استخدام كبسولات لالتلطيخ السلبي من العينات الفيروسية ضمن بيوكنتينمنت

Summary

يوفر هذا البروتوكول تعليمات لعينات فيروس تلطيخ السلبية التي يمكن استخدامها بسهولة في بسل-2، -3، أو -4 المختبرات. ويشمل استخدام كبسولة المعالجة المبتكرة، الذي يحمي شبكة المجهر الإلكتروني انتقال ويوفر للمستخدم التعامل أسهل في البيئات أكثر اضطرابا ضمن بيوكنتينمنت.

Abstract

يستخدم انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) لمراقبة البنية التحتية للفيروسات ومسببات الأمراض الميكروبية الأخرى مع قرار نانومتر. معظم المواد البيولوجية لا تحتوي على عناصر كثيفة قادرة على تشتت الإلكترونات لخلق صورة؛ وبالتالي، وصمة عار السلبية، الذي يضع أملاح المعادن الثقيلة الكثيفة حول العينة، مطلوب. من أجل تصور الفيروسات في تعليق تحت تيم يجب تطبيقها على شبكات صغيرة المغلفة مع سطح شفاف فقط نانومتر سميكة. ونظرا لصغر حجمها وهشاشتها، يصعب التعامل مع هذه الشبكات وتتحرك بسهولة بواسطة التيارات الهوائية. يتم تلف السطح الرقيق بسهولة، وترك العينة صعبة أو مستحيلة للصورة. يجب التعامل مع الفيروسات المعدية في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (بسك) وبعضها يتطلب بيئة مختبرية حيوية. تلوث الفيروسات في مستويات السلامة الحيوية (بسل) -3 و -4 يشكل تحديا خاصا لأن هذه البيئات أكثر اضطرابا والفنيين مطلوب to ارتداء معدات الوقاية الشخصية (ب)، مما يقلل من البراعة.

في هذه الدراسة، قمنا بتقييم جهاز جديد للمساعدة في الفيروسات تلطيخ السلبية في بيوكنتينمنت. الجهاز هو كبسولة التي تعمل بمثابة طرف ماصة المتخصصة. مرة واحدة يتم تحميل شبكات في كبسولة، المستخدم ببساطة ينضح الكواشف في كبسولة لتسليم الفيروس والبقع إلى شبكة مغلفة، وبالتالي القضاء على التعامل مع المستخدم من الشبكات. على الرغم من أن هذه التقنية تم تصميمها خصيصا للاستخدام في بسل-3 أو -4 بيوكنتينمنت، فإنه يمكن تخفيف إعداد العينات في أي بيئة المختبر من خلال تمكين السهل تلطيخ السلبية من الفيروس. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة نفسها لإعداد عينات تيم الملون السلبي من الجسيمات النانوية، والجزيئات الكبيرة وعينات مماثلة.

Introduction

انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) هو أداة فعالة لعرض التشكل والبنية التحتية من العينات البيولوجية التي هي صغيرة جدا أن ينظر إليها مع المجهر الضوئي التقليدي ^{1 ، 2 ، 3 ، 4} . تيمس تبادل لاطلاق النار الإلكترونات من خلال عينة رقيقة جدا تنتج صورة عالية الدقة والإلكترونات لديها طول موجي أقصر بكثير من الضوء. المناطق من العينة التي ثني أو منع الإلكترونات تظهر مظلمة، في حين أن المناطق التي الإلكترون لوسنت تظهر بيضاء.

عدم وجود مادة كثيفة الإلكترون يجعل من الصعب فيروسات لعرض تحت تيم لأنها لا يمكن مبعثر الإلكترونات. تلطيخ السلبية هي الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لخلق التباين وعرض الفيروسات مع تيم. وقد اقترح أول إجراء سلبي تلطيخ من قبل برينر وهورن في عام 1959، استنادا إلى تجربة حيث هول (1955) وهكسلي (1957) أوسرفي ظهور الهياكل البيولوجية في النقيض العكسي عندما مغمورة في مادة كثيفة الإلكترون ⁵ . وقد ظلت عملية التلطيخ السلبي دون تغيير تقريبا خلال نصف القرن الماضي. تلطيخ سلبي ينطوي لفترة وجيزة تطبيق محلول ملح المعادن الثقيلة لعينة على شبكة تيم في محاولة لإحاطة الفيروس مع مادة كثيفة دون تسلل الفيروس ⁶ . هذا يخلق الحدود المظلمة ويكشف عن شكل الجسيمات ⁵ . تستخدم هذه الدراسة اثنين من الكواشف لالتلطيخ السلبي، خلات اليورانيل (وا) وحمض البوتاسيوم فوسفهوتنغستيك (بتا). كل من هذه البقع تستخدم عادة لصبغة سلبية العينات البيولوجية الصغيرة، مثل الفيروسات، المجمعات البروتين، والجسيمات النانوية ^{7 ، 8 ، 9} .

تقنية تلطيخ السلبية التقليدية هي دليل قطرة سلبية تلطيخ التكنولوجيانيك ⁷ . هذا الأسلوب يتطلب معالجة دقيقة من الصغيرة، والهياكل تيم الهشة مع ملقط لتطبيق كميات صغيرة من عينة الفيروس، وصمة عار، ويشطف. بروتوكول إعداد نموذجي ينطوي على تطبيق قطرة من تعليق عينة على سطح شبكة تيم المغلفة فيلم ( الشكل 1A ). بعد تعلق العينة على سطح الفيلم، يتم شطف الشبكة لإزالة الفيروسات غير الملتصقة وملطخة إما وا أو منطقة التجارة التفضيلية لبضع ثوان إلى دقيقة، اعتمادا على نوع العينة. السائل الزائد هو الأشرار بعيدا عن الشبكة عن طريق لمس قطعة من ورقة الترشيح على حافة الشبكة.

يتطلب أسلوب قطرة اليدوي أن يتم كل شبكة بشكل فردي. إذا لم يتم التعامل معها بعناية، يتم ثقب شبكات تيم المغلفة بسهولة، عازمة، أو ملوثة. معالجة عينات متعددة يمكن أن يؤدي إلى صعوبات في تتبع الشبكات وضمان تلطيخ متسقة لكل عينة. هذا الإجراء تلطيخ دليل أكثر من ذلك بكثير د(بسل) -3 و -4 مختبرات احتواء حيوي، وذلك بسبب معدات الوقاية الشخصية المطلوبة (ب) المطلوبة لهذه البيئات. معدات الوقاية الشخصية مرهقة وبيئة الاحتواء البيولوجي هو أكثر اضطرابا بكثير مقارنة مع مختبر منتظم. ويطلب من العاملين في مختبرات الاحتواء البيولوجي بسل-3 ارتداء زوجين من القفازات والعمل في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (بسك). هذه الطبقة المزدوجة من القفازات تقلل من حساسية اللمس وتقيد حركة المحركات الدقيقة. تدفق الهواء من بسك الذي يحمي المستخدم ويساعد على منع تلوث العينة يمكن أن يسبب العينات والبقع لتجف بسرعة كبيرة مما يؤثر على جودة وصمة عار. تدفق الهواء المضطرب قوي في بسك يمكن أيضا ضربة بسرعة بعيدا الشبكة التي ليست مضمونة بشكل جيد. في مختبرات الاحتواء البيولوجي بسل-4، هناك متطلبات إضافية للسلامة. ويطلب من الموظفين ارتداء بدلة ضغط إيجابية، مما يزيد من تقييد الحركة المادية والقدرة على رؤية واضحة والتلاعبصفح الشبكات. فني يعمل في بسل-4 أيضا يرتدي على الأقل 2 أزواج من القفازات، مع الزوج الخارجي كونه قفاز سميك مما يقلل كثيرا من البراعة والإحساس اللمسي. وأخيرا، فإن ملقط تستخدم للتعامل مع شبكات تيم حادة، مما يشكل خطرا على فني نظرا لقدرتها على ثقب القفازات. مع كبسولات تحتوي على شبكات، ملقط ليست ضرورية، وبالتالي توفير بديل آمن، ملقط خالية لمعالجة الشبكات في بيوكنتينمنت. وأخيرا، فإن الكبسولات توفر أيضا وسيلة فعالة لتخزين الشبكات أثناء المعالجة، والتطهير بخار الأوزميوم، وأثناء التخزين. وبالتالي الحفاظ على الشبكات المنظمة وآمنة من التلف.

في هذا التقرير، ونحن نقدم طريقة جديدة لشبكات تل تلطيخ السلبية في مختبرات الاحياء البيولوجية التي تستخدم كبسولات مبريب / ز، جهاز يستند إلى كبسولة لمعالجة الشبكة وتلطيخ ^{10 ، 11 ، 12} . كبسولة أكوموتعديل اثنين من شبكات تيم، ويقلل من التعامل المباشر، ويقلل من احتمال تلف الشبكة. الكبسولة تعلق مباشرة إلى ماصة واحدة أو متعددة القنوات بنفس الطريقة كما غيض ماصة، والسماح لتطبيق السوائل المختلفة للشبكات الواردة في. وهذا يتيح إعداد في وقت واحد من عينات متعددة مع شبكات مكررة ( الشكل 1B ). إلى وصمة عار سلبية مع كبسولات يتم استنشق عينة الفيروس في كبسولة وعقد لمدة 10 دقيقة للسماح للفيروسات امتزاز على أسطح الشبكة. ثم يتم غسل الشبكات مع الفيروس كثف مع منزوع الأيونات (دي) المياه وملطخة إما وا أو منطقة التجارة التفضيلية لبضع ثوان إلى 1 دقيقة. تستخدم هذه العملية نفس الخطوات بروتوكول والكواشف كطريقة قطرات اليدوي. والفرق هو أن كل عمل يحدث داخل الكبسولة مع عدم وجود مناولة المادية للشبكات. ( أرقام 1C ، 1D ).

وكان الغرض من هذه الدراسة لتقييم كبسولات كماطريقة جديدة للتلطيخ السلبي لعينات الفيروسات في بيئات الاحتواء البيولوجي. كما بحثت هذه الدراسة نوعية الصور تيم المنتجة من اثنين من إجراءات تعطيل الفيروس المختلفة: 1) تعطيل السريع، مع 1٪ أكسيد الأكسيميوم رباعي أكسيد، و 2) 24 ساعة تعطيل مع 2٪ غلوتارالدهيد. وقد أجريت كل من هذه باستخدام كبسولات. وأخيرا، قمنا بتقييم اثنين من البقع السلبية المستخدمة عادة، وا و بتا، لاستخدامها في الكبسولة. ¹³

Protocol

1. إعداد التجربة في بيئة بسل-2 قبل العمل مع عينات الفيروسات

1. إعداد أو شراء فورمفار وشبكات النحاس المغلفة الكربون تيم، وعادة 200-400 شبكة.
2. إدراج شبكات تيم المغلفة في كبسولات.
   1. استخدام عدسة مكبرة لجعل هذه العملية سهلة لأداء. يمكن إدراج واحد أو اثنين من الشبكات في كل كبسولة. يمكن شراؤها كبسولات محملة مسبقا للقضاء على هذه الخطوة إذا رغبت في ذلك.
3. نقل الكبسولات مع إدراج شبكات المغلفة تيم، جنبا إلى جنب مع غيرها من الكواشف والكواشف، إلى الاحتواء البيولوجي حيث سيتم الملطخة الفيروسات بشكل سلبي.

2. طريقة كبسولة للتلطيخ السلبي في بيوكنتينمنت باستخدام غلوتارالدهيد مائي و 1٪ أوزميوم تيبروكسيد بخار إيناكتيفاتيون

1. داخل بيوكنتينمنت بسك، نضح 40 ميكرولتر من تعليق الفيروس في كبسولة تعلق على ماصة.
   ملاحظة: يبقى ماصة تعلق على الكبسولة ه حتى اكتمال العملية. إعداد الفيروسات وفقا لنشرنا السابق ¹⁴ .
2. وضع ماصة على جانبها لمدة 10 دقيقة مع شبكات المنحى أفقيا. هذا هو لتعزيز توزيع حتى من جسيمات الفيروس على شبكات المغلفة.
3. تعطيل الفيروس داخل الكبسولة داخل بيوكنتينمنت ش.م.ب.
   1. التقاط ماصة وخفض المكبس للاستغناء عن حل الفيروس في حاوية النفايات.
   2. نضح 40 ميكرولتر من 2٪ غلوتارالدهيد تثبيتي في كبسولات.
      تنبيه: الجلوتارالدهيد هو مادة كيميائية خطرة ويتطلب الحماية المناسبة. ويمكن استخدام الجلوتارالدهيد لفترات قصيرة في بسك العادي، ولكن يتطلب كاشف مفتوح الموسعة العمل في بسك مجاري الهواء أو غطاء الدخان الكيميائية.
   3. وضع ماصة على جانبها لمدة 20 دقيقة. هذا هو لضمان عينات ثابتة بشكل جيد.
   4. طرد تثبيتي ونضح 40 ميكرولتر من الماء دي في كبسولات ل wالرماد بعيدا تثبيتي. كرر هذه الخطوة غسل ما مجموعه 3 دورات شطف.
4. نضح 40 ميكرولتر إما 1٪ خلات اليورانيل (وا) أو 1٪ حمض البوتاسيوم فوسفهوتنغستيك (بتا) في كبسولات والسماح للجلوس لمدة 30 ثانية.
   ملاحظة: قد يتفاوت وقت تلطيخ من 10 ثانية إلى 1 دقيقة بناء على عينة الفيروس.
   تنبيه: وا هو باعث ألفا، وسموم التراكمي. التعامل معها مع الحماية المناسبة.
5. إزالة الكبسولة من ماصة وصمة عار تجفيف الشبكات عن طريق لمس قطعة من ورقة الترشيح على حافة الشبكات في حين تبقى الشبكات داخل كبسولة.
6. أوزميوم رباعي أكسيد بخار تعطيل الإجراء.
   1. وضع كبسولة، مع فتح الغطاء، إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على ورقة الترشيح غارقة في محلول رباعي أكسيد الأوسيميوم 1٪.
      الحذر: رباعي أكسيد الأوسيميوم هو سامة للغاية مع انخفاض ضغط البخار. يجب أن تستخدم في بسك المجاري أو غطاء الدخان الكيميائية. التعامل معها مع الحماية المناسبة. تحذير آخرالمعلومات في منطقة العمل.
   2. ختم أنبوب الطرد المركزي 50 مل لمدة 1 ساعة للسماح نفاذية كاملة من بخار رباعي أكسيد الأوسميوم. ثم، بعد ذلك تطهير ونقل الأنبوب من بيوكنتينمنت إلى مرفق بسل-2 إم.
7. إزالة شبكات إم من الكبسولة.
   1. في مرفق بسل-2 إم، وإزالة كبسولة من أنبوب الطرد المركزي ووضعه على ماصة.
   2. نضح 40 ميكرولتر من الماء دي في كبسولة واستغناء الماء في حاوية النفايات ثلاث مرات.
   3. إزالة الكبسولة من ماصة وصمة عار تجفيف الشبكات باستخدام ورقة مرشح للمس حافة الشبكات.
   4. بعد تجفيف الهواء، وتخزين الشبكات للتصوير تيم لاحق.

3. طريقة كبسولة لتعطيل في بيوكنتينمنت مع 2٪ غلوتارالدهيد، تليها تلطيخ سلبي في مختبر بسل-2

1. إجراء تعطيل الفيروسات.
   داخل بيوكنتينمنت بسك، مزيج من تعليق الفيروس بشكل جيد مع نفس الحجم من 4٪ غلوتارالدهيد لتحقيق تركيز النهائي من 2٪ غلوتارالدهيد.
   تنبيه: الجلوتارالدهيد هو مادة كيميائية خطرة ويتطلب الحماية المناسبة. ويمكن استخدام الجلوتارالدهيد لفترات قصيرة في بسك العادي، ولكن يتطلب كاشف مفتوح الموسعة العمل في بسك مجاري الهواء أو غطاء الدخان الكيميائية.
   1. تعطيل الفيروسات مع تثبيتي لمدة لا تقل عن 24 ساعة قبل التعبئة والتغليف، وإزالة التلوث، ونقله إلى مرفق بسل-2 إم.
2. في مرفق بسل-2 إم، نضح الفيروس وخليط تثبيتي في كبسولة، التي تحتوي على اثنين من شبكات تيم، تعلق على ماصة.
3. وضع ماصة أفقيا لمدة 10 دقيقة مع الشبكات الموجهة أفقيا.
   ملاحظة: هذا هو لتعزيز توزيع حتى من جسيمات الفيروس على شبكات تيم.
4. التقاط ماصة وخفض المكبس لطرد الفيروس إلى حاوية النفايات. نضح 40 ميكرولتر من ديالماء في الكبسولات وطرده في حاوية النفايات لمدة 3 دورات شطف.
5. نضح 40 ميكرولتر إما 1٪ وا أو 1٪ بتا في كبسولات لمدة 30 ثانية.
   ملاحظة: تباين الوقت تلطيخ من 10 ثانية إلى 1 دقيقة على أساس عينة الفيروس.
   تنبيه: وا هو باعث ألفا، وسموم التراكمي. التعامل معها مع الحماية المناسبة.
6. إزالة الكبسولة من ماصة وصمة عار تجفيف الشبكات عن طريق لمس حافة الشبكات إلى قطعة من ورقة الترشيح. الهواء تجفيف الشبكات وتخزينها لتصوير تيم لاحق.

النتائج

طريقة كبسولة تنتج نوعية جيدة تلطيخ سلبي للتصوير تيم:

أولا، قمنا بتقييم جودة الصور التي تم إنشاؤها باستخدام كل من طريقة قطيرة اليدوي وطرق كبسولة لتلطيخ سلبي فيروس زايير إيبولافيروس. الفيروسات ال...

Discussion

تلطيخ السلبية هي تقنية تيم قيمة لتقييم وتحجيم الفيروسات والمجمعات البروتين والجسيمات النانوية. وقد تم إعداد قطرات من هذه العينات عن طريق التحرك اليدوي للشبكات من كاشف إلى البقع السلبية البروتوكول الكلاسيكي لأكثر من نصف قرن. إنها عملية بسيطة، ولكنها تتطلب الخبرة ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar/carbon coated TEM grids	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules	EMS	85010-01	box
mPrep/f couplers	EMS	85010-11	standard 16/Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide	EMS	19190	4% aqueous solution
Uranyl Acetate	EMS	22400	powder
Potassium phosphotungstic acid	EMS	19500	powder
filter paper	Whatman	1450-090	size 50
Tranmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1011	TEM