JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذا البروتوكول وصف توليف دنا بوليميريز الحمض النووي تم التعديل من خلال مراقبة التغيرات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي القريبة من الأشعة تحت الحمراء باستخدام هلام التفريد وتصوير جل. المواد الهلامية الاكريلاميد تستخدم لتصوير عالية الدقة لفصل الأحماض النووية القصيرة، التي تهاجر بمعدلات مختلفة اعتماداً على حجم.

Abstract

لأي إنزيم، أساليب قوية وكمية مطلوبة من أجل توصيف الإنزيمات الأصلي وهندستها على حد سواء. للحمض النووي [بولمرس]، يمكن وصف تركيب الدنا باستخدام في المختبر الحمض النووي توليف مقايسة تليها هلام polyacrylamide التفريد. أن الهدف من هذا التحليل تحديد مقدار توليف الحمض النووي الطبيعية وتعديل الحمض النووي (م-DNA). هذه الطرق مفيدة بشكل خاص لحل النوكليوتيد مع القرار النوكليوتيدات واحدة، تمكن مراقبة خطوات الفردية خلال التوليف اليغنوكليوتيد الانزيمية. طبقت هذه الأساليب لتقييم مجموعة خصائص البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية مثل قياس معدل الحالة المستقرة الثوابت من الخطوات الفردية لتوليف الحمض النووي، ومعدل الخطأ لتوليف الحمض النووي، والحمض النووي ملزم تقارب. باستخدام تعديل مكونات بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، تريفوسفاتيس المعدلة نوكليوزيد بولمرس (NTP)، M-الحمض النووي، و/أو متحولة الحمض النووي، الفائدة النسبية للركيزة-دنا بوليميريز أزواج يمكن تقييم فعالية. هنا، نحن التفصيل المقايسة نفسها، بما في ذلك التغييرات التي يجب إجراؤها لاستيعاب وسم استراتيجيات مثل القرب من الأشعة تحت الحمراء فلوريسسينتلي المسمى الحمض النووي الحمض الخلوي الصبغي التمهيدي غير التقليدية. بالإضافة إلى ذلك، نحن مفصلة الخطوات التقنية الحاسمة لهلام الاكريلاميد صب والتشغيل، التي يمكن غالباً ما تكون صعبة من الناحية التقنية.

Introduction

[بولمرس] الحمض النووي إجراء توليف الحمض النووي دقيقة وفعالة وضرورية للحفاظ على سلامة الجينوم. القدرة على تجميع مئات النيوكليوتيدات في الثانية دون أخطاء أيضا يجعل الحمض النووي [بولمرس] أدوات أساسية في البيولوجيا الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية. ومع ذلك، هذه الخصائص تحد أيضا من طلبات الحصول على ركائز M-الحمض النووي؛ وبصفة عامة، الطبيعية الحمض النووي [بولمرس] لا يمكن توليف العديد من ركائز M-الحمض النووي يحتمل أن تكون قيماً، يرجح أن الواجب لارتفاع الضغط الانتقائي ضد استخدام ركائز غير قياسي في فيفو. ووضعت العديد من المجموعات نهج التطور الموجه لتوليد متحولة بولمرس الحمض النووي قادر على م-الحمض النووي التوليف1،2،3،4،5؛ وتوسعت هذه الجهود الأداة الحيوية للحمض النووي6،،من78.

لتقييم قدرة متحولة الحمض النووي [بولمرس] توليف م الحمض النووي، ونحن9،10، والبعض الآخر11،،من1213 عادة استخدام القياسات في المختبر للحمض النووي النشاط بوليميريز، التي يرد وصفها في هذه المخطوطة. في هذه التجارب، بولمرس الحمض النووي المحتضنة يشترك مع مسمى التمهيدي/قالب الطباعة على الوجهين وركائز ثلاثي نوكليوزيد؛ بالتفريد جل تقييم المنتجات. اعتماداً على مسألة تجريبية محددة، متحولة الحمض النووي [بولمرس]، كبسولة تفجير معدلة، قوالب معدلة، أو تريفوسفاتيس نوكليوزيد المعدلة يمكن استخدامها، تمكين البيوكيميائية التقييم المنتظم لنشاط إنزيم المسخ.

تاريخيا، كانت تعتمد هذه الاختبارات على تسمية 5 ' مشعة لتتبع الحمض النووي التوليف؛ الأكثر شيوعاً، استخدمت 32ف و 33ف؛ عادة، يتم تحقيق وسم استخدام T4 بولينوكليوتيدي كيناز11. ومع ذلك، نظراً لمدى الحياة المحدودة والتكلفة المرتفعة نسبيا لتسميات المشعة والتخلص المأمون، مجموعتنا بدلاً من ذلك يستخدم قرب من الأشعة تحت حمراء فلوروفوري اصطناعية 5 ' المسمى الحمض النووي. استخدام تصوير جل القريبة من الأشعة تحت الحمراء منخفضة تكلفة نسبيا، وقد لاحظنا حدود الكشف مماثلة للدراسات السابقة باستخدام تسميات المشعة (نتائج غير منشورة). ونحن، استنسخت بنجاح في الماضي9من الملاحظات، ولم نلاحظ أي اختلاف كمية كبيرة مع الثوابت معدل قياس سابقا (نتائج غير منشورة).

لتحليل حجم الحمض النووي، وبالتالي، مدى توليف الحمض النووي، نعتمد على أساليب التفريد polyacrylamide هلام وضعت أصلاً سانغر التسلسل14 قبل مجيء التفريد الشعرية15. يمكن استخدام المسافة الفاصلة أو التنقل كمقياس للوزن الجزيئي؛ تنسيق كبير، يمكن تحقيق العمودي polyacrylamide الجل القرار النوكليوتيدات واحدة، مما يتيح مراقبة كمية من النوكليوتيد الحمض النووي لفترات متفاوتة.

مجتمعة، هذه التجارب وسيلة قوية لتوصيف بوليميراز. نظراً للوقت الطبيعة الحساسة لردود الفعل والتحضير والرعاية اللازمة لتحقيق النتائج استنساخه. علاوة على ذلك، بينما هلام الاكريلاميد وسيلة فعالة للغاية لقياس تركيب الدنا، فضلا عن عديدة الحمض النووي تعديل ردود أفعال أخرى، مع قرار النوكليوتيدات واحدة، يمكن أن تمثل تحديا من الناحية التقنية. وسيمكن البروتوكول هنا نأمل أن المستخدمين لإجراء هذه التجارب مع تجنب الأخطاء الأكثر شيوعاً.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-"نشاط الإنزيم"

ملاحظة: هناك نوعان نموذجية للاختبارات التي يتم تشغيلها وكثيراً ما تميز بولمرس الحمض النووي باستخدام الأساليب الموضحة هنا. أنها تختلف في ما إذا كان أنها تميز نوعيا توليف الشاملة (التي تشمل العديد من الخطوات لتركيب الدنا) أو ما إذا كانت الكمية تركز على الخطوات الفردية. ونحن تصف الخطوات اللازمة لكل منها أدناه.
ملاحظة: نظراً لتجميع المواد المعقدة نسبيا، لتجارب الحساسية الوقت، نوصي بأن يتم تجميع جميع المواد مسبقاً. الوصفات لجميع عناصر حاسمة المقايسة مذكورة أدناه. الموردين التجاريين للمكونات المدرجة في الجدول للمواد-

  1. 10 × وصفه SF المخزن المؤقت (10 x SFB)
    ملاحظة: لدينا فحوصات، نحن نستخدم عادة الاقتطاع الطرفي ن من بوليميريز الحمض النووي جزء الأول من مستحرة مائية، المعروف شتوفيل (SF) 16 ، 17. وصفه هنا هو المخزن المؤقت المفضل لسادس 3 ، 13. يمكن الاستعاضة المخازن المؤقتة الأخرى اعتماداً على بوليميراز الدنا محددة.
    ملاحظة: يتم تركيز نهائي 10 × سادس المخزن المؤقت المكونات 500 مم تريس pH 8.5، 65 مم مجكل 2، 0.5 ملغ/مل جيش صرب البوسنة، 500 ملم بوكل (s)، والماء عالي النقاوة. قياسات لمل 1 من المخزن المؤقت لسادس، وكاف لفحوصات 100-200، تبعاً للحجم. ويمكن تخزين المخزن المؤقت إلى أجل غير مسمى في-20 درجة مئوية. أنبوب تريس، ميليلتر 65 م 1 MgCl 2، 50 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 10 ملغ/مل، و 0.0373 ز من بوكل (s) 1.5 مل
    1. الجمع بين 0.5 مل م 1. إضافة 385 ميليلتر من الماء عالي النقاوة للوصول إلى وحدة تخزين نهائي 1 مل.
  2. وصفه "المخزن المؤقت لتخزين" x 1 (س س 1)
    ملاحظة: تركيز 1 × المكونات العازلة النهائية هي 50 مم تريس درجة الحموضة 7.5، 1 مم DTT و 0.6 مم يدتا والغليسيرول 50%. الوصفة يجعل 20 مل س س 1.
    1. الجمع بين 0.012 غ DTT، 100 ميليلتر يدتا 0.5 متر، وملء أنبوب مخروطي 50 مل مع 40 مل من 100 ملم تريس (درجة الحموضة 7.5) جعل 2xSB. مزيج من فورتيكسينج-
    2. نقل 10 مل س س 2 أنبوب جديد 50 مل مخروطية وتمييع مع الجلسرين بإضافة 10 مل والغليسيرول الجديدة المخروطية.
  3. كوينتشينج المخزن المؤقت البرتقالي (قبو) وصفه
    ملاحظة: عند استخدام تسميات المشعة، المستخدمين سوف تستخدم غالباً ما bromophenol الأزرق و/أو زايلين زيلين نفط كصبغة تتبع التقدم التفريد. ومع ذلك، سوف فلوريسسي هذه الأصباغ في ضعيفة في المنطقة القريبة من الأشعة تحت الحمراء، والتداخل مع إشارة الحمض النووي. وهكذا، نحن نستخدم "ز البرتقالي" في مكانها لجميع ردود الفعل التي تحتوي على عينات. في حين أننا وجدنا "ز البرتقالي" تكون مناسبة لتتبع جل تحميل، وجدنا "ز البرتقالي" لتكون أقل اتساقا كصبغة الذي يتتبع التقدم التفريد؛ وهكذا، نقوم بتشغيل الممرات الفارغة التي تحتوي على بروموفينول الأزرق في الممرات الخارجية من الجل لا تحتوي على عينة من أجل تتبع التقدم المحرز في جل.
    1. الجمع بين 950 ميليلتر من ميثلامين 95% مع 25 ميليلتر من يدتا 0.5 م، و 25 ميليلتر الماء عالي النقاوة. أضف 1 حلج القطن لصبغ ز البرتقالي (~ 10 ملغ). مزيج من فورتيكسينج-
      تنبيه: ميثلامين السامة؛ ارتداء معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية) مثل القفازات والنظارات ومعطف مختبر، والتصرف كنفايات خطرة.

2. الاعتداء تشغيل

  1. الوصف النوعي للنشاط العام
    ملاحظة: لهذا الفحص، ونحن الحفاظ على تركيز ثابت للسل م عادة وتختلف الوقت. والهدف هو تقييم الخصائص العامة للبروتين بدلاً من قياس أي خطوة فردية. لإعداد رد فعل واحد، حجم تساوي عنصرين منفصلين، وهذا المزيج المزدوجة (كما هو موضح في الخطوة 2.1.1) وهذا المزيج دنتب (كما هو موضح في الخطوة 2.1.2)، سوف يكون أعدت بشكل منفصل، وثم ضم لإعطاء حجم النهائي ميليلتر 49. ثم سيشرع إضافة إنزيم 50 x ميليلتر 1 رد فعل. يمكن أن تؤخذ النقاط الزمنية المتغيرة؛ بشكل عام، نحن آرو في 0، 5 و 15 و 60 دقيقة. مزيج
    1. "إعداد من الحمض النووي" المزدوجة
      ملاحظة: مزيج مزدوجة تتألف من 10 × اليغنوكليوتيد التمهيدي وقالب اليغنوكليوتيد، سادس المخزن المؤقت والماء عالي النقاوة. الحجم الإجمالي إضافة إلى كل رد فعل هو 25 ميليلتر. 1 ميليلتر من إنزيم ستضاف إلى مزيج الرئيسي مباشرة قبل البدء بالتجربة-
      ملاحظة: لفحوصات لدينا، ونحن عادة استخدام قالب 45-مير وأول كتاب مير 18 أو 23-مير. بينما يمكن استخدام عدد من أطوال مختلفة، نحن نميل إلى استخدام هذا الطول لأن المنتجات (تتراوح بين 18 النيوكليوتيدات النيوكليوتيدات 45) يتم حلها بسهولة على مستوى النوكليوتيدات واحدة باستخدام البروتوكولات التفريد جل وصف. منتجات اليغنوكليوتيد زيادة في الطول، قد تكون صعبة لحل هذه المنتجات في قرار واحد النوكليوتيدات.
      ملاحظة: في تجاربنا، نحن نستخدم 5 ' تسمية صبغة الفلورسنت القريبة من الأشعة تحت الحمراء على حبلا التمهيدي لمراقبة المنتجات التمهيدي. نحن شراء مخصص النوكليوتيد المركب إذ تضع هذا التعديل؛ ومع ذلك، يمكن أن تدرج هذه التسمية باستخدام أي عدد من استراتيجيات التوسيم الاصطناعية بعد. لن يتم تسمية اليغنوكليوتيد القالب وحتى أنه لم يلاحظ استخدام تصوير جل. لكلا النوكليوتيد، نقوم بتخزين النوكليوتيد في 100 ميكرون في 10 ملم تريس (pH 8)، 1 مم يدتا.
      ملاحظة: نظراً لأننا نحتفل فقط التمهيدي، فائض شقين في قالب يستخدم للتأكد من أن جميع أجهزة الإشعال (أنواع الحمض النووي أن يلاحظ) هي تعتيق للقالب. تركيز المزدوجة الأخيرة في رد الفعل هذا هو 40 نانومتر.
      ملاحظة: الأصباغ الفلورية القريبة من الأشعة تحت الحمراء غالباً ما تكون حساسة للضوء إلى حد ما؛ عندما يكون ذلك ممكناً، ونحن تغطية التمهيدي (وأي حل الذي يحتوي على الدليل التمهيدي) مع إحباط. وهذا يشمل جل polyacrylamide أثناء تشغيله.
      ملاحظة: فيما يلي مثال ممثل لتوليف 2 ' و M-الحمض النووي.
      1. تمييع التمهيدي 1 وقالب 1 (انظر الجدول للمواد لتسلسل) إلى 1 ميكرومتر من كل في الماء عالي النقاوة.
      2. لكل رد فعل المقايسة، في أنابيب منفصلة، والجمع بين 5 ميليلتر من 10 × سادس المخزن المؤقت، 2 ميليلتر من 1 ميكرومتر التمهيدي 1، 4 ميليلتر من 1 ميكرومتر قالب 1، و 13 ميليلتر من الماء عالي النقاوة في أنابيب متوافقة مع cycler حرارية.
      3. يصلب مزدوج في ثيرموسيكلير استخدام البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة دقيقة 2, 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 40 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، عقد في 25 درجة مئوية. البرنامج محددة قد تختلف تبعاً لدرجة الحرارة انلينغ التمهيدي/قالب الطباعة على الوجهين. بشكل عام، فإننا نفضل أن تشمل الخطوة 5 دقيقة واحدة على الأقل عند درجة حرارة انلينغ ومن ثم آخر خطوة 5-دقيقة عند درجة حرارة 5-10 درجات تحت درجة حرارة انلينغ.
    2. إعداد 2 x dNTP الخليط
      ملاحظة: اعتماداً على التجربة، فإنه من الممكن استخدام دنتبس متغير وتركيزات دنتبس. عادة، ونحن نستخدم 50-200 ميكرومتر في رد الفعل.
      1. تحضير 25 ميليلتر محلول يحتوي على 100 ميكرون لكل 2 ' و NTP. تخزين M-السل في 100 مم-
    3. إعداد 50 × إضعاف البروتين
      ملاحظة: للتخزين على المدى الطويل، ينبغي أن تظل الإنزيمات في-20 درجة مئوية في 1xSB. عند إزالة من الثلاجة-20 درجة مئوية، وينبغي إبقاء الإنزيمات على الجليد في جميع الأوقات من قبل، بالإضافة إلى مزيج الرئيسي. تخفيف إنزيم ينبغي الطازجة من المخزون تتركز كل يوم. الأسهم إنزيم مركزة ينبغي أن تعاد إلى الثلاجة-20 درجة مئوية مباشرة بعد استخدام.
      ملاحظة: نظراً لأن نقيم أساسا متحولة الحمض النووي [بولمرس]، نحن فقط استخدام الإنزيمات التي تم الإعراب عنها وتنقية في المختبر باستخدام الأساليب المتبعة 9 ، 10. يجب أن يكون المستخدمون لشراء تجارياً [بولمرس]، الحذر من المخازن المؤقتة الأمثل للبروتينات المختلفة ومدى توافقها مع المخازن المؤقتة الموضحة هنا.
      ملاحظة: سوف تتباين تركيزات الإنزيم لكل تجربة. هنا، نحن إظهار مثال ممثل 2 ' تركيب الدنا و.
      1. لجعل حل إنزيم 10 نانومتر، وتمييع 1 ميليلتر من int الإنزيمس س س 1 جعل تركيز إنزيم نهائي 50 x. ينبغي أن يكون تركيز الحل 50 x 500 نانومتر. على سبيل المثال، إذا كان تركيز إنزيم الأسهم 50 ميكرومتر، إضافة 1 ميليلتر الأسهم الإنزيم إلى ميليلتر 99 1 × SB.
        ملاحظة: حيث يتم عادة تخزين الإنزيم في والغليسيرول 50%، الحل لزج نوعا ما. حتى في حالة استخدام الماصات درجة عالية من الدقة، لا ننصح بيبيتينج أقل من 0.5 ميليلتر، نظراً لأهمية والدقة خلال تمييع الإنزيم.
    4. الشروع في الإنزيم
      1. تعيين درجة حرارة حمام الجافة إلى 50 درجة مئوية.
      2. ميليلتر إضافة 24 من طابقين ملدنة مزيج (راجع الخطوة 2.1.1) إلى 25 ميليلتر من x dNTPs 2 (راجع الخطوة 2.1.2)-
      3. 9.8 إزالة ميليلتر المخلوط في خطوة 2.1.4.2 وإضافة إلى 20 ميليلتر من قبو (انظر الفرع 1-3 للوصفة). قاسمة هذا بمثابة " لا إنزيم " السيطرة وينبغي الحصول على لتشغيل كل.
        4. إضافة
      4. ميليلتر 0.8 50 x إنزيم (راجع الخطوة 2.1.3.1) لهذا المزيج الوجهين/دنتب. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً مع ميكروبيبيتي حجم كبير لخلط دقيق.
      5. بعد 5 و 15 و 60 دقيقة، إخماد رد فعل عن طريق إزالة 10 ميليلتر لكل حل رد فعل وإضافة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي الذي يحتوي على 20 ميليلتر قبو (كما هو موضح في القسم 1.3)-
      6. بمجرد مروي، ردود فعل يمكن تخزينها تحت إحباط إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية أو-20 درجة مئوية.
        ملاحظة: للحصول على توصيف الكمية من الخطوات الفردية لتركيب الدنا م، يمكن تشغيل مقايسة مشابهة جداً كمياً الحصول على معلمات ميكايليس-مينتين. يستخدم هذا التحليل كل من نفس المواد. ويمكن قياس بارامترات ميكايليس-مينتين دنتب؛ وفي هذه الحالة، الفرق الأكثر أهمية أنه، بدلاً من إضافة هذا المزيج المزدوجة إلى مزيج دنتب، فإنه يضيف المزيج المزدوجة مع الإنزيم إلى سلسلة من الحلول x dNTP 2. وبالمثل، يمكن قياس بارامترات ميكايليس-مينتين للحمض النووي المزدوجة. يجب أن تتحقق الشروط المحددة لإرضاء الافتراضات اللازمة لاستخدام المعادلة ميكايليس-مينتين. هذه الشروط، والميكانيكا الأساسية للمقايسة، موضحة جيدا في أساليب سابقة المادة 11-

3. هلام استشراد

ملاحظة: نظراً لأن تتدفق الجل الوقت الحساسة، يتم تجميع جميع المواد مسبقاً. الوصفات لجميع عناصر حاسمة المقايسة مذكورة أدناه؛ موردي المواد المدرجة في الجدول للمواد-

  1. إعداد مادة اكريلاميد هلام الاكريلاميد 20 ٪.
    ملاحظة: هذه وصفه تجعل 1 لتر مخلوط الاكريلاميد؛ ويستخدم حوالي 120 مل من هذا الحل كل جيل. تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة تحت إحباط لمدة تصل إلى سنة واحدة.
    تنبيه: بولياكريلاميدي الأعصاب. من المهم ارتداء القفازات ومعطف معمل خلال جميع الخطوات لصب جل. إذا كان يحصل بولياكريلاميدي على قفازات، استبدال القفازات فورا. إذا لم يتم بلمرة الاكريلاميد، وضع المواد الملوثة في كيس نفايات مسمى بولياكريلاميدي-
    ملاحظة: استخدمت خلط 40% الاكريلاميد التي تحتوي على مادة اكريلاميد 38.67% و 1.33% مكررا-مادة اكريلاميد لمركب نسبة كروسلينكير من خلال في هذا البروتوكول.
    1. ز تزن 17 من خلط TBE مسحوق. تزن ستة أجزاء منفصلة من 70 غم يوريا (إجمالي 420 ز)-
      ملاحظة: يجب إضافة اليوريا في الأجزاء. نجد أنه من الأفضل إلى تقسيمه إلى ستة أجزاء.
      2. إعداد
    2. 2 L كوب بلاستيك على طبق من إثارة. إضافة قضيب إثارة كبيرة واحدة الكأس. تغطية الكأس بإحباط عند خلط لمنع الرش.
    3. إضافة 500 مل محلول الاكريلاميد 40% في الكأس. تأكد من أن الحل هو إثارة.
    4. إضافة سابقا وزنه خارج TBE. إضافة قاسمة واحد من اليوريا. السماح للحل المزيج. اليوريا يذوب ببطء، وقد يظهر ضبابي والأبيض عند الإضافة الأولى. إضافة مختبرين المتبقية من اليوريا ببطء إلى الخليط على مدى ساعة المقبلة. اسمحوا الحل مزيج حتى أنها واضحة تماما وعديم اللون-
      ملاحظة: عادة، يسمح هذا لإثارة بين عشية وضحاها. إذا لا تزال لا حل الحل إضافة مختبرين صغيرة من المياه والانتظار لليوريا حل-
    5. إضافة اليوريا سيزيد من حجم ما يقرب من 1 ل. إضافة المياه إلى زيادة الحجم بالضبط 1 ل.
    6. مخزن في زجاجة زجاج ملون 1 لتر أو غطاء الزجاجة مع رقائق الألومنيوم.
  2. يصب هلام الاكريلاميد.
    ملاحظة: عند التعامل مع ألواح الزجاج، كن حذراً تجنب الاتصال بين ألواح الزجاج وأي سطح صلب. هذا مهم خصوصا في ذلك معالجة الخام قد تسبب الشقوق الصغيرة في الزجاج؛ قد لا تظهر هذه الشقوق حتى الجل قيد التشغيل، والذي يحدث عند درجة حرارة أعلى. ونحن نستخدم الفلين حلقات لمنع هذا الاتصال غير المرغوب فيها.
    1. نظيفة لوحات لوحات جل اثنين 33 × 42 سم
      1. الحصول على واحد حقق ولوح unnotched واحد. وضع لوحات على حلقات منفصلة كورك.
      2. لوحات شطف جيدا بالماء والصابون. تأكد من أن لا توجد الشرائط الصابون أو جل البقع تركوها وراءهم.
        3. جعل
      3. علما بأي جانب من الخرز لوحة كميات أقل من المياه. هذا الجانب هو هلام تواجه الجانب.
        ملاحظة: إذا كان يتم تشغيل الهلام على الجانب الآخر من اللوحة، فإنه قد جعل نقل جل صعبة.
    2. الجاف للوحات
      1. استخدام المناشف الورقية لتجفيف كل الوجوه لكل لوح.
      2. استخدام مساحات مهمة حساسة لتجفيف المناطق المتبقية. إيلاء اهتمام خاص لحواف الصفائح حيث سيتم تطبيق الشريط.
      3. شطف ألواح الزجاج مع الإيثانول ~ 70%، ومسح مع مساحات المهمة.
        4. تأكد من عدم وجود لا ألياف منشفة ورقية
      4. أو قطرات الماء. وهذه يمكن أن يسبب فقاعات عند سكب الهلام.
    3. إضافة الفواصل
      1. الحصول على الفواصل 0.75 ملم. تشغيل أصابع القفاز تحت الماء دي والرطب بلطف الفواصل مع أصابع القفاز.
        2. لوحة
      2. مكان الفواصل على طول حواف طويلة مسنن. تنظيف أي المياه التي يتم رشها على بقية اللوحات. تأكد من محاذاة الفواصل مع لوحة زجاج ولا يخيم على الحافة-
    4. ختم جل
      1. وضع قفازات الجافة. الجاف لحواف الزجاج مرة أخرى مع مساحات مهمة حساسة-
      2. محاذاة لوحة unnotched العلوي فوق لوحة مسنن ومن الأسفل ببطء للضغط على اللوحات ضد بعضها البعض. الاختيار مرة أخرى للتأكد من أنه قد تمت محاذاة حواف كل ألواح.
      3. استخدام هلام الشريط، وضع الشريط عبر جميع الحواف باستثناء الجزء العلوي. تأكد من محاذاة بالتساوي الشريط ومختومة محكم. يمكن تطبيق الشريط في اقتراح واحد، أو يمكن أن يتم كل جانب على حدة. قص طرفي الشريط بشفرة حلاقة.
      4. إضافة طبقة إضافية من الشريط إلى أسفل الجل. أكثر صرامة الشريط، وأقل احتمالاً سوف تسرب الهلام عند سكب.
      5. مقطع جانبي ساندويتش الزجاج مع المشابك البيضاء. إضافة قصاصات 3 على كل جانب، ومقاطع 4 إلى الأسفل.
    5. سكب الهلام
      1. جعل 3 مل حل فوق كبريتات الأمونيوم 10% (الجزائرية) بحل فوق كبريتات الأمونيوم 0.3 ز وتمييع يصل إلى 3 مل في الماء عالي النقاوة.
        ملاحظة: هناك حاجة إلى 1.2 مل من وكالة الأنباء الجزائرية كل جيل. تاريخ الأنبوب بعد إجراء ذلك. حل وكالة الأنباء الجزائرية وتنتهي في 2 أسابيع، ويجب أن يبقى على 4 درجة مئوية.
      2. نقل ميليلتر 125 من تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) إلى أنبوب منفصل ميكروسينتريفوجي.
        ملاحظة: تيميد السامة؛ ارتداء معدات الوقاية الشخصية مثل القفازات، النظارات الطبية ومختبر معطف كلما المناولة.
        3. الحصول على زجاجة بخ
      3. وإزالة القمع أشار. قياس 125 مل الماء في اسطوانة تخرج وإضافة إلى القمقم. علامة مستوى المياه في خارج القمقم مع علامة دائمة. تجاهل المياه. يمكن إعادة استخدام زجاجة بخ تم التعديل هذا إلى أجل غير مسمى مع التنظيف المناسبة (انظر أدناه)-
      4. إعداد حلقات مفلن بجوار الحوض حتى لا يكون هناك مكان لوضع الجل مرة واحدة سكب. ضع ساندويتش لوحة هنا. وضع فلين في الحوض حتى لا يكون هناك مكان للجلوس اللوحات حين يجري سكب الهلام. سوف سكب الهلام ساندويتش لوحة الزجاج بزاوية، حتى الأسفل ستقع في كورك في حين الأعلى سوف تقع على حافة الحوض. تأكد من أن هناك منصات تحت هذه المناطق في حال polyacrylamide يصب الجميع
      5. "وكالة الأنباء الجزائرية مكان" حل والحل تيميد على الجانب الآخر من الحوض، مع إفراغ بخ زجاجة. ضع المشط جيدا مع العدد المطلوب من الآبار على جانب الحوض مع اللوحات. وضع المشابك 4 القريبة.
        ملاحظة: هو الخطوة التالية في الإجراء حساسة جداً من الزمن. تكون مستعدة للتحرك بسرعة من خلال هذه الخطوات. وهناك كمية محدودة من الوقت للحصول على خليط بين لوحات قبل أن بوليميريزيس. يتم ترتيب جميع مكونات (ميكروبيبيتيس مسبقاً إلى وحدة التخزين الصحيحة، والحلول، وألواح الزجاج) بعناية صب الهلام، في أسرع وقت ممكن. إذا بلمرة أبطأ هو المطلوب، يمكن أن يكون النصف تركيزات APS وتيميد؛ وهذا سيتطلب وقتاً أطول بلمرة.
        6. صب
      6. الحل هلام الاكريلاميد 20% في زجاجة بخ إلى درجة ملحوظة. من أجل حل جل أكثر قليلاً فوق خط واضح، حتى لا يكون هناك ما يكفي من الحل في حالة الثقوب الصغيرة. وهذا ما يقرب من 120 مل من محلول جل.
      7. 120 إضافة ميليلتر من تيميد و 600 ميليلتر من وكالة الأنباء الجزائرية بحل جل بولياكريلاميدي في زجاجة بخ في نفس الوقت. بسرعة إضافة ميليلتر 600 إضافية لوكالة الأنباء الجزائرية بحل جل polyacrylamide.
        8. سرعة كاب
      8. زجاجة بخ ودوامه. ضع لوحة شطيرة في الحوض-
        9. تبدأ
      9. صب. إلا ينبغي أن 1-2 دقيقة بغية تجنب البلمرة. ببطء ولكن باطراد، إضافة ضغط على زجاجة بخ حتى حل جل يخرج بالتساوي. إذا كان الحل يبدأ يكون غير منتظم من زجاجة بخ، الإفراج عن الضغط حتى يصبح مبالغا فيها الزجاجة، واستئناف صب. مراقبة للتأكد من حل جل تغطي جميع المجالات، ومن عدم حدوث أي تسرب من أي من الجانبين. لإزالة فقاعات الهواء، تغيير زاوية اللوحات. الفقاعات سوف البوب في الجزء العلوي، وسوف تعمل بشكل أسرع إذا كانت الزاوية أشد انحدارا. ما زالت تتدفق حتى وصلت إلى الجزء العلوي من منطقة مسنن الحل وهي تفيض قليلاً على حافة مسنن. إزالة جميع فقاعات الهواء-
        ملاحظة: إذا تسرب ساندويتش لوحة، أو ليس هناك حل جل ما يكفي وأن الحل لا تصل إلى الجزء العلوي من اللوحات، ولا يمكن استخدام الهلام. انتظر حتى قد بلمرة الهلام، وتنظيف تبعاً لذلك.
        10. إضافة
      10. المشط جيدا ساندويتش لوحة. 4 مكان المشابك على مشط اضغط لأسفل والسماح للتوزيع حتى الآبار.
      11. بسرعة التخلص من حل جل المتبقية في زجاجة بخ في النفايات المسمى بولياكريلاميدي. شطف خارج المياه زجاجة بخ مع دي 2-3 مرات، من خلال فوهة بخ.
        ملاحظة: من المهم إجراء هذا تنظيف بسرعة للحيلولة دون انسداد في زجاجة بخ بولياكريلاميدي. إذا كان يحدث حتى كمية صغيرة من البلمرة داخل الفوهة، سيتم سكب هلام القادم جداً ببطء وعدم نجاح. تجاهل زجاجة بخ إذا لم يحدث البلمرة.
  3. تشغيل هلام الاكريلاميد
    1. بينما هو يجري بلمرة هلام، جعل 1 x TBE المخزن المؤقت قيد التشغيل. يذوب ز 17 من خلط TBE الصلبة في 1 لتر الماء عالي النقاوة. اهتز المخزن المؤقت حتى يذوب كل من TBE.
    2. إزالة كافة المقاطع الموثق من ساندويتش لوحة.
    3. استخدام شفرة حلاقة لقص الشريط وإزالة الشريط من جميع حواف ساندويتش لوحة.
    4. نظيفة قبالة جميع هلام مبلمرة من الأسطح الزجاجية. استخدام الشفرة على طول الحواف كشط قبالة جل المتبقية. مسح لوحات بالماء لإزالة بقايا polyacrylamide قدر الإمكان ومناشف ورقية. اكريلاميد الزائدة و/أو الشريط يمكن حرق غالباً أثناء التفريد جل.
    5. إزالة المشط جيدا عن طريق دفع بالتساوي على كلا الجانبين.
    6. استخدام الشفرة لقطع جل الزائدة على طول الجزء العلوي من لوحة ساندويتش. الشريحة على طول حافة مسنن لصفيحة.
    7. استخدام المحاقن والمياه دي شطف الآبار وإزالة الحطام في الآبار. تأكد من كل بئر يمكن أن تملأ بالماء، ويتم حظره بواسطة جل مبلمرة الزائدة.
    8. مكان ساندويتش لوحة في الجهاز، بحيث تواجه لوحة أطول إلى الخارج، وتواجه الفضاء مسنن إلى الداخل-
    9. إضافة القصاصات مقطع لوحة لوحة ساندويتش والألمنيوم جنبا إلى جنب مع الجهاز. إضافة إلى خارج اللوحة تعزيز حتى التشغيل.
    10. TBE إضافة المخزن المؤقت لتغطية الشقوق قاعدة وما يكفي لتغطية الآبار في الجزء العلوي. TBE العازلة يمكن تصفيتها واستخدامها للمواد الهلامية حوالي 5-
    11. لوحات دافئة لمدة 20 دقيقة قبل تشغيل التفريد جل في 50 جورج
    12. بعد الاحترار اللوحات وتنظيف الآبار. استخدام المحاقن والمخزن المؤقت TBE في الحمامات لبخ أملاح المخزن المؤقت المتبقية من الآبار. هل هذا عدة مرات لضمان تنظيف الآبار. في حالة عدم تنظيف الآبار، سوف النزاع العصابات والصورة لن يكون التفسير. على الرغم من أن هذا يمكن أن يكون مضيعة للوقت، وقد وجدنا أنه لا بد من الحصول على بيانات جيدة.
    13. إلى لين الأبعد في كلا الجانبين، بيبيت 5 ميليلتر من ميثلامين 95% باللون الأزرق بروموفينول. وهذا هو نفس الحل كقبو، ولكن مع بروموفينول الأزرق بدلاً من "البرتقالي غ." وهذا سيوفر البصرية على المكان لقطع الجل للتصوير، وكيف الآن إلى الأسفل في الحمض النووي وتشغيل-
    14. لكل عينة لتحليل (تم إنشاؤه في المقطع 2.1.1)، بإضافة 3 ميليلتر إلى بئر واحدة من الجل. بعد تحميل جميع العينات، انتظر 1 دقيقة للعينات لتسوية.
    15. وضع حدود قصوى على الحمامات البلاستيكية كلا من أعلى وأسفل. إرفاق الأسلاك للجهاز. الأحمر يشير إلى التهمة الكهربائية الإيجابية، حيث ينبغي أن يكون في الجزء السفلي حيث يعمل الحمض النووي نازلا.
    16. الأسلاك إرفاق إلى دولة المصدر وتعيين إلى تشغيل دبليو 50-55 الجل لحوالي 3 ح أو حتى بروموفينول وتشغيل الجبهة صبغة زرقاء على الأقل 2/3 من أسفل الجل.
  4. التصوير الجل
    ملاحظة: هذا جل رقيقة للغاية ويمكن أن تكون صعبة للتعامل مع. يجب اتخاذ الحذر الشديد لمنع النسخ من القرص المضغوط، وفقدان جيل كامل-
    ملاحظة: اعتماداً على تسمية الحمض النووي، فإنه قد تحتاج إلى استخدام التصوير جل مختلفة. هذا البروتوكول يستخدم الأصباغ الفلورية القريبة من الأشعة تحت الحمراء وقد أنجز تصوير العينات في تصوير جل (انظر الجدول للمواد). البروتوكول مكتوبة خصيصا لتصوير ذلك.
    1. عند تشغيل الجبهة صبغ بروموفينول الأزرق على الأقل 2/3 من أسفل الجل (~ 28 سم)، يمكن إيقاف الجل قبل إيقاف تشغيل الطاقة. إزالة الجل من الجهاز ومكان في كورك سيد الخواتم-
    2. منفصلة اللوحات مع فاصل لوحة آسفين صغيرة. ضع الفاصل في الداخل الزاوية من الشقوق لسحب ما يصل. يجب توخي الحذر وعدم استخدام القوة المفرطة؛ يمكن كسر الشقوق إذا تم تطبيق الكثير من الضغط.
    3. حالما يتم الإفراج عن شفط بين اللوحات، رفع اللوحة العلوية بعناية وتحديد لوحة الذي الهلام في. إذا كان الجل العصي في أسفل لوحة، سحب اللوحة العلوية قبالة ومكان على الحلبة كورك. إذا كان الجل في أعلى لوحة رفعه، تتحرك ببطء والهلام قد يرتد إلى أسفل لوحة. إذا لم تقع الهلام، مرة أخرى تتحرك ببطء وسحب الجزء المتبقي من الجل من أسفل لوحة ووضع اللوحة العلوية مع الهلام على عصابة فلين منفصلة.
    4. حالما يتم فصل اللوحات، ترى أين الصبغة على الجل وإزالة جل الزائدة من أعلى وأسفل للجل. عادة، مع لدينا ثوابت، باستخدام أما التمهيدي النوكليوتيدات 18 أو 23 وقالب النوكليوتيدات 45، هناك لا الحمض النووي بين جبهة صبغة زرقاء بروموفينول والجزء السفلي من الجل. قص عمودياً من الصبغة على الجزء العلوي من الجل. كما أن المسافات بين الصبغة وحواف الهلام لا الحمض النووي. وأخيراً، قطع بضع بوصات أسفل المساحة تماما في الجل. هناك لا الأحماض النووية في أعلى جداً من الجل.
      ملاحظة: قطع الهلام إلى أصغر حجم ممكن يجعلها أسهل بكثير لنقل إلى جهاز التقاط الصور. إذا كان الجل كبير جداً، أنها أكثر عرضه للتمزيق أثناء النقل. في حين أننا كثيرا ما تقليم الجل قبل التصوير، نوصي باستخدام أقصى درجات الحذر عند التشذيب بالبيانات ذات الصلة يمكن أن تضيع إذا لم تتخذ الرعاية. للتحقق ما إذا كانت إزالة أجزاء تحتوي على بيانات إضافية، أننا سوف غالباً إجراء فحص إضافية الأجزاء قصت جل التأكد من أن أية بيانات تم فقدان.
    5. معطف الهلام مع الماء لمنع جفاف.
    6. تنظيف سطح تصوير. استخدام مساحات العمل، مسح أسفل سطح الماء والايثانول. إضافة طبقة رقيقة من المياه إلى السطح حيث سيتم وضع الجل.
    7. نقل الجزء المطلوب من جل إلى السطح الرطب للي-كورنثوس
    8. الهواء إزالة الفقاعات بلطف الضغط بها من الجل والمسح بممسحة مهمة. توخي الحذر حيث أنه من السهل جداً التمزق الجل عن طريق دفع فقاعات الهواء من الصعب جداً-
    9. صورة للهلام وفقا للشركة المصنعة ' s البروتوكولات. تحليل الجل باستخدام البرمجيات المتاحة للتصوير.
    10. بينما هو يجري تصويرها الهلام، تنظيف مساحة العمل عن طريق إزالة هلام الاكريلاميد الزائدة، غسالة أطباق، وتصفية TBE العازلة لإعادة استخدامها-

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويرد تحليل نجاح polyacrylamide هلام للوصف النوعي للنشاط العام (كما هو موضح في القسم 2-1، الشكل 1) وحركية الحالة المستقرة (الوارد وصفها في المذكرة في ختام القسم 2-1، الشكل 2). ويرد تحليل غير ناجحة polyacrylamide هلام أيضا (الشكل 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وهنا، التي وصفناها مقايسة لتوصيف التوليف بوليميراز الدنا بوساطة M-الحمض النووي. باستخدام الإشعال الحمض النووي المسمى القريبة من الأشعة تحت الحمراء، واستخدام يشوه جل polyacrylamide التفريد لحل النوكليوتيد الحجم بشكل مختلف، يمكننا الحصول على قرار واحد النوكليوتيدات في النوكليوتيد، تمكين القيا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل شركة أبحاث "التقدم العلمي" (كوتريل الكلية الباحث جائزة #22548) وقبل "تريلينك الأحيائية" (ريسيرتشريوارد منحة #G139).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tris HClPromegaH5123
Tris BasePromegaH5131
MgCl2Fisher ScientificBP214-500
Acetylated BSAPromegaPR-R3961
KClSigmaP4504
Dithiothreitol (i.e. DTT)Research Products InternationalD11000
Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution)Sigma03690-100mL
GlycerolSigmaG5516
FormamideAcrosAC42374-5000
Orange GSigma AldrichO3756
Bromophenol blueFisher Scientific50-701-6973
dNTPsFisher ScientificFERR0191
M-dNTPs (riboNTPs)Fisher Scientific45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs (all other modified NTPs)TriLink Biotechnologiesassorted
primer 1IDT DNA / TriLink BiotechnologiesCustom SynthesesWe use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
template 1IDT DNA / TriLink BiotechnologiesCustom SynthesesWe typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
AcrylamideResearch Products InternationalA1140538.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide
Tris/Borate/EDTA (TBE) solidResearch Products InternationalT22020
Urea ultrapureResearch Products InternationalU20200
Gel tapeCBS ScientificGT-72-10
Large white spring clamp polypropyleneCBS ScientificGPC-0001
Ammonium persulfate (APS)Fisher ScientificBP179
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Fisher ScientificBP15020
0.75 mm spacersCBS ScientificSGS-20-0740A
33x42 Notched Glass Plate SetCBS ScientificSGP33-040A
Wedge plate separatorCBS ScientificWPS-100
Comb for gel electrophoresisCBS ScientificSG33-0734
Gel electrophoresis rigCBS ScientificSG-400-33
ultrapure waterwe use a Milli-Q system from Millipore
DNA polymeraseswe prepare these in our laboratory using published protocols.

References

  1. Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
  2. Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
  3. Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
  4. Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
  5. Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
  6. Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
  7. Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
  8. Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
  9. Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
  10. Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
  11. Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
  12. Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
  13. Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
  14. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  15. Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
  16. Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
  17. Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
  18. Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
  19. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
  20. Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235(2016).
  21. Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved