الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) بروتوكول لعينات جنينية وفرة منخفضة

Summary

هنا، نحن وصف إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) ورقاقة seq المكتبة إعداد بروتوكول لإنشاء التشكيلات الجانبية ابيجينوميك العالمية من عينات الدجاج منخفض-وفرة الجنينية.

Abstract

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) تقنية تستخدم على نطاق واسع لرسم خرائط التعريب histones بوستترانسلاتيونالي المعدلة أو المتغيرات هستون، عوامل النسخ أو تعديل الكروماتين الإنزيمات في موضع معين، أو على نطاق الجينوم. مزيج فحوصات رقاقة مع الجيل التالي التسلسل (أي رقاقة Seq) نهج قوية لكشف الشبكات التنظيمية الجينات على الصعيد العالمي وتحسين الشروح الوظيفية من الجينوم، لا سيما من تسلسل تنظيمي غير الترميز. عادة ما تتطلب البروتوكولات رقاقة كميات كبيرة من المواد الخلوية، مما حال دون إمكانية تطبيق هذا الأسلوب للتحري عن أنواع نادرة من الخلية أو خزعات الأنسجة الصغيرة. من أجل جعل المقايسة رقاقة متوافقة مع كمية المواد البيولوجية التي يمكن الحصول عليها عادة في فيفو خلال أوائل embryogenesis الفقاريات، يصف لنا هنا بروتوكولا رقاقة مبسطة التي عدد الخطوات اللازمة لإكمال تم تخفيض مقايسة للتقليل من فقدان عينة. هذا البروتوكول رقاقة قد استخدمت بنجاح للتحقيق التعديلات هيستون مختلفة في مختلف الدجاج الجنينية والأنسجة الماوس الكبار استخدام منخفضة إلى أرقام الخلية المتوسطة (5 × 10⁴ -5 × 10⁵ الخلايا). الأهم من ذلك، هذا البروتوكول متوافقاً مع تكنولوجيا رقاقة seq استخدام أساليب إعداد المكتبة القياسية، وبالتالي توفير ابيجينوميك العالمية خرائط في الأنسجة الجنينية جداً ذات الصلة.

Introduction

هيستون بوستترانسلاشونال التعديلات بصورة مباشرة في العمليات المعتمدة على الكروماتين المختلفة، بما في ذلك النسخ والنسخ المتماثل والحمض النووي إصلاح^1،،من²³. وعلاوة على ذلك، تظهر التعديلات المختلفة هستون إيجابية (مثلاً، H3K4me3 و H3K27ac) أو السلبية (مثلاً، H3K9me3 و H3K27me3) العلاقات المتبادلة مع التعبير الجيني ويمكن تعريفها بشكل عام تحتفل هيستون تفعيل أو القمعية، على التوالي من^2،،³. ونتيجة لذلك، ظهرت خرائط التعديل هيستون العالمية، كما يشار إلى خرائط ابيجينوميك، كأدوات قوية وعالمية تعليم وظيفيا جينومات الفقارية^4،5. على سبيل المثال، تسلسل تنظيمي القاصي مثل كما يمكن تحديد القدرة على استناداً إلى وجود التواقيع الكروماتين محددة (مثلاً، نشط معززات: H3K4me1 و H3K27ac)، التي تميزها عن مناطق المروج الدانية (مثلاً، المروجين نشطة: H3K4me3)^6،،من⁷⁸. من ناحية أخرى، توجد الجينات مع المهام التنظيمية هوية الخلية الرئيسية عادة مع مجالات واسعة الكروماتين ملحوظ مع H3K4me3 أو H3K27me3، استناداً إلى حالة نشطة أو غير نشطة ترانسكريبتيونالي الجينات الكامنة على التوالي^{9 ،10}. وبالمثل، يبدو التعبير عن الجينات هوية الخلية الرئيسية بشكل متكرر التحكم متعددة ومكانيا متفاوت القدرة على (أي، فائقة القدرة على)، التي يمكن تحديدها كمجالات واسعة بعلامات H3K27ac¹¹.

حاليا، يتم إنشاؤها هستون تعديل خرائط استخدام seq رقاقة التكنولوجيا، والتي توفر الدقة العالية، القطع الأثرية أقل وأقل ضوضاء وتغطية أكبر وأقل بالمقارنة مع النهج السابقة مثل رقاقة رقاقة (شريحة بالإضافة إلى [ميكروارس]) تكاليف¹². ومع ذلك، قد توليد خرائط ابيجينوميك باستخدام تكنولوجيا رقاقة seq قصورها المتأصلة، معظمها المرتبطة بالقدرة على القيام بنجاح برقاقة في عينات الفائدة. التقليدية رقاقة البروتوكولات المطلوبة عادة ملايين خلايا، التي حد خطوط انطباق هذا الأسلوب إلى المختبر في الخلية أو الخلايا التي يمكن بسهولة معزولة في فيفو (مثل خلايا الدم). في السنوات القليلة الماضية، عددا من البروتوكولات رقاقة معدلة متوافقة مع أرقام الخلية منخفض قد وصف^13،14،،من¹⁵¹⁶. بيد أن هذه البروتوكولات مصممة خصيصا أن يقترن ذلك بتسلسل الجيل المقبل (أي رقاقة seq) وهم عادة استخدام المخصص المكتبة إعداد أساليب^{13،14، 15 , 16}.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول رقاقة التي يمكن استخدامها للتحقيق هستون تعديل التشكيلات الجانبية باستخدام أرقام الخلية منخفضة إلى متوسطة (5 × 10⁴ -5 × 10⁵ خلايا) أما المكاني المحدد (أي رقاقة qPCR) أو على الصعيد العالمي (أي، رقاقة seq) (الشكل 1). عندما يقترن بتكنولوجيا رقاقة seq، يمكن استخدام بروتوكول رقاقة لدينا جنبا إلى جنب مع أساليب إعداد المكتبة القياسية، مما يجعلها متاحة على نطاق واسع للعديد من المختبرات¹⁰. تم استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في عدة علامات هيستون (مثلاً، H3K4me3 و H3K27me3 و H3K27ac) في الأنسجة الجنينية الدجاج مختلفة (مثلاً، العمود الفقري الأنبوب العصبي (SNT) وبرومينينسيس فرونتوناسال و epiblast). ومع ذلك، ونحن نتوقع أن يكون نطاق واسع ينطبق على غيرها من الكائنات الحية فيها عينات ذات صلة من الناحية البيولوجية و/أو سريرياً يمكن فقط الحصول على كميات منخفضة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان الألمانية، لا الموافقة على "رعاية الحيوان مؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) ضروري للقيام بتجارب الأجنة الدجاج. وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية، فقط التجارب مع الدجاج HH44 الأجنة (18 يوما) وكبار السن وتتطلب موافقة إياكوك. ومع ذلك، كانت الأجنة المستخدمة في هذه الدراسة في المراحل الأولى من التنمية الجنينية (أي HH19 (ح 72))-

ملاحظة: الغرض من هذا البروتوكول تقديم وصف مفصل للمقايسة رقاقة حيث أنها يمكن أن تكون فعالية جنبا إلى جنب مع qPCR أو تسلسل الجيل المقبل (أي رقاقة seq) للتحقيق في التعديلات هيستون في عينات قليلة-وفرة الجنينية (تتراوح من 5 × 10 ⁴-5 × 10 ⁵ خلايا لكل رد فعل رقاقة) وأنواع مختلفة من الأنسجة ( الشكل 1). ينبغي أن يكون البروتوكول تنطبق على التحقيق في ملامح ربط عوامل النسخ وتفعيل المشارك (مثلاً، p300). ومع ذلك، نظراً لوفرة هذه البروتينات التنظيمية الأدنى، إعداد أكبر من الخلية يرجح أن تكون المطلوبة (5 × 10 ⁵-5 10 ⁶ خلايا لكل رد فعل رقاقة).

1-إعداد البيض وميكروديسيكشن من "سنة الدجاج"

ملاحظة: يختلف الإجراء ميكروديسيكشنز من الناحية التقنية من الأنسجة للأنسجة ومن الحيوان نموذج إلى نموذج الحيوان. يصف هذا القسم بالتفصيل تشريح البروتوكول المستخدمة للحصول على عضدي سنت المقاطع من مرحلة HH19 أجنة الدجاج كمثال-

1. احتضان البيض الدجاجة القبعة البيضاء الخصبة، التي تم الحصول عليها من مربي محلية، في اتجاه أفقي في 37 درجة مئوية و 80% من الرطوبة لمدة 3 أيام للحصول على المرحلة HH19 أجنة الدجاج.
2. تحديد مراحل وفقا همبرغر وهاملتون الدجاج الجنينية الإنمائية التدريج نظام ¹⁷-
3. أداء ميكروديسيكشنز جميع الظروف الباردة؛ وخلاف ذلك، يمكن أن تتعرض للخطر سلامة الكروماتين.
4. عزل الأجنة HH19.
   1. لإتاحة الأجنة، استخراج 3 مل الزلال استخدام حقنه 10 مل بإبرة (0.90 × 40 مم) إلى انخفاض في بلاستوديرم.
   2. جعل فتحه صغيرة في البيض باستخدام مقص جيد وإضافة 1 مل من محلول لوك (انظر المواد التكميلية للوصفة) لتسهيل إزالة الأغشية الجنينية خارج-
   3. حقن محلول الحبر الأسود الهندي/لوك 10% باستخدام حقنه 1 مل بإبرة (0.55 × 25 مم ²) تحت بلاستوديرم جعل تصور الأجنة أسهل.
   4. قطع خارج الجنينية الغشاء الذي يحيط بالجنين باستخدام مقص غرامة الجراحية الطبية وملقط.
   5. استخدام ملعقة مثقبة لنقل الجنين إلى سم 4.5 طبق بتري يحتوي على 20 مل 1 × الحل PBS.
5. تشريح بعيداً في amnion والأجزاء المتبقية من الأغشية الجنينية الخارجة عن استخدام مقص جيد والملقط تحت ستيريوميكروسكوبي.
6. قص الجزء سنت عرضية على مستوى عضدي الجنين، تمتد كاودالي في منطقة الصدر لعزل سنت ( الشكل 2).
7. إزالة الأنسجة المحيطة أفقياً/بطنيا SNT (مثل، لوحة جانبية mesoderm والأديم الظاهر، notochord والشريان الاورطي) استخدام الملقط ( الشكل 2).
8. تزج كل قطعة SNT تشريح الدجاج في 3.5 سم طبق بتري يحتوي على 5 مل من الحارة (37 درجة مئوية) التربسين (التربسين/يدتا الحل 1: 250)-
9. وقف العلاج التربسين عند تفكك الأنسجة غير العصبية حول سنة الكشف عن تحت ستيريوميكروسكوبي.
   ملاحظة: الوقت تريبسينيزيشن يجب أن تكون رقابة مشددة لتجنب الإفراط في الهضم وتشتت الأنسجة العصبية، والاحتفاظ بالسلامة الهيكلية سنة-
10. بعد العلاج التربسين، إزالة الأنسجة الوسيطة وعسر المتبقية يدوياً إعداد القسم SNT نظيفة.
11. نقل المقطع SNT إلى أنبوب 1.5 مل وفلاش-تجميد من النتروجين السائل. مرة واحدة كافية SNT المقاطع المتراكمة (تجمع SNT الفروع من أجنة الدجاج ~ 30 لرد فعل شريحة واحدة)، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا كان يكفي الأنسجة الجنينية (أي 5 × 10 ⁵-5 × 10 ⁶ خلايا) يمكن تشريح من واحدة أو عدد قليل من أجنة الدجاج، ثم تجميد ليس من الضروري ومن الممكن المضي مباشرة إلى الخطوات التالية. يرجى الرجوع إلى دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الجدول 1-
    ملاحظة: تنبيه! النتروجين السائل بدرجة حرارة منخفضة للغاية، وارتداء حماية ملائمة.

2. البروتينات كروسلينكينج للحمض النووي: 1 يوم

ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات على الجليد، ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. إضافة 500 ميليلتر من دميم مع 10% FBS و 10 ميليلتر من 1 م نا butyrate مباشرة للأنسجة المجمدة، أو بدلاً من ذلك، فورا إلى الأنسجة تشريح الطازجة. مجانسة الخلايا بإعادة تعليق بلطف مع ماصة 1 مل.
   ملاحظة: إضافة butyrate نا اختياري ولكن يوصي إذا كان التحقيق acetylation هيستون. بدلاً من FBS دميم-10%، ويمكن حراكه عينات في برنامج تلفزيوني 1 x مع جيش صرب البوسنة 0.1%. إضافة FBS أو جيش صرب البوسنة اختياري، ولكن يسهل التكوير العينات في الخطوات اللاحقة استخدام الطرد المركزي.
2. إضافة 13.5 ميليلتر من 37% فورمالدهيد (1% فورمالدهايد النهائي) ووضعه على دوار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
   ملاحظة: تنبيه! الفورمالديهايد السامة.
3. إضافة 25 ميليلتر من 2.5 م جليكاين إلى الأنبوب ووضعه على دوار لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة آرو والفورمالديهايد.
4. تدور الأنبوب في 850 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في أجهزة الطرد مركزي في أعلى الجدول. تجاهل المادة طافية.
5. يغسل بيليه مرة واحدة مع 500 ميليلتر من البرد يغسل الطازجة المخزن المؤقت (انظر المواد التكميلية للوصفة)، أجهزة الطرد المركزي في 850 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتجاهل المادة طافية.

3. تحلل وسونيكيشن

1. تحلل كامل إعداد المخزن المؤقت (رطل) (انظر المواد التكميلية للوصفة) والبرد على الجليد. لمل 1، استخدم ميليلتر 950 رطلا وميليلتر 40 من تركيز مثبط البروتياز (25 س) 10 ميليلتر من 100% بمسف.
2. ريسوسبيند بيليه في 300 ميليلتر من رطل كامل من بيبيتينج ووضعه على منصة هزاز لمدة 10 دقائق في 4 ° C.
3. Sonicate العينات باستخدام الإعدادات التالية: Temp = 4 درجات مئوية، مجموع الوقت = 7 دقائق، “ على ” الفاصل الزمني = 30 s، “ قبالة ” الفاصل الزمني = 30 ثانية، السعة = 25%
   ملاحظة: الشروط سونيكيشن بحاجة إلى أن يكون الأمثل لكل الأنسجة وستختلف سونيكاتور المستخدمة. من المستحسن استخدام الإعدادات sonication أدنى أن تسفر عن الحمض النووي المنفصمة يتراوح من 200 إلى 600 شركة بريتيش بتروليوم في الحجم. القص يختلف اختلافاً كبيرا تبعاً لنوع النسيج، كانتيتاي وحجم sonication وظروف crosslinking والمعدات. يرجى الرجوع إلى دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الجدول 1-
4. تدور عينة سونيكاتيد في 16,000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه الحطام الخلوية.
نقل
5. ليساتي (المادة طافية) إلى أنبوب 1.5 مل طازجة.
   ملاحظة: في حالة انطلاق المواد التي تعتبر كافية لتجربتين رقاقة، ثم 300 ميليلتر من رطل كاملة يمكن إضافة إلى الكروماتين سونيكاتيد (أي الحجم النهائي: 600 ميليلتر)-
سونيكاتيد أوكتيلفينول
6. ميليلتر إضافة 30% 10 اثوكسيلاتي لكل 300 ميليلتر من ليساتي (التركيز النهائي: 1%)، ومزيج من بيبيتينج.
   ملاحظة: تنبيه! أوكتيلفينول اثوكسيلاتي ذات سمية حادة (عن طريق الفم، الجلد، الاستنشاق).

4. حضانة جسم

سونيكاتيد ميليلتر

1. قاسمة 330 من إلى أنبوبين 1.5 مل: 300 ميليلتر لرقاقة و 30 ميليلتر كعنصر تحكم الإدخال (10% المواد البداية). مخزن " 30 ميليلتر التحكم بإدخال نموذج " في-20 درجة مئوية.
   ملاحظة: إذا كان يتم تنفيذ اثنين من ردود فعل شريحة من نفس العينة، ثم ميليلتر 660 من سونيكاتيد ليستي يمكن أن توزع في ثلاثة أنابيب 1.5 مل (300 ميليلتر لرقاقة #1 و 300 ميليلتر لرقاقة #2 ميليلتر 60 كعنصر تحكم الإدخال (20% المواد بدءاً من كل شريحة) ).
2. بإضافة 3-5 ميكروغرام من جسم إلى ميليلتر 300 اليكووت سونيكاتيد الكروماتين وعكس لمزيج.
   ملاحظة: في هذه الدراسة، أنجز كل رد فعل رقاقة مع جسم معين لثلاثي H3 هيستون ميثليته في K4 (H3K4me3)، H3 هيستون دي ميثليته في K4 (H3K4me2)، ثلاثي H3 هيستون ميثليته في K27 (H3K27me3)، و H3 هيستون ثلاثي أسيتيليشن في K27 (H3K27me3). أن نجاح هذا البروتوكول تعتمد اعتماداً كلياً على نوعية الأجسام المضادة المستخدمة. ينبغي أن يكون الضد محددة وفعالة في إيمونوبريسيبيتيشن البروتين محددة. من المهم تحديد كمية الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في إيمونوبريسيبيتاتي البروتين كروسلينكيد-الحمض النووي المعقدة. أيضا، يمكن التحقق من خصوصية الجسم بوصمة عار الغربية التأكد من أن الكشف عن البروتين الصحيح. جسم يقوم بالكشف عن عدة نطاقات غير محدد لا ينصح لرقاقة.
3. ضع الأنبوب على منصة هزاز عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها (12-16 ح) لربط الأجسام المضادة الكروماتين-
   ملاحظة: يرجى الرجوع إلى دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الجدول 1-

5. إعداد حبات مغناطيسية: 2 يوم

1. الكوة 50-100 ميليلتر من الملاط حبة ز البروتين المغناطيسي لكل رد فعل رقاقة إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب على مدت
أغسل
2. الخرز المغناطيسي ثلاث مرات مع الحل الكتلة الباردة (انظر المواد التكميلية للوصفة) (4 درجات مئوية). إضافة 500 ميليلتر من حل كتلة باردة ومزيج بعكس أو التحريك. وضع الأنبوبة في حامل مغناطيسية وانتظر الخرز لتسوية على جانب الأنبوب. من أجل إيقاف السائل واضحة وتكرار. بعد الغسيل الأخير، إزالة جميع السائل مع تلميح هلام-تحميل-

6. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين

1. إضافة 300 ميليلتر من الكروماتين جسم زمنياً الخرز غسلها وعكس لخلط-
2. تدوير عمودياً على المدورة أنبوب في 4 درجات مئوية على الأقل 4 ح ربطه الجسم الخرز.

7. تغسل والوت وعكس في كروسلينكس

1. "البرد ريبا يغسل المخزن المؤقت" (انظر المواد التكميلية للوصفة) على الجليد، وتعيين حمام المياه إلى 65 درجة مئوية، وبريكول أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية.
تغسل حبات الكروماتين زمنياً أربع مرات في 1 مل ريبا البارد يغسل المخزن المؤقت
2. والحفاظ على الجليد. للقيام بذلك، إضافة 1 مل من البرد "ريبا يغسل المخزن المؤقت" ومزيج بعكس أو التحريك. ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وانتظر الخرز لتسوية على جانب الأنبوب. من أجل إيقاف السائل واضحة وكرر.
   ملاحظة: قد تحتاج إلى عدد يغسل مع "المخزن المؤقت ليغسل ريبا" الأمثل تبعاً لنوع العينة ووفرة عينة، والأجسام المضادة المستخدمة. عدد متزايد من يغسل يقلل من الخلفية ولكن أيضا انخفاض المبلغ الإجمالي للحمض النووي تم استردادها، والتي يمكن أن تسيء تحليل المتلقين للمعلومات التي قبكر أو ما يليها رقاقة
3. إضافة 1 مل من الشركة المصرية للاتصالات/50 مم كلوريد الصوديوم في الأنبوب ونقل الخرز الكروماتين زمنياً في الشركة المصرية للاتصالات/50 مم كلوريد الصوديوم إلى أنبوب جديد 1.5 مل [ميكروفوج] قبل إزالة السائل باستخدام حامل المغناطيسي، كما هو موضح أعلاه.
4. تدور الخرز في 900 غ س لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، ووضع الأنبوب يعود إلى صاحب التسجيل المغناطيسي، وإزالة جميع ما تبقى من الشركة المصرية للاتصالات مع تلميح هلام-تحميل-
5. إضافة 210 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت (انظر المواد التكميلية للوصفة) في درجة حرارة الغرفة وريسوسبيند بالتحريك.
6. الوتي لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية في كتلة حرارة أثناء الهز.
7. تدور الخرز في 16,000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ووضع الأنبوب في حامل المغناطيسي.
8. نقل المادة طافية (~ 200 ميليلتر) إلى أنبوب [ميكروفوج] جديدة حالما استقر الخرز.
9. ذوبان الجليد عينات التحكم الإدخال (30 ميليلتر) من-20 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة (المجمدة في الخطوة 4، 1) وإضافة 3 مجلدات شطف المخزن المؤقت (90 ميليلتر) وتخلط بإيجاز فورتيكسينج.
10. احتضان عينات الرقائق والتحكم في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها (12-16 ح) لعكس في كروسلينكس-

8. هضم البروتينات الخلوية والحمض النووي الريبي: 3 يوم

1. 8.1At الغرف درجة الحرارة وإضافة 1 حجم المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات كل أنبوب (لتمييع الحزب الديمقراطي الصربي) وعكس لخلط: إضافة ميليلتر 120 من الشركة المصرية للاتصالات إلى 120 ميليلتر من نموذج عنصر تحكم و 200 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات إلى 200 ميكروليتر من عينة رقاقة.
2. "إضافة رناسي" بتركيز 0.2 مغ/مل النهائي وعكس لخلط: إضافة 2.4 ميليلتر من 20 ملغ/مل رناسي A ميليلتر 240 من نموذج عنصر تحكم وميليلتر 4 من 20 ملغ/مل رناسي ألف إلى 400 ميليلتر من العينة رقاقة.
3. احتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية في حمام مائي ح 2 لهضم الجيش الملكي النيبالي-
4. "ك بروتيناز إضافة" إلى تركيز نهائي 0.2 مغ/مل وعكس لخلط: إضافة 2.4 ميليلتر من 20 ملغ/مل بروتيناز ك ميليلتر 240 من نموذج عنصر تحكم وميليلتر 4 من 20 ملغ/مل بروتيناز ك إلى 400 ميليلتر من العينة رقاقة.
5. إينكوباتي في 55 درجة مئوية في حمام مائي ح 2 هضم البروتين، وتنقية الحمض النووي-

9. رقاقة--قبكر

ملاحظة: تنفيذ استخراج الحمض النووي وتنقية، كما هو موضح في المواد التكميلية.

ملاحظة: التحقق من كفاءة سونيكيشن كما هو موضح في المواد التكميلية، للتأكد من الحصول على 200 إلى 500 bp شظايا من الحمض النووي ( الشكل 3).

ملاحظة: خطوة حاسمة لتحديد إذا عملت في الواقع الرقاقة. إذا كان من المعروف هناك مواقع الربط الجينوم لبروتين الفائدة، كبسولة تفجير يمكن المصممة ل PCR الكمي (qPCR) لتحديد إذا كانت المواقع المعروفة هي تحديداً أثري في "رقاقة الحمض النووي"، بالمقارنة مع مناطق مراقبة سلبية ليس من المتوقع أن تكون ملزمة كانديتاريخ البروتينات. على سبيل مثال، يظهر هذا العمل qPCR رقاقة النتائج المتحصل عليها مع رقائق المنجز ل H3K4me3 (مارك هيستون المروج النشط) و H3K27me3 (مارك هيستون المروج غير نشط) في أقسام SNT عزل من الأجنة الفرخ HH14 ( الشكل 4A ).

1. مزيج كل زوج التمهيدي (إلى الأمام أو عكس) في الأنبوب نفسه وتعد تركز أسهم في 20 ميكرومتر كل استخدام dH ₂ س (الجدول 2).
   ملاحظة: يجب أن يتم تقييم كفاءة كل زوج التمهيدي قبل تحليل رقاقة--قبكر-
2. استخدام عنصر تحكم الإدخال رقاقة و 20% الحمض النووي التي تم الحصول عليها في الخطوة 8.5 للتحسين قبكر.
   ملاحظة: إدخال الحمض النووي عادة تضعف x 20 (إلى 1% لانطلاق المواد المستخدمة في التفاعلات رقاقة) لتحليل qPCR.
3. لكل 10 ميليلتر من بكر، خلط المكونات التالية في أنبوب بكر: للحمض النووي mastermix، إضافة 2 ميليلتر من dH2O و 2.5 ميليلتر من مزيج سيبر خضراء 1 ميليلتر من الحمض النووي (من شرائح أو الإدخال 1%)؛ mastermix مع الإشعال ، إضافة ميليلتر 2.375 dH2O و 2.5 ميليلتر من مزيج سيبر الأخضر 0.125 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام وعكس مزيج.
4. خلط العينات قبل فورتيكسينج 2 s والطرد المركزي بإيجاز في 900 غ س لدقيقة 1
5. إجراء PCR الوقت الحقيقي (الإشعال وركوب الدراجات الشروط المستخدمة هنا يمكن العثور على مثال في الجدول 2 و الجدول 3، على التوالي).
   ملاحظة: تحليل البيانات رقاقة--قبكر: إشارات رقاقة تحسب كنسبة المدخلات. بإيجاز، مرة الأشعة المقطعية يتم الحصول على قيم لكل رد فعل qPCR، عامل إضعاف لدورات 100 أو 6.644 (log2 100) يتم تطبيق القيم المقطعية الحصول على ردود فعل الحمض النووي الإدخال. ثم، لمنطقة معينة من الفائدة (أي زوج التمهيدي)، إشارات رقاقة وتحسب كما يلي:
   تعديل الإدخال = Ct (مدخلات)-6.644
   إشارة رقاقة = 100 x POWER(2;average of adjusted Input-Ct value ChIP sample)

10-إعداد مكتبة شرائح seq؛ الإصلاح نهاية: يوم 4

1. إضعاف ما يصل إلى 100 نانوغرام من رقاقة الحمض النووي في 60 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت (انظر المواد الجدول).
2. إضافة 40 ميكروليتر من نهاية إصلاح ميكس و "الماصة؛" 10 مرات بلطف.
3. إينكوباتي في 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على cycler حرارية.
4. دوامة المغناطيسي الخرز وإضافة 160 ميكروليتر إلى الأنبوب الذي يحتوي على مزيج إصلاح نهاية. مزيج دقيق من بيبيتينج 10 مرات. احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
5. ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وانتظر الخرز لتسوية على جانب أنبوب...
6. من أجل إيقاف السائل واضح.
7. مع إبقاء الأنبوب على حامل المغناطيسي، إضافة 200 ميكروليتر طازجة 80% EtOH.
8. إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة 30 ثانية وتجاهل المادة طافية. كرر مرة واحدة...
9. إبقاء الأنبوب لمدة 15 دقيقة على حامل المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة. بمجرد بيليه الجافة، إزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسي.
10. ريسوسبيند بيليه في 20 ميكروليتر من استثارة المخزن المؤقت. بلطف "الماصة؛" 10 مرات مزيج دقيق.
11. إينكوباتي لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية
12. وانتظر الخرز لتسوية على جانب الأنبوب. نقل 17.5 ميكروليتر من المادة طافية إلى أنبوب جديد.

11. إعداد مكتبة شرائح seq؛ 3 أدينيلاتي ' ينتهي

1. ميكروليتر 12.5 إضافة مزيج أ-تراجع إلى الجديد من أنبوب ومزيج دقيق من قبل بيبيتينج برفق صعودا وهبوطاً 10 مرات. ضع الأنبوبة في cycler حرارية واحتضان وفقا للبرنامج التالي: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعقد في 4 درجات مئوية

12. إعداد مكتبة شرائح seq؛ سد محولات

1. ميكروليتر 2.5 إضافة لاستثارة المخزن المؤقت، وميكروليتر 2.5 من مزيج ربط وميكروليتر 2.5 من الفهرس محول الحمض النووي الريبي المناسبة. مزيج دقيق من قبل بيبيتينج برفق صعودا وهبوطاً 10 مرات.
2. إينكوباتي على cycler حرارية لمدة 10 دقائق في 30 °.
3. ميكروليتر إضافة 5 لإيقاف عملية ربط المخزن المؤقت ومزيج دقيق من قبل بيبيتينج 10 مرات.
4. دوامة المغناطيسي الخرز وإضافة ميكروليتر 42.5 للعينة. مزيج دقيق من بيبيتينج 10 مرات. احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
5. ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وانتظر الخرز تسوية على جانب الأنبوب ومن أجل إيقاف السائل واضحة
6. مع إبقاء الأنبوب على حامل المغناطيسي، إضافة 200 ميكروليتر طازجة 80% EtOH.
7. إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة 30 ثانية وتجاهل المادة طافية. كرر مرة واحدة.
8. إبقاء الأنبوب على حامل المغناطيسية، والسماح العينة أيردري على 15 دقيقة.
إزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسية
9. وريسوسبيند بيليه في ميكروليتر 52.5 استثارة المخزن المؤقت. مزيج دقيق من بيبيتينج 10 مرات. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة، ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وانتظر الخرز لتسوية على جانب الأنبوب. نقل 50 ميكروليتر من المادة طافية واضحة إلى أنبوب جديد.
10. دوامة المغناطيسي الخرز وإضافة 50 ميكروليتر إلى العينة. مزيج دقيق من بيبيتينج 10 مرات. احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
11. ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وانتظر الخرز تسوية على جانب الأنبوب ومن أجل إيقاف السائل واضح.
12. مع إبقاء الأنبوب على حامل المغناطيسي، إضافة 200 ميكروليتر طازجة 80% EtOH.
13. إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة 30 ثانية وتجاهل المادة طافية. كرر مرة واحدة.
14. الاحتفاظ بالانبوب على حامل المغناطيسي، واسمحوا الهواء العينة الجافة ل 15 دقيقة
إزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسية
15. وريسوسبيند بيليه في ميكروليتر 27.5 استثارة المخزن المؤقت. مزيج دقيق من قبل بيبيتينج 10 مرات.
16. إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة، ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وانتظر الخرز لتسوية على جانب الأنبوب. نقل 25 ميكروليتر من المادة طافية واضحة إلى أنبوب جديد.

13. إعداد مكتبة شرائح seq؛ التضخيم من "شظايا من الحمض النووي"

أنبوب

1. 12.5 مكان ميليلتر من القالب في مل 0.2 PCR. إضافة 2.5 ميكروليتر من التمهيدي PCR كوكتيل، 10 ميكروليتر من المحسن بكر ميكس-مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات. ضع الأنبوبة في cycler حرارية واستخدام الشروط الموضحة في الجدول 4-
2. دوامة المغناطيسي الخرز وإضافة 25 ميكروليتر إلى العينة. مزيج دقيق من بيبيتينج 10 مرات. احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
3. ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية، والانتظار الخرز تسوية على جانب الأنبوب ومن أجل إيقاف السائل واضح.
4. مع إبقاء الأنبوب على حامل المغناطيسي، إضافة 200 ميكروليتر طازجة 80% EtOH. احتضان في درجة حرارة الغرفة 30 ثانية وتجاهل المادة طافية. كرر مرة واحدة.
إزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسي
5. إبقاء الأنبوب على حامل المغناطيسية، واسمحوا الهواء العينة الجافة ل 15 دقيقة وريسوسبيند بيليه في ميكروليتر 32.5 استثارة المخزن المؤقت. مزيج دقيق من قبل بيبيتينج 10 مرات.
احتضان
6. بكر/لوحة الأنبوب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وضع الأنبوب أو لوحة بكر على الوقوف المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة، والانتظار الخرز تسوية على جانب الأنبوب ونقل ميكروليتر 30 من المادة طافية إلى أنبوب جديد.

14. إعداد مكتبة شرائح seq؛ التحقق من صحة مكتبة

ملاحظة: يتم تنفيذ التحقق المكتبة باستخدام نظام مراقبة جودة الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. إعداد للسلم: ميليلتر 1 الكوة سلم الدنا الجينومي في الأول أنبوب/جيدا وإضافة 3 ميليلتر من المخزن المؤقت عينة.

1. إعداد العينة: مزيج 1 ميليلتر من العينة مكتبة (10-100 نانوغرام/ميليلتر) مع 3 ميليلتر من المخزن المؤقت للعينة في أنبوب. زيادة ونقصان لأسفل، ومن ثم دوامة في السرعة القصوى لتدور س. 5 وصولاً إلى موقف العينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
2. تحميل العينات في نظام مراقبة الجودة-
3. بمجرد اكتمال التشغيل، تحليل النتائج بتعيين التباين في القيمة القصوى للتأكد من لا مبلمر موجودة في العينة ( الشكل 5)؛ وينبغي أن تتوافق مع مبلمر في عصابة حوالي 135 بي بي. إذا كانت موجودة حتى عصابة ضعيفة، الشروع في تنظيف ثانية بإضافة شطف المخزن المؤقت (انظر جدول المواد) يصل إلى وحدة تخزين 50 ميليلتر وإضافة 47.5 ميليلتر من حبات مغناطيسية مختلطة. إذا كان تركيز العينة منخفضا جداً (< 2 نانومتر)، والشروع في تشغيل الاسترداد (الخطوة 13.1)، واستخدام دورات 18 بدلاً من 15، ومع حجم العينة 12.5-ميليلتر غادر من الخطوة 12.16.
4. قياس المكتبات على حدة قبل قبكر باستخدام أدوات متوفرة تجارياً.
   ملاحظة: تجمعات المكتبات يمكن أن تكون متسلسلة استخدام المنظم مع واحد-قراءة 1 × 50 nt بروتوكول يهدف إلى ما يلي: 30 م/عينة-

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لتوضيح أداء البروتوكول رقاقة لدينا، أجرينا رقاقة-seq تجارب باستخدام المقاطع سنت المجمعة من أجنة الدجاج HH19، برومينينسيس فكي علوي من HH22 الدجاج الأجنة، واجنة الدجاج HH3 مرحلة التحقيق ملامح ملزمة مختلف التعديلات هستون (أي، H3K4me2، H3K27ac، H3K4me3، و H3K27me3). بمجرد الحصول على "رقاقة ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ابيجينوميك التنميط هستون تعديل استخدام seq رقاقة يمكن استخدامها لتحسين الشروح الوظيفية من جينومات الفقاريات في مختلف السياقات الخلوية^4،5،18. يمكن استخدام هذه التشكيلات ابيجينوميك، من بين أمور أخرى، لتحديد العناصر محسن، تعريف الدولة التن?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSA powder	Carl Roth	3737.3
Phosphate Saline buffer (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Tris-HCL pH 8.0	Sigma Aldrich	T1503
NaCl	Carl Roth	3957.2
EDTA	Carl Roth	8043.2
EGTA	Carl Roth	3054.2
Na-Deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750-24
N-lauroylsarcosine	Sigma Aldrich	61743-25G
Hepes	Applichem	A3724,0250
LiCl	Carl Roth	3739.2
NP-40	Sigma Aldrich	I3021-100ml
SDS	Carl Roth	1833
Protein G/magnetic beads	Invitrogen	1004D
37% Formaldehyde	Sigma Aldrich	252549-1L
Glycine
RNase	Peqlab	12-RA-03
Proteinase K	Sigma Aldrich	46.35 E
Na-butyrate	Sigma Aldrich	SLB2659V
Proteinase inhibitor	Roche	5892791001
SYBRgreen Mix	biozym	617004
dH2O	Sigma Aldrich	W4502
1 Kb ladder	Thermofisher	SM1333
Orange G	Sigma Alrich	03756-25
Agarose	Invitrogen	16500-500
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25200-072
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100)	Roth	3051.4
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium)	Gibco	31331-028
Gel loading tips Multiflex	A.Hartenstein	GS21
qPCR Plates	Sarstedt	721,985,202
384 well	Sarstedt	721,985,202
1.5 mL tubes	Sarstedt	72,706
100 - 1,000 µL Filter tips	Sarstedt	70,762,211
2 - 20 µL Filter tips	Sarstedt	70,760,213
2 - 200 µL Filter tips	Sarstedt	70,760,211
0.5 - 10 µL Filter tips	Sarstedt	701,116,210
H3K27me3 antibody	Active Motif	39155
H3K27ac antibody	Active Motif	39133
H3K4me3 antibody	Active Motif	39159
H3K4me2 antibody	Active Motif	39141
End Repair Mix	Illumina	FC-121-4001
Paramagnetic beads	Beckman Coulter	A63881
Resuspension buffer	Illumina	FC-121-4001
A-Tailing Mix	Illumina	FC-121-4001
Ligation Mix	Illumina	FC-121-4001
RNA Adapter Indexes	Illumina	RS-122-2101
Stop Ligation Buffer	Illumina	FC-121-4001
PCR Primer Cocktail	Illumina	FC-121-4001
Enhanced PCR Mix	Illumina	FC-121-4001
Genomic DNA ladder	Agilent	5067-5582
Elution Buffer	Agilent	19086
Sample Buffer	Agilent	5067-5582
Library Quantification Kit	Kapa Biosystems	KK4835 – 07960204001
Fertile chicken white eggs	LSL Rhein Main	KN: 15968
Needle (Neoject)	A.Hartenstein	10001
Syringe (Ecoject 10 mL)	Dispomed witt oHG	21010
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Centrifuge	Hermle	Z 216 MK
Thermoshaker	ITABIS	MKR13
Sonicator	Active Motive	EpiShear probe sonicator
Sonicator	Diagenode	Bioruptor Plus
Rotator	Stuart	SB3
Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes	Eppendorf	N/A
Timer	Sigma	N/A
Magnetic holder	Thermo Fisher	DynaMag-2 12321D
Table spinner	Heathrow Scientific	Sprout
Mixer	LMS	VTX 3000L
Real-Time PCR Cycler	Roche	Light Cycler; Serial Nr.5662
PCR Cycler	Applied Biosystems	Gene Amp PCR System 9700
DNA and RNA quality control system	Agilent	Agilent 4200 TapeStation System
Forceps	Dumont	5-Inox-H
Perforated spoon	World precision instruments	501997