، 3 فيديو)-
      ملاحظة: يمكن اكتشاف الخلايا غير المرغوب فيها بالخامس Annexin الإيجابية، كاسباسي 3، أو أمين ب الانقسام. على المستوى المورفولوجي، الخلية المفرزة وتشكيل الهيئات apoptotic ستكون مرئية.

4. Staining الفلورة

1. شطف طبقة الخلايا (المتزايدة في الأطباق المجهر) بإيجاز مع 1 × برنامج تلفزيوني وبعد الشطف، إصلاح الخلايا باستخدام 4% فورمالدهايد لمدة 10 دقيقة (لخطوط الخلايا المستمدة من الحلة) أو 20 دقيقة (لخلايا D3 ES) في درجة حرارة الغرفة. شطف الطبق مع 1 × PBS.
   تنبيه: فورمالدهايد يتسبب في أضرار خطيرة في عينة وقد يسبب رد فعل حساسية جلد، وهي أيضا مادة مسرطنة محتملة؛ وبالتالي، ينبغي إجراء جميع الخطوات التجريبية مع والفورمالديهايد في هود النازع-
   ملاحظة: لتجنب تبيض لا لزوم لها من إشارات الأسفار، تخزين الطبق في غرفة مظلمة أثناء فترة الحضانة اللازمة لتلطيخ الفلورة.
2. بيرميبيليزي الخلايا مع 0.1% X-100 تريتون حله في ح ₂ س ل 8 دقيقة ومن ثم احتضان الخلايا لمدة 12 دقيقة مع PBS × 1 تحتوي على صابونين 0.1% و 0.1% X-100 تريتون. بعد الحضانة، تغسل الخلايا في 1 × برنامج تلفزيوني مرتين عن 15 دقيقة
3. الخلايا إينكوباتي مع جيش صرب البوسنة 1% في 1 × برنامج تلفزيوني لمدة 60 دقيقة لمنع الربط غير محدد من الأجسام المضادة المحددة. غسل الخلايا في 1 × برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة بعد الاحتضان.
جسم
4. ديلوتى الأولية بنسبة 1: 100 (أو 1: 200) (هذه الخطوة يجب أن تكون سبتيميزيد للأجسام المضادة الفردية) في جيش صرب البوسنة 1% في 1 × برنامج تلفزيوني، استخدام 25 ميليلتر لهذا الحل لكل طبق، وتغطي الخلايا مع ساترة. احتضان الخلايا مع الحل الذي يحتوي على جسم الأولية في دائرة هوميديفيد بين عشية وضحاها في 4 ° C.
5. اليوم التالي، يغسل خلايا في 1 × برنامج تلفزيوني مرتين للحد الأدنى 5
6. تضعف جسم الثانوي بنسبة 1: 100 (أو بدلاً من ذلك 1: 200) في جيش صرب البوسنة 1% في برنامج تلفزيوني، 1 × 100 ميليلتر لهذا الحل باستخدام كل طبق، وتغطي الخلايا مع ساترة. احتضان الخلايا مع الحل الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية لمدة 60 دقيقة. بعد الحضانة، تغسل الخلايا في 1 × برنامج تلفزيوني ثلاث مرات للحد الأدنى 5
7. جبل ساترة مع قطره متوسطة المتصاعدة، وختم ساترة مع طلاء الأظافر أو الغراء لمنع الحركة والتجفيف خلال المراقبة المجهرية. تخزين الطبق في الظلام في 4 ° C.

5. الأسفار مجهرية عمر الصورة (فليم)

1. ابدأ فليم البرمجيات. مفتوحة " "جناح التطبيق" " من البرنامج وقم بالتبديل إلى " فليم " الوضع. تأكد من أن يعمل ذ في وضع نابض.
   ملاحظة: يجب على المشغل التبديل زر جهاز للوصول إلى وضع النبض.
2. ضع الصحن تحتوي على خلايا الملون (الملون في القسم 4) في مرحلة مجهر في نفس اتجاه كأثناء ميكرويرادييشن المحلية، والعثور على الخلايا المشع وفقا للشبكات في طبق بتري. إجراء الحصول على الصور بالمجهر [كنفوكل]-
   ملاحظة: استخدم الإعدادات التالية: 1024 × 1024 بكسل، 400 هرتز، وضع ثنائية الاتجاه، خطوط 16، تكبير 8 x إلى 12 عاشرا-
3. قبل البدء بالقياس فليم، إجراء اختبار أولى لإظهار سجل في الوقت الحقيقي لتحلل أسي، بالنقر فوق " "فليم الإعداد" " و " اقتناء " الضغط على " اختبار "تشغيل فليم" ". تحسين المعلمات فليم للعينة بتقييم البارامترات الرئيسية اثنين كما يلي.
   1. تحسين معدل تكرار ذ مع الطول الموجي الإثارة ضبطها لعمر العينة (انظر الملاحظة أدناه). في برنامج مجهر [كنفوكل]، ضبط كثافة الليزر مع الزر المناسب، وهو ما يسمى عموما " الليزر إعداد ضبط " في ' التقاط صور ' القائمة. ثم، حساب منحنى الاضمحلال (أو الرسم البياني عرض جميع التهم فوتون) باستخدام البرمجيات فليم (انظر الشكل 4A -ب)-
      ملاحظة: استخدم في ذ في وضع النبض للإثارة. يجب أن تكون مجهزة البرامج مع منتقي نبض ذ، الذي يتيح تحديد معدل تكرار (80 أو 40 أو 20 أو 10 ميجاهرتز). الطول الموجي الإثارة في حالة الجهة المانحة الأسفار، التجارة والنقل، هو 488 نانومتر. يتم تسجيل منحنى الاضمحلال استخدام البرمجيات فليم مساحة العمل. المعلمة (τ _د، τ _دا) يبين أوقات تحلل أسي (مثلاً، فلوروتشرومي مدى الحياة)؛ المعلمة (A) يمثل السعة تسوس فلوروتشرومي (انظر أمثلة البيانات فليم p53 بروتينات فلورية خضراء معلم ومعلم مشري 53BP1 في الشكل 4A -ب)-
   2. تحقق معدل تكرار العد باستخدام أداة اقتناء البرمجيات (وضع معدل التكرار حدد). حدد بكسل ألمع في العينة؛ يجب أن يكون منحنى لالمع بكسل أقل من 10% كثافة fluorescence الشاملة-
4. انقر فوق " قياس " واضغط على " "تشغيل فليم" ".

6. عمر المانحين باستخدام البرنامج النصي فليم وكفاءة "حساب تآكل"

1. بدء تشغيل البرنامج فليم الحنق وفتح ' المانحة ' مساحة العمل.
2. حدد " التحليل "/" التصوير " علامة التبويب في القائمة، وبدء تشغيل البرنامج النصي فليم بواسطة النقر فوق " بدء ". لإعدادات فليم الحنق الأمثل، استخدام شركاء البروتين التفاعل المعروفة.
   ملاحظة: كفاءة فليم الحنق للتفاعل المعروفة شركاء التجارة والنقل-p53 وكان متشيري-53BP1 (34.1 ± 2.3) ٪ ( الشكل 4).
3. استخدام المانحة الانبعاثات القناة (القناة 1 أو 2) والصحافة فقط " "حساب سريع فليم" "-
   ملاحظة: الصورة والرسم البياني كلاهما ستستكمل.
4. في الحنق-فليم البرمجيات، تعيين مقياس كثافة (0-تعول 4000) ومقياس مدى الحياة (0-5 ns) يدوياً في البرنامج. مع هذا النهج، تصور خلية الفائدة وتعيين قياس الحنق-فليم.
   ملاحظة: هذا الإعداد يلغي الاختلافات في كثافة الأسفار بين خلايا فردية في السكان الخلية.
5. في شكل تسوس، اختيار النموذج المناسب.
   ملاحظة: نحن ننصح ريكونفولوتيون ن أسي واختيار نموذج المعلمة " ن ". قد تناسب أمثل المعايير التالية: تركيب منحنى تراكبات منحنى الاضمحلال جيدا و χ ²--وقيمة تساوي 1 ( الشكل 4B).
6. حدد " عتبة "/" "عتبة استخدام" " وتعيين العتبة إلى 75. بدء تشغيل " الأولى تناسب ".
   ملاحظة: يحسب البرنامج SPT64 عمر متوسط المانحين في غياب الحنق (" عمر متوسط مرجح السعة "، τ _Av.Amp)

7. بكى الكفاءة باستخدام "البرنامج النصي" الحنق فليم

1. حدد مساحة عمل الجهات المانحة/يقبلون ثم قم بفتح " التحليل " | " التصوير " | " "تآكل عمر" الصورة ".
2. حدد فقط من الجهة المانحة كقناة نشطة وضبط Binning بكسل اعتماداً على العدد فوتون/بكسل. ثم قم بتشغيل وضع برنامج يسمى " "حساب فاستفليم" ". إذا كان منخفضا فوتون العدد البيكسل في الصورة، زيادة Binning بكسل إلى 4 نقاط.
3. تعيين الكثافة إلى 0-200 التهم وعمر إلى 0-5 م.
4. تنشيط " "عتبة استخدام" " وأدخل عتبة ال 75-
5. تعيين النموذج المناسب " "المانحة" المتعددة-[ااكسب] "، قم بإدخال معلمة نموذج " ن "، أدخل τ _Av.Amp (الخطوة 6.6) τ _د، وتنشيط " "تناسب الأولى" ".
6. تعيين المعلمات بكجر _ديسمبر، تحول _{إطار الموارد المتكامل}، وبكجر _{المتكامل} إلى قيم ثابتة عن طريق إزالة العلامة.
   ملاحظة: تعيين أغلبية المعلمات تظل ثابتة إلى أقصى حد ممكن. وهذا النهج يقلل من تقلبات الإحصائية. وفي هذه الحالة، لا تضغط " الأولى تناسب " مرة أخرى. اتبع توصيفات المعلمات المذكورة: المتكامل = "أداة دالة الاستجابة"، بكجرديك = الخلفية من احتواء الأسى، شيفتيرف = التحول المتكامل من أسي ريكونفولوتيون صالح، بكجريرف = خلفية إطار الموارد المتكامل من أسي ريكونفولوتيون صالح. يتم حساب كافة المعلمات الثلاث ويمكن أن تكون ثابتة باستخدام البرمجيات لمزيد من التحليل.
7. الصحافة " FRETŔ حساب الحنق الصورة (المرسومة في منطقة الصورة فليم) وتحسب الحنق كفاءة المدرج التكراري، ويتم رسم مدرج تكراري مسافة الحنق ( الشكل 4). عند الانتهاء من تحليل الصورة، اضغط " "نتيجة حفظ" ".
   ملاحظة: أثناء تجارب الحنق، من الضروري أن تنظر أن البروتينات الفلورية يحمل عكسها الانتقالات بين فلوري (مشرق) والدول غير الفلورية (الظلام). تسمى هذه الخاصية " تطرف "، وكفاءة الحنق يتأثر بهذه الظاهرة (تفسيراً لهذا الغرض قدم فوجيرل et al. ²⁴)-

8. تحليل فراب

1. مكان ديسح في مرحلة مجهر، تجد transfected الخلايا معربا عن البروتين المعلمة فلوريسسينتلي للفائدة، وإجراء الحصول على الصور باستخدام مجهر الحقل مشرق مع مصباح المجهر القياسية (انظر الشكل 2Aa-ب) و طرق الفحص المجهري الأسفار.
   1. للحصول على الصور، استخدام الليزر الضوء الأبيض (ذ) متصل بالمجهر [كنفوكل] (أو ليزر للاختيار، وفقا فلوروتشرومي المحدد). استخدم الإعدادات التالية: 512 × 512 بكسل، 1000 هرتز، ثنائي الاتجاه وضع خط متوسط 1، تكبير 8 x إلى 12 عاشرا-
   2. الحصول على الصور بريبليتشينج على الأقل 15 (في السلطة الليزر ~ 10 ٪) وتعريف منطقة الاهتمام (ROI) في القائمة اكتساب صورة.
2. للتجارب فوتوبليتشينج، واستخدام ليزر أرجون (488 نانومتر). تطبيق الإعدادات التالية: تكبير إطار القرار 512 × 512 بكسل، 1000 هرتز، وضع ثنائية الاتجاه، 8 x إلى 10 العاشر-
   ملاحظة: يمكن متحمس فلوروتشروميس بما في ذلك التجارة والنقل، مشري، وطلب تقديم العروض بليزر أرجون العمل في 488 نانومتر أو 514 nm-
3. استخدام وضع البرمجيات فراب المجهر للاختيار. أثناء فوتوبليتشينج، مجموعة ليزر الأرجون ' s السلطة إلى الحد الأقصى باستخدام زر التعديل الليزر. إجراء الحصول على الصور في فترات s 0.256، في قوة الليزر 10%-
   ملاحظة: بوستبليتشينج الخطوات، استخدم وضع اقتناء الصورة القياسية المجهر [كنفوكل] الاختيار.
   1. Fluorescence رصد الانتعاش مرة بعد فوتوبليتشينج (تصل إلى 45-50 ثانية بعد إجراء التبييض).
      ملاحظة: كما هو مبين في الشكل 4، وقت الاسترداد بعد فوتوبليتشينج 53BP1 معلم مشري متميزة في عفوية الحمض النووي آفات والبؤر التي يسببها الإشعاعات فوق البنفسجية. متشيري-53BP1 في الآفات يوفا تعافي سريعاً بالمقارنة مع تراكمات متشيري-53BP1 في حدوث تلقائياً إصلاح الحمض النووي البؤر؛ انظر الشكل 4 وفولتانكوفا et al. ²⁵
4. تصدير البيانات من البرنامج المجهر (أو البرنامج المفضل) إلى جدول بيانات وإجراء تحليل إحصائي.

النتائج

باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] متقدمة، لاحظنا تراكم البروتينات 53BP1 ومنها مشري مشري معلم في الآفات الحمض النووي. أجريت التحاليل ميكرويرادييشن المحلي للخلايا الحية. أن ندرك أنماط التوزيع النووي من البروتينات ذات الصلة بإصلاح الحمض النووي في مراحل دورة الخلية الفردية، اس...

Discussion

تقنيات الفحص المجهري تمثل الأدوات الأساسية في مختبرات البحوث. هنا، وصفاً موجزاً للأساليب المستخدمة لدراسة البروتين التوظيف وحركية في الآفات الحمض النووي. لاحظنا خصوصا لدينا الخبرة التجريبية في ميدان ميكرويرادييشن المحلية من الخلايا الحية، ونحن نناقش دراسة حركية البروتين بالتفاعل فراب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell cultivation
HeLa	ATCC	CCL-2TM
ES-D3 [D3]	ATCC	CRL-11632TM
HeLa -Fucci cells			http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEM	PAN-Biotech	P03-0710
DMEM high glucose	Sigma-Aldrich	D6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone	SV30180.03
ES Cell FBS	Gibco	16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Gibco	11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor)	Merck Millipore	ESG1107
MTG (1-Thioglycerol)	Sigma-Aldrich	M6145-25ML
Penicillin-Streptomycin Solution	Biosera	XC-A4122/100
Trypsin - EDTA	Biosera	XC-T1717/100	dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishes	Sigma-Aldrich	P7866	cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500	Ibidi GmbH	81166	microscopic dish
0.2% Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890-100G	dilute in destille water and autoclaved
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell transfection
GFP-p53 plasmid	Addgene	12091
mCherry-PCNA plasmid			generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmid	Addgene	19835
Metafecetene	Biontex Laboratories GmbH	T020–2.0
10 × PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9625	for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridine	Sigma-Aldrich	11296736001
Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5	Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8	Leica Microsystems
White-light laser	Leica Microsystems
355-nm laser	Coherent Inc.		laser power 80 mW
405-nm laser	Leica Microsystems		laser power 50 mW
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunofluorescence staining
Coverslip	VWR International Ltd	631-1580
4% paraformaldehyde	Affymetrix	19943 1 LT
Triton X100	MP Biomedicals	2194854
Saponin from quillaja bark	Sigma-Aldrich	S4521
BSA	Sigma-Aldrich	A2153
53BP1	Abcam	ab21083	primary antibody
AlexaFluore 647	Thermo Fisher Scientific	A27040	secondary antibody
Vectashield	Vector Laboratories Ltd	H-1000	mounting medium