JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذا البروتوكول وسيلة المطبقة سريرياً تذويب مسعور المركبات في بيئة مائية باستخدام تركيبات من تجميع حلول الببتيد والأحماض الأمينية ذاتيا. لدينا أسلوب يحل قيداً رئيسيا للمداواة مسعور، التي تفتقر إلى وسائل آمنة وفعالة لأساليب الذوبان وإيصالها إلى إعدادات السريرية.

Abstract

تجميع ذاتي الببتيدات (برامج التكيف الهيكلي) مركبات واعدة لتقديم العلاجات مسعور للتطبيقات السريرية؛ خصائصها amphipathic تسمح لهم بحل مسعور المركبات في البيئة المائية للجسم البشري. غير أن تجميع ذاتي الببتيد الحلول لها الدم سوء التوافق (مثلاً، انخفاض الاسموليه)، التي تعوق تطبيقها السريري من خلال الإدارات عن طريق الحقن الوريدي. وقد وضعنا مؤخرا منصة معمم لإيصال الأدوية مسعور، الذي يجمع بين برامج التكيف الهيكلي مع حلول حمض أميني (SAP-AA) لتعزيز قابلية الذوبان في المخدرات وزيادة اسموليه صياغة للوصول إلى متطلبات الاستخدامات السريرية. هذه الاستراتيجية صياغة تم اختبارها بدقة في سياق ثلاث مجمعات مسعور هيكلياً مختلفة – PP2، روتليرين، والكركمين – من أجل إثبات براعة. وعلاوة على ذلك، قمنا بدراسة آثار التغير في وضع المكونات من خلال تحليل 6 مختلف برامج التكيف الهيكلي، 20 من الأحماض الأمينية الموجودة بطبيعة الحال في التركيزات المنخفضة والعالية، وهما مختلف المذيبات المشارك ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) والايثانول. ولوحظ استراتيجيتنا أثبتت فعاليتها في تحسين مكونات معينة من المخدرات مسعور، والوظيفة العلاجية لمثبطات صياغتها، PP2، سواء في المختبر و في فيفو. ويوجز هذه المخطوطة لدينا أسلوب صياغة المعمم استخدام تركيبات SAP AA لمركبات مسعور، وتحليل للذوبان كخطوة أولى نحو إمكانية استخدام هذه الصيغ في دراسات أكثر وظيفية. نحن تشمل نتائج الذوبان الممثل لصياغة الكركمين المركب، مسعور، ومناقشة كيفية منهجيتنا بمثابة منبر للدراسات البيولوجية في المستقبل ونماذج المرض.

Introduction

برامج التكيف الهيكلي هي فئة من المواد الحيوية التي درست على نطاق واسع السقالات 3D في الطب التجديدي1،2،،من34. في الآونة الأخيرة بيد أنهم استغلوا كوسائل لإيصال المداواة بسبب تلك الخصائص البيولوجية الفريدة5،6،،من78. وبطبيعة الحال تجميع برامج التكيف الهيكلي إلى النانو مستقرة9، مما يوفر وسيلة لتغليف المخدرات والحماية. برامج التكيف الهيكلي أمفيباثيك، تتألف من نمط معين من يكرر مسعور وماء من الأحماض الأمينية، القيادة على التجميع الذاتي9،10 ، والسماح لهم بالعمل كوسيط بين مسعور وماء بيئات. ونتيجة لذلك، لإيصال المخدرات مسعور--السريرية التي لديها منخفضة للغاية من التوافر البيولوجي والامتصاص في الجسم بسبب انعدام القابلية للذوبان في البيئات المائية11،12 -برامج التكيف الهيكلي واعدة كتسليم مركبة. وعلاوة على ذلك، يعني على نمط التسلسل أيضا أن برامج التكيف الهيكلي يمكن تصميم عقلانية وهندسيا لتحقيق أقصى قدر من التوافق مع أي مخدر معين أو مركب (أي، استناداً إلى المجموعات الوظيفية) وكذلك مساعدة الذوبان.

وقد طبقت برامج التكيف الهيكلي كوسائل إيصال المخدرات فعالة في كثير من المختبر و في فيفو إعدادات13،14،،من1516. أنها أظهرت أيضا سلامة كبيرة وتوافق مع الحياة. ومع ذلك، نظراً لانخفاض الاسموليه ساب-المخدرات الاستعدادات، أنهم لا يمكن استخدام للحقن الوريدي كما هو الحال في إعدادات السريرية13. نظراً لهذا التقييد، وضعنا مؤخرا استراتيجية الذي يجمع بين برامج التكيف الهيكلي مع حلول حمض أميني بغية الحد من استخدام المذيبات السامة المشارك وزيادة اسموليه صياغة، ومن ثم أهمية سريرية. لقد اختار استخدام الأحماض الأمينية كما هي اللبنات الأساسية لبرامج التكيف الهيكلي، بالفعل قبلت سريرياً، وفي تركيبة مع برامج التكيف الهيكلي، أنها تزيد القابلية للذوبان في الماء من المخدرات في حين خفض مبلغ ساب المطلوبة17،18.

نحن فحص تركيبات ساب-AA كمنبر معمم للذوبان في الماء من المخدرات وتسليم اللاحقة بإنشاء خط أنابيب متعدد خطوة فحص وتطبيقه على مثبط Src، PP2، كنموذج مجمع مسعور. في هذه العملية، قمنا بدراسة تأثير تغيير مكونات صياغة – اختبار 6 مختلف برامج التكيف الهيكلي، كل 20 من الأحماض الأمينية بتركيزات مختلفة 2 (منخفضة وعالية؛ وانخفاض استناداً إلى التركيزات في التطبيقات السريرية الحالية، وارتفاع في نهاية المطاف وكانت التركيزات 2 x أو 3 x 5 x تركيز السريرية استناداً إلى أن القابلية للذوبان كحد أقصى لكل من الأحماض الأمينية في الماء)، والمذيبات المشارك مختلفة 2 – والتركيبات المحددة التي solubilized PP2 لمزيد من التحليل. هذا وضع المخدرات أثبتت فعاليتها كوسيلة إيصال المخدرات في الخلية والثقافة، فضلا عن في فيفو نماذج استخدام الإدارات تحسن وفي الوريد. وبالمثل، لمست عملنا على براعة ساب-AA مجموعات متعددة سولوبيليزينج، مركبات مسعور المختلفة هيكلياً في البيئات المائية؛ على وجه التحديد، المخدرات روتليرين والكركمين18. وتحدد هذه المخطوطة أسلوب صياغة ساب-AA وتحليل قابلية الذوبان في الكركمين كمثال على الخطوة الأولية في خط أنابيب الفحص لدينا. يوفر هذا البروتوكول بطريقة بسيطة، واستنساخه على الشاشة لتركيبات ساب-AA الأمثل، الذي يحل أي مجمع مسعور معين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. "إعداد حلول الأحماض الأمينية"

  1. تحضير وتسمية 50 مل المخروطية أجهزة الطرد المركزي أنبوبين لكل حمض أميني (واحدة كل على حد سواء " منخفض " و " عالية " تركيزات).
  2. تعد قارورة 2 ل كبيرة التي تحتوي على المياه النقية (MΩ·cm 18.2 عند 25 درجة مئوية).
  3. حساب مقدار كل من الأحماض الأمينية (بالغرام) تصل إلى تركيزات المرجوة، وتزن المقدار المناسب من الأحماض الأمينية في أنابيب الطرد المركزي كل منها 50 مل استخدام ملعقة.
    ملاحظة: للحصول " عالية " التركيز الاثنين من المتهمين سلبا على الأحماض الأمينية، وبرنامج تلفزيوني يستخدم بدلاً من المياه. لا يمكن أن نزيد تركزاتها سبب على الذوبان في الماء منخفضة، واستخدام برنامج تلفزيوني بدلاً من الماء يساعد على الحفاظ على درجة الحموضة منخفضة. وعلاوة على ذلك، تم الحصول على تركيز العمليات الحسابية باستخدام وحدة تخزين نهائي من 40 مل لكل حل من الأحماض الأمينية. وترد جميع الأحماض الأمينية التركيزات في الجدول 3. يجب التأكد من شطف الملعقة بين الأحماض الأمينية لتجنب التلوث. ونحن نوصي شطف مياه، متبوعاً بالمسح مع الإيثانول 70%-
  4. إضافة 40 مل من الماء النقي (أو برنامج تلفزيوني) في أنبوب 50 مل كل استخدام ماصة مصلية. كاب الأنابيب ودوامه أو اهتز بشدة حتى يذوب. يمكن أيضا استخدام المياه حمام سونيكيشن (درجة حرارة الغرفة، 130 ث، 40 كيلو هرتز) المساعدة في عملية الذوبان.
    ملاحظة: الحلول من الأحماض الأمينية التالية هي حساسة للضوء، وينبغي أن تغطي برقائق الألومنيوم: التربتوفان، فينيلالاناين، والتيروزين (التي تتكون من هياكل تشبه حلقة عطرية) وسيستين (رد الفعل-SH المجموعة)-

2. إعداد "حلول" SAP-AA

  1. إعداد 20 مل التﻷلؤ قنينات لتجميع ذاتي الببتيدات. ببتيد تجميع ذاتي معين، تعد قنينة واحدة كل حل المعدة من الأحماض الأمينية (ستبذل كل تركيبة في قنينة منفصلة)-
  2. استخدام توازن تحليلية عالية الأداء (مع سهولة قراءة وصولاً إلى 0.1 ملغ أو أقل)، تزن حوالي 1 ± 0.2 مغ ببتيد في الجزء السفلي من كل قنينة. كاب بعد وزنها وتسجيل وزن الببتيد في الفصل الضبط
  3. "الماصة؛" وحدة التخزين المناسبة للحل من الأحماض الأمينية (أعد في القسم 1) في كل قنينة تحتوي على الببتيد، بغية التوصل إلى تركيز المطلوب تجميع ذاتي الببتيد (0.1 مغ/مل الببتيدات طويلة بطول 16 الأحماض الأمينية أو 0.2 مغ/مليلتر بالنسبة الببتيدات أقصر بطول 8 الأحماض الأمينية).
  4. سنكيت لمدة 10 دقيقة في مياه حمام سونيكاتور (130 ث، 40 كيلو هرتز) في درجة حرارة الغرفة، ضمان الحلول داخل قنينة مغمورة تماما في حمام المياه-

3. إعداد المخدرات-[دمس] أو حلول الأسهم المخدرات-الإيثانول

  1. الجمع بين 1 ملغ المخدرات (في هذه الحالة، الكركمين مع [دمس] 100%)، وآخر 1 ملغ مع الإيثانول 100% لإنشاء حلول الأسهم اثنين.
    ملاحظة: لقد أضفنا 200 ميليلتر من [دمس] و 400 ميليلتر الإيثانول جعل [دمس] الكركمين والكركمين الإيثانول من الأرصدة التي كانت 5 ملغ/مل و 2.5 ملغ/مل، على التوالي، بسبب الذوبان متفاوتة في كل المذيبات؛ ومع ذلك، من المهم ملاحظة أنه ينبغي تعديل تركيز الأسهم تبعاً للمخدرات مسعور للفائدة. عوامل مثل الذوبان في المخدرات وتركيز البيولوجية الفعالة الهامة في تحديد هذه القيمة. أيضا، نضع في اعتبارنا أن الأسهم سوف تضعف معززات و 50-fold في صيغ [دمس] والإيثانول، على التوالي، عندما تقترن بحلول SAP-AA (انظر القسم 4). قد فضلت على إعداد حجم أكبر من الأسهم اعتماداً على عدد الصيغ المطلوبة – في هذه الحالة، سوف تستخدم أكثر من 1 ملغ المخدرات. ويمكن تخزين المخزون في-20 درجة مئوية؛ ذوبان الجليد ودوامه قبل الاستخدام.
  2. دوامة زجاجة لمدة 15 ق حل تماما المخدرات-

4. إعداد تركيبات العقاقير

  1. تحضير واضحة، أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لكل وضع. ومن المؤكد أن تسمية أنابيب مع المقصود تجميع ذاتي الببتيد والأحماض الأمينية (وتركيز)، والمذيبات المشارك.
  2. إضافة 10 ميليلتر من المخدرات-[دمس] الأوراق المالية أو الأسهم المخدرات-الإيثانول ميليلتر 20 إلى أنابيب ميكروسينتريفوجي المناسبة.
  3. ميليلتر 990 إضافة حلول حمض SAP AA للمناسبة المسمى أنابيب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على مخزون المخدرات-[دمس]، وميليلتر 980 إلى تلك التي تحتوي على مخزون المخدرات-الإيثانول. وهذا ينتج تركيبات المخدرات 1 مل مع الإيثانول [دمس] أو 2% 1%-
    ملاحظة: تم تركيز جميع الكركمين الصياغات النهائية 0.5 ملغ/مل وفقا للبروتوكول. مرة أخرى، هذا سوف تختلف عند استخدام مركبات أخرى مسعور و/أو بدءاً بتركيز مخزون مختلفة (راجع الخطوة 3.1)
  4. دوامة بشدة لمدة 30 ق والسماح بصياغات للراحة للحد الأدنى 30

5-"اختبار قابلية الذوبان في"

  1. بعد فترة استراحة، دوامة بقوة مرة أخرى لمدة 30 س.
  2. الطرد المركزي الصياغات في 14,220 س ز 1 دقيقة
  3. تحليل الجزء السفلي من الأنابيب ميكروسينتريفوجي لهطول الأمطار (بالمرئيات).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

للمخدرات مسعور، الكركمين، قمنا بإصدار صيغ استخدام 20 جميع القائمة بطبيعة الحال الأحماض الأمينية بتركيزات منخفضة، في تركيبة مع واحد ساب، EAK16-ثانيا، كإثبات لمبدأ. نحن أيضا اختبار الصيغ باستخدام [دمس] والإيثانول كمذيبات المشارك. وفي المجموع، هذا تنتج 40 الكركمين الصياغات، ك?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في صياغة الإجراءات، هناك العديد من الخطوات الحاسمة ونقاط للنظر في استكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولاً، كما أننا نعمل مع مختلف مكونات وتجمعات، خطوات دوامة متعددة في جميع أنحاء البروتوكول ضمان جميع التركيزات موحدة وصحيحة. بعض من الحلول مسعور، وتركيزات عالية من الأحماض الأمينية التي لا تزال لا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وتدعم هذا العمل "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" والتشغيل يمنح 42546 اجتماع الأطراف واجتماع الأطراف 119514.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
EAK16-ICanPeptide Inc.Custom peptideSequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EAK16-IICanPeptide Inc.Custom peptideSequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EAK16-IVCanPeptide Inc.Custom peptideSequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EFK8-IICanPeptide Inc.Custom peptideSequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
A6KECanPeptide Inc.Custom peptideSequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
P6KECanPeptide Inc.Custom peptideSequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
AlanineSigma-AldrichA7469-100GL-Alanine
IsoleucineSigma-AldrichI7403-100GL-Isoleucine
LeucineSigma-AldrichL8912-100GL-Leucine
MethionineSigma-AldrichM5308-100GL-Methionine
ProlineSigma-AldrichP5607-100GL-Proline
ValineSigma-AldrichV0513-100GL-Valine
PhenylalanineSigma-AldrichP5482-100GL-Phenylalanine
TryptophanSigma-AldrichT8941-100GL-Tryptophan
TyrosineSigma-AldrichT8566-100GL-Tyrosine
GlycineSigma-AldrichG8790-100GL-Glycine
AsparagineSigma-AldrichA4159-100GL-Asparagine
GlutamineSigma-AldrichG8540-100GL-Glutamine
SerineSigma-AldrichA7219-100GL-Serine
ThreonineSigma-AldrichT8441-100GL-Threonine
HistidineSigma-AldrichH6034-100GL-Histidine
LysineSigma-AldrichL5501-100GL-Lysine
ArginineSigma-AldrichA8094-100GL-Arginine
Aspartic AcidSigma-AldrichA7219-100GL-Aspartic Acid
Glutamic AcidSigma-AldrichG8415-100GL-Glutamic Acid
CysteineSigma-AldrichC7352-100GL-Cysteine
Dimethyl SulfoxideSigma-AldrichD4540-500MLDMSO
EthanolSigma-Aldrich277649-100MLAnhydrous
CurcuminSigma-Aldrich08511-10MGHydrophobic drug, curcumin
RottlerinEMD Millipore557370-10MGHydrophobic drug, rottlerin
PP2Enzo BML-EI297-0001Hydrophobic drug, PP2
Scintillation VialsVWR2650-66022-081Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide.
Falcon 50 mL Conical Centrifugation TubesVWR352070Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions.

References

  1. Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6728-6733 (2000).
  2. Davis, M. E., Motion, J. P. M., et al. Injectable self-assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells. Circulation. 111 (4), 442-450 (2005).
  3. Matson, J. B., Stupp, S. I. Self-assembling peptide scaffolds for regenerative medicine. Chem. Commun. 48 (1), 26-33 (2012).
  4. Tatman, P. D., Muhonen, E. G., Wickers, S. T., Gee, A. O., Kim, E., Kim, D. Self-assembling peptides for stem cell and tissue engineering. Biomater. Sci. 4 (4), 543-554 (2016).
  5. Keyes-Baig, C., Duhamel, J., Fung, S. -Y., Bezaire, J., Chen, P. Self-assembling peptide as a potential carrier of hydrophobic compounds. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7522-7532 (2004).
  6. Kumar, P., Pillay, V., Modi, G., Choonara, Y. E., du Toit, L. C., Naidoo, D. Self-assembling peptides: implications for patenting in drug delivery and tissue engineering. Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5 (1), 24-51 (2011).
  7. Wang, H., Yang, Z. Short-peptide-based molecular hydrogels: novel gelation strategies and applications for tissue engineering and drug delivery. Nanoscale. 4, 5259-5267 (2012).
  8. French, K. M., Somasuntharam, I., Davis, M. E. Self-assembling peptide-based delivery of therapeutics for myocardial infarction. Adv. Drug Deliv. Rev. 96, 40-53 (2016).
  9. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (8), 3334-3338 (1993).
  10. Bowerman, C. J., Nilsson, B. L. Self-assembly of amphipathic β-sheet peptides: insights and applications. Biopolymers. 98 (3), 169-184 (2012).
  11. Amidon, G., Lennernäs, H., Shah, V., Crison, J. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm. Res. 12 (3), 413-420 (1995).
  12. Shi, Y., Porter, W., Merdan, T., Li, L. C. Recent advances in intravenous delivery of poorly water-soluble compounds. Expert Opin. Drug Deliv. 6 (12), 1261-1282 (2009).
  13. Bawa, R., Fung, S. -Y., et al. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance cellular delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine through caveolae-dependent endocytosis. Nanomedicine. 8 (5), 647-654 (2012).
  14. Liu, J., Zhang, L., Yang, Z., Zhao, X. Controlled release of paclitaxel from a self-assembling peptide hydrogel formed in situ and antitumor study in vitro. Int. J. Nanomed. 6, 2143-2153 (2011).
  15. Wu, Y., Sadatmousavi, P., Wang, R., Lu, S., Yuan, Y., Chen, P. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance anticancer effect of ellipticine in vitro and in vivo. Int. J. Nanomed. 7, 3221-3233 (2012).
  16. Fung, S. Y., Yang, H., et al. Self-Assembling Peptide as a Potential Carrier for Hydrophobic Anticancer Drug Ellipticine: Complexation, Release and In Vitro Delivery. Adv. Funct. Mater. 19 (1), 74-83 (2009).
  17. Fung, S. -Y., Oyaizu, T., et al. The potential of nanoscale combinations of self-assembling peptides and amino acids of the Src tyrosine kinase inhibitor in acute lung injury therapy. Biomaterials. 32 (16), 4000-4008 (2011).
  18. Pacheco, S., Kanou, T., et al. Formulation of hydrophobic therapeutics with self-assembling peptide and amino acid: A new platform for intravenous drug delivery. J. Control. Release. 239, 211-222 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

127

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved