JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نحن تصف طريقة مبتكرة لتحديد مستقبلات تكميلية 1 (CR1) طول الأشكال لاستخدامها في العديد من التطبيقات، ولا سيما تقييم قابلية الإصابة بأمراض مثل مرض الزهايمر (أد). هذه الطريقة يمكن أن تكون مفيدة لفهم أفضل لدور الأشكال الإسوية CR1 في التسبب في أد.

Abstract

يتم التعبير عن مستقبلات تكملة 1 (CR1)، بروتين سكري عبر الغشاء الذي يلعب دورا رئيسيا في الجهاز المناعي الفطري، على العديد من أنواع الخلايا، ولكن خصوصا على خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). كمستقبل للمكونات التكميلية C3b و C4b، ينظم CR1 تفعيل السلسلة التكميلية ويعزز البلعمة من المجمعات المناعية والحطام الخلوي، وكذلك الببتيد اميلويد بيتا (Aβ) في مرض الزهايمر (أد). وقد أكدت العديد من الدراسات تعدد الأشكال النكليوتيدات واحد المرتبطة أد (سنبس)، فضلا عن الاختلاف رقم نسخة (نف) في الجين CR1 . هنا، نحن تصف طريقة مبتكرة لتحديد طول تعدد الأشكال لمستقبلات CR1. وتشمل المستقبلات ثلاثة مجالات تسمى تكرار طويل متماثل (لر) -LHR-A و لر-C و لهر-D و مجال n، لر-B، حيث n هو عدد صحيح بين 0 و 3. باستخدام زوج واحد من الاشعال محددة، وتستخدم المادة الوراثية لتضخيم الجزء الأول من المجال لر-B (ثe أمبليكون ب) وشريحة ثانية من المجال لر-C (أمبليكون ثابت). البديل أمبليكون B والاختلافات عرض أمبليكون ثابتة في خمسة النيوكليوتيدات خارج مناطق التهجين من الاشعال المذكورة. يتم استخلاص عدد من أمبليكونس المتغير B و أمبليكونس ثابتة باستخدام أداة الكمية (منحنيات ذوبان عالية (هرم))، ونسبة أمبليكون B البديل إلى أمبليكون ثابت يختلف وفقا ل تعدد الأشكال طول CR1. توفر هذه الطريقة العديد من المزايا على طريقة النمط الظاهري الكنسي، لأنها لا تتطلب مواد جديدة وأرخص وأسرع، وبالتالي تنطبق على أكبر عدد من السكان. وبالتالي، فإن استخدام هذه الطريقة يجب أن تكون مفيدة لفهم أفضل لدور الأشكال الإسوية CR1 في التسبب في أمراض مثل أد.

Introduction

أد، وهو السبب الأكثر شيوعا من الخرف، ويؤثر على أكثر من 30 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، وهو مشكلة صحية عامة رئيسية 1 . سريريا، يتميز أد الاضطرابات العصبية مما يؤدي إلى فقدان التدريجي للاستقلالية 2 . يتميز أد من قبل اثنين من العلامات العصبية المرضية، وهي ودائع اميلويد خارج الخلوية والتشابك الخلايا العصبية داخل الخلايا 3 .

تقليديا، وفقا لعمر بداية المرض، يصنف أد إلى شكلين. الأول هو بداية في وقت مبكر (إيواد)، حيث بداية غالبا ما يحدث قبل سن 65؛ وهذا النموذج يمثل أقل من 5٪ من الحالات أد. وهو نادر، وراثي جسمي المهيمن شكل من أد، مما يؤدي إلى طفرات اختراق كامل إما في بروتين السلائف اميلويد ( أب) 4 ، بريسينيلين 1 ( PSEN1 ) 5 ، أو بريسينيلين 2 ( PSEN2 )> 6 الجينات. ثانيا، الشكل الأكثر شيوعا من المرض (> 90٪ من حالات أد) يسمى "متفرقة" في وقت متأخر ظهور (لواد) وغالبا ما يحدث في الأفراد الذين تتراوح أعمارهم بين 65 سنة أو أكثر. وهو ينتج عن عوامل خطر وراثية وبيئية متعددة 7 . في لواد، أليل 4 من بروتين أبوليبوبروتين E ( أبو ) هو عامل الخطر الجيني الرئيسي 8 ، 9 . وعلاوة على ذلك، تم تحديد أكثر من 20 موقع الجينات من خلال دراسات الارتباط على نطاق الجينوم (غواس) على أنها مرتبطة مع خطر م، واحدة منها كونها المكون التكميلي (3B / 4B) مستقبلات 1 ( CR1 ) الجين 10 ، وتقع على كروموسوم 1q32 في مجموعة من البروتينات المرتبطة بالمكملات. يرمز الجين CR1 البروتينات المستقبلة من النوع 1 (CR1)، وهو مكون من منظمي النشاط التكميلي.

CR1 (C3b / C4b مستقبلات، CD35)، بروتين سكري غشائي من أبروكسيماتإلي 200 كيلو دالتون 11 ، ويرتبط C3b، C4b، C3bi، C1q، مانان ملزم ليتين (مبل)، والبكتيريا تكملة فيكولين 12 . الوظيفة البيولوجية ل CR1 تختلف مع أنواع الخلايا التي يتم التعبير عنها. في البشر، 90٪ من مجموع تعميم CR1 وجدت في خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) 13 . على سطح كرات الدم الحمراء، CR1 يربط C3b- أو C4b-أوبسونزد الكائنات الحية الدقيقة أو المجمعات المناعية، وتسهيل إزالتها من التداول. مجمعات ملزمة ل CR1 يتم نقلها في الواقع إلى البالعات عندما كرات الدم الحمراء تذهب من خلال الكبد والطحال 11 ، 14 . من خلال الحد من ترسب C3B و C4b، CR1 قد منع تكملة المفرط تفعيل. لذلك، يعتبر التعبير عن CR1 على كرات الدم الحمراء عنصرا أساسيا في حماية الأنسجة، مثل الجهاز العصبي الدماغي، ضد ترسب معقد المناعي والأمراض الناتجة. ومن المعروف أيضا CR1 على كرات الدم الحمراءتلعب دورا هاما في العدوى المسببة للأمراض 15 ، 16 . وبالإضافة إلى ذلك، CR1، باعتبارها لاعبا رئيسيا في الحصانة الفطرية، وتشارك في تنظيم شلال تكملة وفي نقل وإزالة المجمعات المناعية. CR1 يمارس هذا النشاط عن طريق ربط شظايا C3b و C4b وتفكيك التحولات الكلاسيكية والبديلة (تفكك C2a من مجمع C4b2a والتفكك من C3b من مجمع C3bBb). وباعتبارها عامل مساعد لعامل بروتين البلازما سيرين I (في)، فإن CR1 يثبط المسارات التكميلية الكلاسيكية والبديلة عن طريق زيادة انشقاق C4b و C3b بواسطة في، وهي خاصية تعرف باسم النشاط المساعد (كا)، ومن خلال تثبيط حلقة التضخيم C3 ، بدوره منع مزيد من تفعيل تكملة. يقدم روجرز وزملاؤه أدلة على أن الببتيد A can يمكن ربط وتفعيل المسار التكميلي في غياب الأجسام المضادة 17 وتشير إلى أن الببتيد A is هو كلمستمدة من الدورة الدموية عن طريق التمسك بالتماسك الذي يعتمد على CR1 المعبر عنه في كرات الدم الحمراء 18 .

ويعرض CR1 ثلاثة أنواع من تعدد الأشكال: الأشكال الهيكلية أو الطولية، تعدد الأشكال الكثافة، ويعتمد على تعدد أشكال الدم 11 ، 19 . ويرتبط تعدد الأشكال الهيكلي إلى الاختلاف في عدد تكرار متناظرة طويلة (لرس)، وبالتالي يحدد أربعة الأشكال الإسوية. في الواقع، فإن المجال خارج الخلية من البروتين CR1 يتكون من سلسلة من وحدات تكرار، ودعا يكرر توافق في الآراء قصيرة (سكر) أو يكمل يكرر السيطرة (كبس). وقد أثبتت هذه اللجان من تكملة حمض ديوكسيريبونوكليك (كدنا) CR1. يتم ترتيب لجان مراجعة الدستور في مجموعات جنبا إلى جنب من سبعة، والمعروفة باسم لرس. ويتم ترتيب CR1 في أربع محطات لهر، تسمى LR- A، -B، -C، و D-ناشئة عن ازدواجية وحدة سبع سر 19 ، 20 ،21-

وبترتيب متزايد من التردد، فإن هذه الأشكال الإسوية CR1 التي يحددها لطخة غربية (وب) هي CR1 * 1 (A / F) (الهجرة السريعة على هلام الكهربائي)، CR1 * 2 (B / S) (الهجرة البطيئة على الكهربائي هلام)، CR1 * 3 (C / F`)، و CR1 * 4 (D). ويتألف الشكلان السريان الأكثر شيوعا، وهما CR1 * 1 (A / F) و CR1 * 2 (B / S) من أربعة وخمس لهر، على التوالي، في حين أن CR1 * 3 (C / F`) و CR1 * 4 (D ) تتكون من 3 و 6 لرس، على التوالي. يحتوي الشكل الإسفري الأكثر شيوعا (CR1 * 1)، المكون من 30 سكر، على ثلاثة مواقع ملزم C4b (سكرز 1-3، 8-10، 15-17) ومواقع ملزمتين C3b (سكر 8-10 و 17-17) ، في حين أن سرس 22-28 ربط C1q، فيكولينز، و مبل 12 ، 20 ، 21 ، 22 ، 23 ، 24 ، 25 . وهكذا، CR1 * 2 يحتوي على واحد إضافي C3b / C4b موقع ملزم مقارنةd إلى CR1 * 1. الشكل 1 يوضح الهياكل، التسميات، والأوزان الجزيئية من الأشكال الإسوية الأربعة المختلفة من CR1.

كثافة تعدد الأشكال يتوافق مع النمط الظاهري مستقرة التي تمثل مستوى التعبير التأسيسي لل CR1 على كرات الدم الحمراء. في المواضيع القوقازية الصحية، وقد تبين أن عدد جزيئات CR1 لكل رك يمكن أن تختلف بما يصل إلى عامل من عشرة (يتراوح بين 150 إلى 1200 جزيء في الخلية) 26 . كرات الدم الحمراء من النمط الظاهري هيلجيسون لها كثافة CR1 منخفضة جدا، والتي تبين أن أقل من 150 جزيء لكل خلية 27 ، 28 . وترتبط كثافة CR1 على كرات الدم الحمراء وراثيا مع نظام بيليليك كودومينانت كودومينانت على الجين CR1 ، ترتبط مع هين دي تقييد تعدد الأشكال شظية طول (رفلب) 29 . طفرة نقطة واحدة في إنترون 27 من الجين CR1، بين إكسونس ترميز الثانيةسر في لر-D، يؤدي إلى توليد موقع هين دي متعدد الأشكال في هذه المنطقة 30 . شظايا الجينوم هين دي من 7.4 و 6.9 كيلو دالتون تحديد الأليلات المرتبطة عالية (H أليل) أو منخفضة (L أليل) CR1 كثافة على كرات الدم الحمراء، على التوالي. ومع ذلك، تم العثور على عدم وجود ارتباط بين كثافة CR1 على كرات الدم الحمراء والأشكال هين dIII في بعض السكان في غرب أفريقيا 31، 32. الآلية التي تربط تنظيم كثافة CR1 إلى تشفير متعدد الأشكال هين دي لا تزال غير معروفة. ومن بين تعدد الأشكال المتعددة، تم الإبلاغ عن ارتباط Q981H في SCR16 و P1786R في SCR28 بكثافة CR1 على كرات الدم الحمراء 30 و 33 .

إن تعدد الأشكال (كن)، وفقا للتسمية الدولية، هو نظام فصيلة الدم ال 22 التي سيتم فهرستها من قبل الجمعية الدولية لنقل الدم. أنه يحتوي على 9 مستضدات محددة(KN1 / KN2) و KN3 / KN6 و KN4 / KN7، فضلا عن 3 مستضدات معزولة، KN5، KN8، KN9. مستضدات KN1، KN3، KN4، KN5 هي مستضدات عالية التردد من نظام كن ( أي، أعرب في أكثر من 99٪ من عامة السكان). ومع ذلك، لا يزال دور هذا تعدد الأشكال في أد يحدد 13 .

تم تصميم البروتوكول الموصوف في هذا العمل لتحديد الأنماط الجينية متعددة الأشكال الطولية المتورطة في قابلية الإصابة بأمراض عديدة، مثل أد، الذئبة الحمامية الجهازية، والملاريا. طريقة لدينا لتحديد CR1 طول تعدد الأشكال يستفيد من عدد من لسر-بس تضم الأشكال الإسوية CR1 والتفاوتات التسلسل بين لار-B و لر-C ( الشكل 2 ).

Protocol

تم استعراض بروتوكول جمع الدم البشري والتعامل معه واعتماده من قبل لجنة الأخلاقيات الإقليمية (كبب إست إي)، ورقم البروتوكول هو 2011-A00594-37.

ملاحظة: يصف البروتوكول التالي التعامل مع الدم البشري. يرجى اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية أثناء التخلص من المواد البيولوجية. يجب ارتداء معدات السلامة المخبرية، مثل معاطف المختبر والقفازات. يتم عرض مخطط تدفق يصف البروتوكول في الشكل 3 .

1. الدم والجسم السوائل استخراج الحمض النووي

  1. الماصة 20 ميكرولتر من بروتين K (15 ميكروغرام / ميكرولتر) في الجزء السفلي من أنبوب 1.5 مل.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب 1.5 مل. استخدام ما يصل إلى 200 ميكرولتر من الدم كله، والبلازما، والمصل، ومعطف منتفخ، أو سوائل الجسم، أو ما يصل إلى 5 × 10 6 الخلايا الليمفاوية في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة تحلل للعينة. مزيج بواسطة نبض فورتيكسينغ لمدة 15 ثانية.
  4. احتضان عند 56 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في حمام مائي.
  5. طرد مركزي لفترة وجيزة أنبوب 1.5 مل لإزالة قطرات من داخل الغطاء.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول (96-100٪) للعينة وتخلط مرة أخرى بواسطة نبض فورتيكسينغ لمدة 15 ثانية. بعد الخلط، الطرد المركزي لفترة وجيزة أنبوب 1.5 مل لإزالة قطرات من داخل الغطاء.
  7. تطبيق بعناية الخليط من الخطوة 1.6 إلى عمود الغشاء (في أنبوب جمع 2 مل). دون تبليل الحافة، إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 1 دقيقة. وضع عمود الغشاء في أنبوب جمع نظيفة 2 مل وتجاهل أنبوب يحتوي على الترشيح.
  8. فتح بعناية عمود الغشاء وإضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة 1 دون ترطيب الحافة. إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 1 دقيقة. وضع عمود الغشاء في نظيفة جمع أنبوب 2 مل وتجاهل أنبوب يحتوي على الترشيح.
  9. فتح بعناية عمود الغشاء وإضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة 2 دون ترطيب ثe ريم. إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة (20،000 x ج) لمدة 3 دقائق.
  10. وضع عمود الغشاء في أنبوب جمع 2 مل جديد وتجاهل أنبوب جمع مع الترشيح. أجهزة الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  11. وضع عمود الغشاء في أنبوب نظيفة 1.5 مل وتجاهل أنبوب جمع تحتوي على الترشيح.
  12. فتح بعناية عمود الغشاء وإضافة 200 ميكرولتر من الماء المقطر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ثم الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  13. المضي قدما في تحديد خطوة تركيز الحمض النووي أو تجميد عينات الحمض النووي في -20 درجة مئوية

2. تحديد تركيز الحمض النووي

ملاحظة: انظر الشكل 4 .

  1. اضغط 1 لتحديد وضع الحمض النووي على مقياس الطيف الضوئي. حدد طول مسار 5 مم باستخدام السهمين الأيمن والأيسر. حدد عامل التخفيف من 1 باستخدام الأسهم اليسار واليمين.
  2. حدد الوحدة (ميكروغرام / مل) باستخدام ثه السهام اليسرى واليمنى. حدد عامل 50 باستخدام السهمين الأيمن والأيسر. اضغط على موافق .
  3. الماصة 10 ميكرولتر من الماء المقطر في كوفيت. وضع كوفيت في الطيفي. اضغط على الزر أوا / 100٪ T.
  4. ماصة 10 ميكرولتر من عينة الحمض النووي (1/4 التخفيف في الماء المقطر) في كوفيت. وضع كوفيت في الطيفي. اضغط على الزر الأخضر (قراءة / بدء). لاحظ التركيز.
  5. تجميد عينة الحمض النووي في -20 درجة مئوية.

3. بروتوكول هرم-ير

  1. ذوبان الجليد عينات الحمض النووي. تمييع عينات الحمض النووي في أنابيب 1.5 مل مع الماء لضبطها لتركيز 10 نانوغرام / ميكرولتر
    ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الكلي للحمض النووي المخفف بين 2 ميكرولتر و 10 ميكرولتر.
  2. ذوبان الجليد الحلول التمهيدي. تمييع حلول التمهيدي في أنابيب 1.5 مل مع الماء لضبطها إلى نفس التركيز من 6 ميكرومتر.
    ملاحظة: يتم توفير تسلسل التمهيدي وظروف التفاعل في Tقادرة 1.

figure-protocol-4907
الجدول 1: الاشعال والمعلمات المستخدمة في تحليل ذوبان عالية الدقة.

  1. ذوبان الجليد و هرم-ير عدة حلول و مزيج بعناية بواسطة فورتيكسينغ لضمان استرداد جميع المحتويات. تدور لفترة وجيزة ثلاث قارورة تحتوي على خليط الأنزيمية مع دنا صبغ ملزم، مغكل 2 ، والماء في ميكروسنتريفوج قبل فتحها. تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  2. في أنبوب 1.5 مل في درجة حرارة الغرفة، وإعداد مزيج ير ل 20 رد فعل ميكرولتر واحد عن طريق إضافة العناصر التالية في الترتيب المدرجة أدناه:
    1. 10 ميكرولتر من خليط الأنزيمية مع دنا صبغ ملزم.
    2. 2 ميكرولتر من 25 ملي مغكل 2 ؛
    3. 1 ميكرولتر من التمهيدي 1، 6 ميكرومتر (التركيز النهائي: 300 نانومتر).
    4. 1 ميكرولتر من التمهيدي 2، 6 ميكرومتر (التركيز النهائي: 300نانومتر). و
    5. 5 ميكرولتر من الماء.
      ملاحظة: لإعداد مزيج ير لأكثر من رد فعل واحد، ضرب وحدات التخزين أعلاه من قبل عدد من ردود الفعل التي سيتم تشغيلها، بالإضافة إلى رد فعل واحد إضافي.
  3. مزيج بعناية من فورتيكسينغ.
  4. الماصة 19 ميكرولتر من مزيج ير، أعدت أعلاه، في كل بئر من لوحة مولتيويل الأبيض.
  5. إضافة 1 ميكرولتر من قالب دنا تعديل تركيز، أعدت في الخطوة 3.1.
    ملاحظة: لردود الفعل السيطرة، ودائما تشغيل عنصر تحكم سلبي مع العينات. لإعداد السيطرة السلبية، استبدال الحمض النووي القالب مع الماء.
  6. ختم لوحة مولتيويل الأبيض مع ختم احباط.
  7. وضع لوحة مولتيويل الأبيض في أجهزة الطرد المركزي وتوازنه مع موازنة مناسبة ( أي لوحة مولتيويل آخر). أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 1500 x ج في جهاز الطرد المركزي سوينغ دلو القياسية التي تحتوي على الدوار لوحات مولتيويل مع محولات مناسبة.
  8. تحميل لوحة مولتيويل الأبيض في أداة هرم-ير.
  9. بدء برنامج هرم-ير مع الظروف ير التالية:

    تمسخ: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. 1 دورة.
    التضخيم: 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 62 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية. 47 دورة.
    ذوبان منحنى: 95 و ديغ؛ c؛ منحدر معدل: 0.02 ° c / s؛ 25 عملية استحواذ لكل درجة مئوية؛ 1 دورة.
    التبريد: 40 و ديغ؛ c لمدة 30 s؛ منحدر معدل 2.2 ° C / s؛ 1 دورة.

4. تحليل إدارة الموارد البشرية لتحديد CR1 طول تعدد الأشكال

ملاحظة: المنهجية الموصوفة ( الشكل 5 ) هي محددة لبرامجنا (انظر جدول المواد )، على الرغم من أن حزم البرامج الأخرى يمكن استخدامها.

  1. فتح برنامج المسح الجيني لأداء تحليل CR1 طول تعدد الأشكال المسح الضوئي.
  2. افتح التجربة التي تحتوي على برنامج التضخيم وبرنامج منحنى ذوبان.
  3. انقر فوق محرر نموذج في شريط الوحدة النمطية ثم حدد Sسير العمل تعليب .
  4. تحديد خصائص العينات ( أي الاسم؛ السيطرة غير معروفة أو سلبية).
  5. انقر فوق تحليل في شريط الوحدة النمطية .
  6. في القائمة إنشاء تحليل جديد ، حدد المسح الضوئي الجيني.
  7. انقر فوق علامة التبويب التطبيع لتطبيع منحنيات الذوبان.
  8. انقر فوق علامة التبويب تحول درجة الحرارة لإعادة تعيين محور درجة الحرارة (x- محور) من منحنيات ذوبان.
    ملاحظة: الرسم البياني السفلي يظهر منحنيات ذوبان التي هي على حد سواء تطبيع ودرجة الحرارة تحول.
  9. انقر على زر حساب لتحليل النتائج وتحديد التجميع.
  10. انقر فوق علامة التبويب الفرق الفرق في منطقة الرسوم البيانية لعرض المنحنيات ذوبان تطبيع وتحولها وتطبيع ودرجة الحرارة تحولت مؤامرة الفرق .

النتائج

الشكل (6) ويعرض phenotyping من طول تعدد الأشكال CR1 من قبل البنك الدولي. الشكل 6 B و C يعرض المنحنيات التي يتم الحصول عليها خلال تحليل هر-ير، مما يتيح تحديد تعدد الأشكال CR1 طول. تحليل منحنيات الانصهار باستخدام البرنامج بعد ذوبان عالية الدقة من أمبليكونس المستمدة ير من الحمض النووي الجيني من الموضوعات مع الأشكال الإسوية CR1 مختلفة تنتج منحنيات التي تميز المواضيع وفقا لها النمط الظاهري المظاهر CR1 التعبير.

الشكل 6 ب يعرض طريقة العرض الأولى، وتسمى "منحنيات ذوبان المعتادة وتحولت"، في حين أن الشكل 6 C يعرض طريقة ثانية من العرض، ودعا "مؤامرة و تيمب-تحولت مؤامرة الفرق."

إب-together.within-بادج = "1"> يتم توزيع ملامح المنحنيات وفقا للمجموعات التي تمثل الظواهر المعروضة في الشكل 6 A : (CR1 * 3، CR1 * 1)؛ (CR1 * 1، CR1 * 2)؛ CR1 * 1؛ CR1 * 2. و (CR1 * 2، CR1 * 4). وهذا يتيح التنميط الجيني من تعدد الأشكال طول CR1 باستخدام هذا الأسلوب البيولوجيا الجزيئية الجديدة.

figure-results-1438
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للهيكل والتعدد الأشكال من مستقبلات تكميلية 1 البروتين. يتم تمثيل كل تكرار إجماع قصيرة (سر) أو تكملة البروتين السيطرة (كب) من قبل دائرة. يتم تجميع تقارير النجاح الخاصة في هياكل متكررة، أعلى ترتيب تسمى لرس. من المجال خارج الخلية إلى غشاء الخلية، و لرس هي: لر-A، -B، -C، -D، و -S (التكميلية أو إضافية لر). في الأكثر شيوعا CR1 إسوفورم(CR1 * 1)، يقع الموقع الملزم للنشاط المتسارع C4b / ديكاي في موقع لار-A (سكر 1-3، دوائر خضراء)، ويقع موقع الربط C3b / C4b / كوفيكتور (كا) في 3 تم العثور على سرعات N- محطة من لهر-B (سكر 8-10، الدوائر الحمراء) و لر-C (15-15 سكر، الدوائر الأرجواني)، وموقع ملزم ل C1q / مبل والفيكولين في لهر-D (سرس 22-28، الدوائر الزرقاء). يتم تلوين الهياكل متماثلة بشكل متطابق. يعرض النموذج الإسقاطي CR1 * 2 (S) لر إضافي (لر-S)، وبالتالي يحتوي على موقع C3b / C4b إضافي ملزم. كدا، كيلودالتون. نرك، شروط غير مخفضة. أرسي، انخفاض الظروف. تم، المجال الغشائي. تم تكييف هذا الرقم من بروورز إت آل. 36 بإذن من مجموعة نيتشر للنشر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2799 "/files/ftp_upload/56012/56012fig2.jpg" />
الشكل 2 : التمثيل التخطيطي للهيكل إسوفورم CR1 مع مواقف أمبليكون تسلسل التي حصل عليها هرم-ير. كل مربع يمثل سر. يتم تجميع وحدات الإنذار الذاتي في لرس: لر-A، -B، -C و -D. يتم تلوين الهياكل متماثلة بشكل متطابق. و CR1 * 2 و CR1 * 4 الأشكال الإسهالية تقدم لرس إضافية (لر-B) وبالتالي تحتوي على منطقة أمبليكون إضافية (أمبليكون B، باللون الأحمر). CR1 * 3 تفتقر إلى LR- B ويحتوي على منطقة أمبليكون أقل (تفتقر أمبليكون B). الاختلافات النيوكليوتيد بين أمبليكون B (196 بي بي) و أمبليكون ثابتة (197 بي بي) يتم تصويرها باللونين الأحمر والأزرق، على التوالي. الاختلافات في نسبة: (أمبليكون B، في أمبليكون أحمر / ثابت، باللون الأزرق) بين كل إسوفورم CR1 يتم تحديدها من قبل هر-ير، مما يتيح التنميط الجيني. يتم تسليط متواليات التمهيدي CN3 و CN3re. تم، المجال الغشائي. سيت، ذيل السيتوبلاسمي.بغ "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3882
الشكل 3: مخطط انسيابي للبروتوكول للتنميط الجيني تعدد الأشكال طول CR1 من عينات الدم البشرية. جمع عينة من الحمض النووي الإنسان. استخراج الحمض النووي للحصول على عينة الدم الحمض النووي. تحديد تركيز الحمض النووي وتمييع للحصول على تركيز الحمض النووي في 10 نانوغرام / ميكرولتر. استخدام هرم-ير للحصول على CR1 طول تعدد الأشكال الوراثي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4582
الشكل 4 : لقطات من الطيفي لنا إد لتحديد تركيز الحمض النووي. اضغط 1 ( A ) لتحديد وضع الحمض النووي على مقياس الطيف الضوئي. حدد طول مسار 5 مم ( B ) باستخدام الأسهم اليمنى واليسرى ( C ). حدد الوحدة (ميكروغرام / مل) ( D ) باستخدام الأسهم اليمنى واليسرى ( C ). حدد عامل التخفيف 1 ( E ) باستخدام الأسهم اليمنى واليسرى ( C ). حدد عامل 50 ( F ) باستخدام الأسهم اليمنى واليسرى. اضغط أوك ( G ). الماصة 10 ميكرولتر من الماء المقطر في كوفيت. وضع كوفيت في الطيف ( H ). اضغط على الزر أوا / 100٪ T ( I ). ماصة 10 ميكرولتر من عينة الحمض النووي (1/4 التخفيف في الماء المقطر) في كوفيت. وضع كوفيت في الطيفي ( K ). اضغط على الزر األخضر) قراءة / بدء () L (. لاحظ تركيز ( M ).إس / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5845
الشكل 5: لقطات من واجهة رسومية من البرنامج المستخدم في الخطوة 4 من البروتوكول. ( A ) فتح برنامج المسح الجيني. ( ب ) برنامج التضخيم وبرنامج انحناء ذوبان. ( C ) انقر على محرر نموذج في شريط الوحدة النمطية . ( D ) حدد المسح الضوئي . ( ه ) تحديد خصائص العينات. ( F ) انقر فوق تحليل في شريط الوحدة النمطية . (G) انقر فوق علامة التبويب التطبيع لتطبيع منحنيات الذوبان. ( H ) انقر على علامة التبويب التحول درجة الحرارة لإظهار منحنيات ذوبان على حد سواءتطبيع ودرجة الحرارة تحول. ( I ) انقر على زر حساب لتحليل النتائج وتحديد التجميع. ( J ) انقر على علامة التبويب فارق مؤامرة لعرض المنحنيات ذوبان تطبيع وتحولها وتطبيع ودرجة الحرارة تحول الفرق مؤامرة . ( K ) مجموعة ملونة من العينات وفقا ل CR1 طول الأنماط الجينية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7205
الشكل (6): التنميط المظهري لمفاهيم تعدد طول CR1 التي لوحظت في الضفة الغربية ومنحنياتها الشخصية المقابلة التي تم الحصول عليها بواسطة هرم-ير. ( A ) فينوتوبينغ من تعدد الأشكال CR1 طول باستخدام وب. ( ب ) و ( C ) التنميط الجيني من CR1 طول الأشكال باستخدام تحليل هرم-ير. تحليل منحنى هرم من أمبليكونس ير تم الحصول عليها من الحمض النووي الجيني من الموضوعات التي تعرض الأشكال الإسوية CR1 مختلفة أدت إلى تحديد ملامح منحنى محددة: (CR1 * 3، CR1 * 1) (الأرجواني). (CR1 * 1، CR1 * 2) (أزرق)؛ CR1 * 1 (أخضر)؛ CR1 * 2 (أحمر)؛ و (CR1 * 2، CR1 * 4) (رمادي). هذه تتوافق مع الأليلات متعددة الأشكال طول CR1. كما يتبين من طريقتي العرض - "منحنيات الانحناء المعتادة والمتحولة" (B) و "المؤامرة المعتادة ومتباينة مؤامرة الفرق" (C) - يتم توزيع ملامح منحنى وفقا ل (CR1 * 3، CR1 * 1) . (CR1 * 1، CR1 * 2)؛ CR1 * 1؛ CR1 * 2. و (CR1 * 2، CR1 * 4). تم تعديل هذا الرقم من محمودي وآخرون. 38 بإذن من السيفير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هنا، نحن تصف منهجية يمكن الوصول إليها على نطاق واسع لدراسة تعدد الأشكال CR1 طول. لم تكن تقنيات البيولوجيا الجزيئية للتضخيم أو التهجين القطعي قادرة على إعطاء نتائج مرضية تسمح بتحديد تعدد أشكال طول CR1 في جميع الأفراد. ويرجع ذلك إلى الهيكل المتكرر للجين CR1 ( أي، سرعات متكررة للغاية من CR1). طريقة البيولوجيا الجزيئية الموصوفة هنا تستغل التوزيع الكمي ل لر-B في جزيء CR1. يتضمن جزيء CR1 نطاقات n لر-B، حيث n هو عدد بين 0 و 3، ومجال واحد لر-C فقط، كما هو موضح والموضح في الشكل 2 . ويسمح الكشف الكمي للنطاق B بالتمييز التام بين نطاق إضافي أو مفقود.

من المادة الوراثية المستخرجة، يتم تضخيم جزء أول من الحمض النووي من لر-B عن طريق ير باستخدام زوج واحد من الاشعال محددة، ريبريسنتينغ البديل مميزة من لر-B يسمى "البديل أمبليكون B." كما يتم تضخيم جزء من الحمض النووي الثاني، يسمى "أمبليكون ثابت" والانتماء إلى لر-C. هذا الجزء الثاني من الحمض النووي هو جزء من لر-C، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم جزء ثابت آخر من لر-A أو -D.

يتم تضخيم شظايا الحمض النووي اثنين، أمبليكون B البديل والأمبليكون ثابتة، من قبل الاشعال نفسها وعرض خمسة الاختلافات في تسلسل النوكليوتيدات. هذه الخاصية تجعل من الممكن في الخطوة اللاحقة تحديد عدد أمبليكون B البديل وعدد من أمبليكونس ثابتة باستخدام أداة البيولوجيا الجزيئية الكمية، إدارة الموارد البشرية، والتي تم تكييفها لهذا الغرض. النسبة بين عدد أمبليكون B و أمبليكون ثابت (نسبة: أمبليكون B / أمبليكون ثابت) يختلف وفقا لطول جزيء CR1. في الواقع، يعرض CR1 * 4 3 أمبليكون ب وحدات إلى 1 أمبليكون ثابتة، CR1 * 2 يعرض 2 أمبليكون ب وحدات إلى 1 أمبليكون ثابتة، CR1 * 1 يعرض 1 أمبليكون B إلى 1 أمبليكون ثابت، و CR1 * 3 يعرض 0 أمبليكون ب وحدات إلى 1 أمبليكون ثابتة ( الشكل 2 ). وهكذا، فإن هذه الطريقة هر-ير تمكن التنميط الجيني من تعدد الأشكال طول CR1.

ومع ذلك، في بداية الدراسة، يتطلب هذا الأسلوب استخدام المواد المرجعية التي معروفة النمط الظاهري CR1 ( أي التي سبق إنشاؤها من قبل البنك الدولي) من أجل أن تكون قادرة على إنشاء التنميط الجيني لل CR1 وفقا لمرجع منحنيات الحصول عليها بواسطة هرم-ير. وهناك نوعان من التمثيل، وهما "منحنيات الانحلال المعتادة والمتحولة"، و "مؤامرة الفرق المؤلفة من درجة حرارة ثابتة ومتحولة". أنها تظهر مجموعات متميزة من ملامح منحنى الملونة وفقا ل CR1 طول فينوتيبينغ تعدد الأشكال التي حصل عليها وب ( الشكل 6 ). من "المنحنيات ذوبان تحولت ومتحول" خطوة، طريقة لدينا يجعل من الممكن التمييز ثe مجموعات متميزة من المنحنيات المقابلة ل إسوفورمز من CR1، مجمعة حسب اللون. ومع ذلك، فإن "مؤامرة و تيمب تحول الفرق المؤامرة"، والتي تتوافق مع تمثيل رياضي مختلف، ويسمح لتصور أسهل من مجموعات متميزة من المنحنيات. على الرغم من أن برامج الشركة المصنعة كانت تستخدم بشكل روتيني في هذه الدراسة، يمكن استخدام برامج أخرى (مثل واناليس) كبرنامج استخراج البيانات لتحليل المنحنى.

حتى الآن، تقنية التحليل وب هي التقنية الأصلية التي تمكن من تحديد مختلف الأشكال CR1 طول على مستوى البروتين. ومع ذلك، فإن هذه التقنية لديها عدد من العيوب. على وجه الخصوص، لا يمكن أن يتم تحليل البروتين من قبل البنك الدولي بعد استخراج أغشية الخلايا. ونتيجة لذلك، فإنه معقد ويستغرق وقتا طويلا جدا. وعلاوة على ذلك، تتطلب هذه التقنية الحصول على عينة دم جديدة في الظروف المناسبة في بداية الإجراء لتحقيق ريس مفيدةults. على العكس من ذلك، هرم-ير يؤدي على الحمض النووي يجعل من الممكن استخدام حتى البقع الدموية الجافة أو العينات بعد التخزين على المدى الطويل. همر-ير يتطلب أداة متخصصة تذوب الحمض النووي، إما أداة مخصصة أو ثيرمويكلر قدرة همر مع برنامج إدارة الموارد البشرية. ويتوقف اكتشاف سنب على عدة عوامل: (1) إن تعدد الأشكال المتضمنة في شظايا ير كبيرة يصعب اكتشافها من نفس الأشكال المتعددة في شظايا ير الصغيرة؛ (2) يصعب الكشف عن تعدد الأشكال التي تنتمي إلى الفئتين الثالثة والرابعة مقارنة بالطبقات الأولى والثانية 34 ؛ و 3) لا يمكن فرز الأشكال التي يحيط بها التماثل القاعدي الأقرب الأقرب (على سبيل المثال، 5'-G (G / C) C-3 'عن طريق الذوبان، بغض النظر عن قوة القرار من منصة همر. قد يكون من المفيد لاختبار شظايا ير المتوقعة التي تحتوي على سنب من الفائدة مع برنامج أوميلت 35 لتقييم صلاحية الفحص. وأخيرا، همر-ير هو طريقة أنالوجيك، وهذا يعني أن تشابه منحنيات ذوبان الرهانوين مرجعا ولا يعني القالب بالضرورة أن تسلسل القالب مطابق للمرجع، لأن تسلسل القالب قد يكون مختلفا عن المرجع ولكن المكافئ الحراري. ومع ذلك، فإن هذه القيود لا تنطبق على الطريقة الموصوفة هنا، والتي تقوم على ذوبان مزيج من أمبليكونس التي تختلف من حيث 5 متواليات النيوكليوتيدات.

وبالإضافة إلى ذلك، فإن تقنية وصفها هنا، استنادا إلى تحليل إدارة الموارد البشرية، لديها العديد من المزايا. أولا، يتم تحديد تعدد الأشكال طول CR1 بسرعة أكبر، حيث يتم الحصول على النتائج في حوالي 2 ساعة مرة واحدة وقد تم استخراج المواد الوراثية. على العكس من ذلك، وتقنيات الكيمياء الحيوية التقليدية على أساس تحليل البروتين وب تتطلب خطوات طويلة نسبيا: الكهربائي من مقتطفات غشاء الخلية من خلال هلام الأكريلاميد، وهي خطوة لنقل البروتينات إلى نيتروسليلوز أو فلوريد البولي فينيلين (بفدف) غشاء، وخطوة لتحديد إسوفورمز منCR1، الجزيء، بجانب، إمونوشيميلومينسانس. ثانيا، تقنية هرم-ير أيضا لديها ميزة عدم كونها مكلفة للغاية، وهو أمر مهم بشكل خاص لطريقة من المرجح أن تطبق على العديد من الأفراد ( أي لارجيسكيل) لتحديد قابليتهم لتطوير أمراض مثل مرض الزهايمر، الذئبة، أو الملاريا.

في الآونة الأخيرة، ونحن وغيرها أظهرت أن CR1 * 2 إسوفورم، الذي يحتوي على واحد إضافي C3b / C4b موقع ملزم، ارتبط مع 36 م ، 37 ، 38 . في دراستنا التي نشرت سابقا، فإن تعدد الأشكال طول CR1 على مستوى الجين والبروتين كانت متسقة في 98.9٪ من الموضوعات 38 . وكانت النتائج المتناقضة التي تم الحصول عليها عند مقارنة طول الأشكال المتعددة التي تم الحصول عليها من قبل هرم-ير مع تلك التي حصل عليها البنك الدولي مع الموضوعات التي تحتوي على (CR1 * 1، CR1 * 2) النمط الجيني الذي يحدده هرم (الجينات) ولكن السابقينوالضغط فقط على إسوفورم CR1 * 1 على سطح الكريات الحمراء وفقا لبروتين (وب). في دراستنا، كان عدم وجود التعبير الإسوي CR1 * 2 (الأفراد الذين يحملون أليل صامت) يمكن استنساخه عندما تم تنفيذ البنك الدولي مع وقت التعرض أطول ويمكن تفسيرها من خلال وجود أليل CR1 الصامت (CR1 * 2)، وصفها في الأدب من قبل هيلجيسون 39 . ومع ذلك، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات حول عدد أكبر من السكان لدعم هذه الفرضية.

وتجدر الإشارة إلى أن تعدد الأشكال الخاصة (سنبس فقط التي تحدث في مجموعة عائلية صغيرة أو حتى في فرد واحد) أدى إلى ملامح منحنى متميزة التي ينبغي فك رموزها باستخدام تحديد النمط الظاهري المرجعية (وب) ولكن لا يمكن الخلط بينه وبين الملف الشخصي المتعارف عليه لتجنب أي تفسير خاطئ من النمط الجيني تعدد الأشكال طول CR1.

Disclosures

المؤلفون هم المخترعون لبراءة تملكها جامعة ريمس الشمبانيا أردن (أوركا) (عدد براءات الاختراع و 2015166194)

Acknowledgements

نشكر جميع أعضاء بلاتيفورم ريجيونال دي بيولوجي إنوفانتي، والموظفين من قسم علم المناعة، وموظفي قسم الطب الباطني وطب الشيخوخة، الذين ساهموا في تحسين والتحقق من صحة البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مستشفيات جامعة ريمس (منحة رقم AOL11UF9156). كما نشكر فيونا إيكارنوت (EEA3920، مستشفى جامعة بيسانكون، فرنسا) للمساعدة التحريرية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Lab coatprotection
SensiCareIce powder-free Nitrile Exam glovesMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802sample protection
Eppendorf Reference 2 pipette, 0,5-10µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024sample pipetting
Eppendorf Reference 2 pipette, 20-100µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059sample pipetting
Eppendorf Reference 2 pipette, 100-1000µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083sample pipetting
TipOne 10µL Graduated, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1121-3810sample pipetting
TipOne 1-100µL bevelled, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1120-1840sample pipetting
ART 1000E Barrier TipThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079Esample pipetting
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf QualityEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086mix
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236mix
QIAamp DNA Mini Kit (250)Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France51306DNA Extraction
Buffer ALQiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France19075Lysis buffer
QIAamp Mini Spin ColumnQiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France1011706DNA binding
Buffer AW1Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France19081Wash buffer
Buffer AW2Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France19072Wash buffer
Biowave DNA spectrophotometerBiochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England80-3004-70DNA concentration 
Mikro 200 centrifugeHettich Zentrifugen, D-78532, Germany0002020-02-00centrifugation
Multipette E3Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4987000010distribution
Light Cycler 480 multiwell plate 96, whiteRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany04729692001reaction place
Light Cycler 480 sealing foilRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany04429757001coverage
Heraeus Megafuge 11R centrifugeThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France75004412centrifugation
LightCycler 480 Instrument II, 96-wellRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany05015278001high resolution melting polymerase chain reaction
LightCycler 480 High Resolution Melting MasterRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany04909631001reaction reagents
light cycler 480 SW 1.5.1 softwareRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germanysoftware used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis
CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3'Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgiumreaction reagent
CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgiumreaction reagent

References

  1. Prince, M., et al. World Alzheimer Report 2015, The Global Impact of Dementia: An analysis of prevalence, incidence, cost and trends. Alzheimer's Disease International. , (2015).
  2. McKhann, G. M., et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 7 (3), 263-269 (2011).
  3. Serrano-Pozo, A., Frosch, M. P., Masliah, E., Hyman, B. T. Neuropathological alterations in Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006189(2011).
  4. Goate, A., et al. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. Nature. 349 (6311), 704-706 (1991).
  5. Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375 (6534), 754-760 (1995).
  6. Levy-Lahad, E., et al. A familial Alzheimer's disease locus on chromosome 1. Science. 269 (5226), 970-973 (1995).
  7. Mayeux, R., Stern, Y. Epidemiology of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (8), (2012).
  8. Corder, E. H., et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science. 261 (5123), 921-923 (1993).
  9. Yu, J. T., Tan, L., Hardy, J. Apolipoprotein E in Alzheimer's disease: an update. Annu Rev Neurosci. 37, 79-100 (2014).
  10. Lambert, J. C., et al. Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer's disease. Nat Genet. 41 (10), 1094-1099 (2009).
  11. Liu, D., Niu, Z. X. The structure, genetic polymorphisms, expression and biological functions of complement receptor type 1 (CR1/CD35). Immunopharmacol Immunotoxicol. 31 (4), 524-535 (2009).
  12. Jacquet, M., et al. Deciphering complement receptor type 1 interactions with recognition proteins of the lectin complement pathway. J Immunol. 190 (7), 3721-3731 (2013).
  13. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  14. Cosio, F. G., Shen, X. P., Birmingham, D. J., Van Aman, M., Hebert, L. A. Evaluation of the mechanisms responsible for the reduction in erythrocyte complement receptors when immune complexes form in vivo in primates. J Immunol. 145 (12), 4198-4206 (1990).
  15. Krych-Goldberg, M., Moulds, J. M., Atkinson, J. P. Human complement receptor type 1 (CR1) binds to a major malarial adhesin. Trends Mol Med. 8 (11), 531-537 (2002).
  16. Cohen, J. H., Geffriaud, C., Caudwell, V., Kazatchkine, M. D. Genetic analysis of CR1 (the C3b complement receptor, CD35) expression on erythrocytes of HIV-infected individuals. Aids. 3 (6), 397-399 (1989).
  17. Rogers, J., et al. Complement activation by beta-amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (21), 10016-10020 (1992).
  18. Rogers, J., et al. Peripheral clearance of amyloid beta peptide by complement C3-dependent adherence to erythrocytes. Neurobiol Aging. 27 (12), 1733-1739 (2006).
  19. Krych-Goldberg, M., Atkinson, J. P. Structure-function relationships of complement receptor type 1. Immunol Rev. 180, 112-122 (2001).
  20. Klickstein, L. B., et al. Human C3b/C4b receptor (CR1). Demonstration of long homologous repeating domains that are composed of the short consensus repeats characteristics of C3/C4 binding proteins. J Exp Med. 165 (4), 1095-1112 (1987).
  21. Hourcade, D., Miesner, D. R., Atkinson, J. P., Holers, V. M. Identification of an alternative polyadenylation site in the human C3b/C4b receptor (complement receptor type 1) transcriptional unit and prediction of a secreted form of complement receptor type 1. J Exp Med. 168 (4), 1255-1270 (1988).
  22. Krych, M., Hourcade, D., Atkinson, J. P. Sites within the complement C3b/C4b receptor important for the specificity of ligand binding. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (10), 4353-4357 (1991).
  23. Krych-Goldberg, M., et al. Decay accelerating activity of complement receptor type 1 (CD35). Two active sites are required for dissociating C5 convertases. J Biol Chem. 274 (44), 31160-31168 (1999).
  24. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  25. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. J Exp Med. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  26. Cornillet, P., Philbert, F., Kazatchkine, M. D., Cohen, J. H. Genomic determination of the CR1 (CD35) density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction amplification and HindIII restriction enzyme digestion. J Immunol Methods. 136 (2), 193-197 (1991).
  27. Moulds, J. M., Nickells, M. W., Moulds, J. J., Brown, M. C., Atkinson, J. P. The C3b/C4b receptor is recognized by the Knops, McCoy, Swain-langley, and York blood group antisera. J Exp Med. 173 (5), 1159-1163 (1991).
  28. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sang. 62 (4), 230-235 (1992).
  29. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. J Exp Med. 164 (1), 50-59 (1986).
  30. Wong, W. W., et al. Structure of the human CR1 gene. Molecular basis of the structural and quantitative polymorphisms and identification of a new CR1-like allele. J Exp Med. 169 (3), 847-863 (1989).
  31. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in Caucasian and African American populations. Clin Immunol Immunopathol. 87 (2), 176-183 (1998).
  32. Rowe, J. A., et al. Erythrocyte CR1 expression level does not correlate with a HindIII restriction fragment length polymorphism in Africans; implications for studies on malaria susceptibility. Genes Immun. 3 (8), 497-500 (2002).
  33. Birmingham, D. J., et al. A polymorphism in the type one complement receptor (CR1) involves an additional cysteine within the C3b/C4b binding domain that inhibits ligand binding. Mol Immunol. 44 (14), 3510-3516 (2007).
  34. Venter, J. C., et al. The sequence of the human genome. Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).
  35. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
  36. Brouwers, N., et al. Alzheimer risk associated with a copy number variation in the complement receptor 1 increasing C3b/C4b binding sites. Mol Psychiatry. 17 (2), 223-233 (2012).
  37. Hazrati, L. N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2945-2949 (2012).
  38. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiol. Aging. 36, 1712-1765 (2015).
  39. Helgeson, M., Swanson, J., Polesky, H. F. Knops-Helgeson (Kna), a high-frequency erythrocyte antigen. Transfusion. 10 (3), 137-138 (1970).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

125 CR1 CD35 C3b C4b CR1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved