والتصور وتصوير مباشر من العضيات أوليجوديندروسيتي في المخ أورجانوتيبيك الشرائح باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد والفحص المجهري [كنفوكل]

Summary

ميليناتينج oligodendrocytes تعزيز النشر السريع العمل المحتملة وبقاء الخلايا العصبية. بروتوكول للتعبير أوليجوديندروسيتي محددة من البروتينات الفلورية في أورجانوتيبيك شرائح المخ بتصوير مرور الزمن اللاحقة الموضحة هنا. علاوة على ذلك، يرد إجراء بسيط لتصور المايلين أونستينيد.

Abstract

الخلايا العصبية تعتمد على العزل الكهربائي، والدعم التغذوي من أوليجوديندروسيتيس ميليناتينج. وعلى الرغم من أهمية oligodendrocytes، الأدوات المتقدمة المستخدمة حاليا بدراسة الخلايا العصبية، جزئيا فقط قد اتخذت على الباحثين أوليجوديندروسيتي. خلية تلطيخ بتوصيل الفيروسي نوع معين نهجاً مفيداً لدراسة ديناميات عضية حية. وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لتصور oligodendrocyte الميتوكوندريا في شرائح المخ أورجانوتيبيك بتوصيل مع الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) يحمل جينات المتقدرية البروتينات الفلورية المستهدفة تحت سيطرة النسخي مروج البروتين الأساسية المايلين. ويشمل البروتوكول لصنع أورجانوتيبيك شرائح المخ الماوس الاكليلية. ويتبع إجراء لتصوير الوقت الفاصل بين الميتوكوندريا ثم. هذه الطرق يمكن نقلها إلى العضيات الأخرى، وقد تكون مفيدة بشكل خاص لدراسة العضيات في غمد المايلين. وأخيراً، يصف لنا تقنية متاحة بسهولة لتصور المايلين أونستينيد في معيشة الشرائح بالانعكاس [كنفوكل] مجهرية (الأساسية). الأساسية يتطلب أي معدات إضافية، ويمكن أن تكون مفيدة لتحديد غمد المايلين أثناء التصوير الحي.

Introduction

المسألة الأبيض في الدماغ تتكون من محاور الخلايا العصبية عصبية ملفوفة في المايلين، غشاء البلازما موسعة متخصصة التي شكلتها oligodendrocytes. المايلين المطلوب لنشر سريعة وموثوق بها من إمكانات العمل والبقاء الطويل الأجل لمحاور عصبية myelinated، ويمكن أن يسبب خسارة في المايلين الخلل في الجهاز العصبي. على الرغم من أهميتها، خصائص oligodendrocytes أقل شهرة مقارنة مع الخلايا العصبية وأستروسيتيس. ونتيجة لذلك، استحدثت أدوات أقل لدراسة أوليجوديندروسيتيس.

ويعيش تصوير العضيات في الخلية مثل الميتوكوندريا والشبكة اندوبلاسماتيك (ER) أو هياكل حويصلية مختلفة يمكن أن يكون مفيداً لدراسة التغيرات الدينامية في العضيات مرور الوقت. تقليديا، قد أنجز تصوير أوليجوديندروسيتيس الذين يعيشون في الزراعات الأحادية^1،2. ومع ذلك، oligodendrocytes في الأحادية لا تقم بعرض الاتفاق المايلين، وأورجانوتيبيك أو شرائح الدماغ الحادة، ولذلك، يكون خيار أفضل عند دراسة التعريب وحركة العضيات. يمكن أن يكون التعريب العضيات الصغيرة والبروتينات في غمد المايلين تحديا نظراً لبعد المسافة القصيرة بين إكسون myelinated وغمد المايلين المحيطة بها. وهكذا، إجراءات إيمونوستينينج المجهري الخفيفة وحدها لا تملك القرار المكانية تميز بين العضيات في غمد المايلين وتلك الموجودة في محور عصبي ميليناتيد. وهذا يمكن حلها بواسطة توصيل الفيروسية مع الجينات للبروتينات الفلورية استهدفت عضية مدفوعا بالخلية المحددة بنوع المروجين. المزايا هي تعبير خلية على حدة ومتفرق، التي تمكن من تقييم دقيق للتعريب عضية والديناميات. يمكن أيضا استخدام الحيوانات المحورة وراثيا لتحقيق مثل هذا تعبير الخاصة بالخلية المستهدفة عضية³. ومع ذلك، إنتاج وصيانة الحيوانات المحورة وراثيا مكلفة ولا تقدم عادة متفرق التعبير الذي يمكن تحقيقه بأساليب الفيروسية.

يستخدم الأسلوب الموصوفة هنا توصيل الفيروسية من أوليجوديندروسيتيس مع البروتينات الفلورية المتقدرية المستهدفة (دسريد أو أخضر نيون البروتين، التجارة والنقل) مدفوعا بالمروج البروتين الأساسية المايلين (MBP-ميتو-دسريد أو MBP-ميتو-التجارة والنقل) تصور أوليجوديندروسيتي الميتوكوندريا في شرائح المخ أورجانوتيبيك. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم تعبير آخر بروتين فلوري في السيتوبلازم (بروتينات فلورية خضراء تستخدم جنبا إلى جنب مع ميتو دسريد أو تدتوماتو المستخدمة مع ميتو-التجارة والنقل) لتمكين التصور مورفولوجيا الخلايا، بما في ذلك المقصورات هيولى من غمد المايلين. ويشمل البروتوكول الإجراء لجعل شرائح المخ أورجانوتيبيك (نسخة معدلة من البروتوكول التي وصفها دي سيموني ويو، 2006^4،5). ثم يصف لنا الوقت الفاصل بين إجراء التصوير دراسة حركة المتقدرية. يستخدم هذا الإجراء مجهر [كنفوكل] تستقيم مع تبادل مستمر للتصوير المتوسطة، إعداد التي تمكن سهلة التطبيق للمخدرات أو غيرها من التغييرات متوسطة أثناء التصوير. الوقت الفاصل بين التصوير يمكن إجراء على أي مجهر [كنفوكل]، مع بعض المعدات الإضافية للحفاظ على معيشة الشرائح كما هو موضح أدناه. ويتضمن البروتوكول أيضا العديد من النصائح لتحسين التصوير والحد من الضيائية.

وأخيراً، يرد وصف لطريقة سريعة وبسيطة لتصور المايلين أونستينيد طريق الانعكاس [كنفوكل] مجهرية (الأساسية). وهذا يمكن أن تكون مفيدة لتحديد غمد المايلين أثناء التصوير الحي. في السنوات الأخيرة، تم تطوير العديد من التقنيات المايلين الصورة دون أي تلطيخ المطلوبة، ولكن معظم هذه تتطلب محددة المعدات والخبرة^6،،من⁷⁸. الإجراء الموضح هنا يستخدم الخصائص الانعكاسية غمد المايلين، وهو نسخة مبسطة للطول موجي الإثارة واحدة من "الانعكاس [كنفوكل] طيفية" مجهرية (يتم الجمع بين نقاط، والذي عدة الليزر الأطوال الموجية لتصور المايلين) ⁹-الأساسية يمكن القيام به على أي مجهر [كنفوكل] يحتوي 488 نانومتر ليزر و 470-500 نانومتر ممر الموجه مرشح انبعاثات أو عامل تصفية انبعاثات الانضباطي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

الإجراءات المذكورة هنا أن تقرها "هيئة بحوث الحيوان النرويجية". الموردين وإعداد النشرة المصورة للمواد الاستهلاكية وغيرها تتطلب معدات متوفرة في قائمة المواد في نهاية المستند.

1. "إعداد شرائح أورجانوتيبيك"

ملاحظة: تستخدم هذه الوصفة اثنين الماوس الجراء عند الولادة يوم 7-9 (p7-9)، مما يسفر عن 24 أورجانوتيبيك شرائح مقسمة على اثنين ستة آبار ثقافة الأطباق. ما لم ينص على خلاف ذلك، ينبغي القيام بجميع الإجراءات بغطاء معقم ويجب استخدام قفازات نيتريل أو المطاط. ينبغي أن تستخدم المكونات الصف ثقافة الخلية فقط.

1. زجاجات اﻷوتوكﻻف، أدوات تشريح (1 مقص كبير ومقص صغير 1, 1 ملعقة مسطحة كبيرة، 1 ملعقة صغيرة مدورة وشحذ والملقط 1، انظر المواد قائمة لمزيد من التفاصيل)، الزجاج الماصات ونصائح ماصة ومناديل الأنسجة المستخدمة لإعداد شريحة.
2. كما ينبغي أن تستخدم نصف الماصات الزجاجية مع افتتاح كبير، قطع نهاية الضيقة.
   1. نقاط مع خطاط الماس القلم (إذا توفرت) حول ماصة أسفل نقطة حيث يبدأ الزجاج تضييق. ثم ضع نهاية مدبب الماصة في قفازات النتريل أو ما شابه. قطع بعناية غيض من الانحناء ماصة بينما يدفع أنه ضد هيئة عمل.
   ثم
   2. بلانت نهاية المقطوعة بفرك على قطعة من الورق الرمل أو تذوب قليلاً على موقد بنسن. الماصات المكسورة تستخدم لنقل شرائح المخ قطع مع نهاية كسر تحولت إلى لمبة المطاط وفتح كبير نهاية لمس الحل/الشرائح.
      ملاحظة: هذا لا يتم بغطاء معقم ويمكن أن يتم قبل عدة أيام-
3. إعداد أطباق الثقافة.
   ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك في اليوم قبل التقطيع أو 2 ساعة على الأقل قبل التقطيع.
   1. تترافلوروايثيلين تعقيم (PTFE) الأغشية (" حلويات "). استخدام الملقط المعقم اثنين لإزالة قصاصات ورق واحدة من القطع البلاستيكية الزرقاء المحيطة وتعقيمها قبل غمس مرتين في طبق بتري يحتوي على 96 ٪ الإيثانول (EtOH). ثم وضع حلويات شقة في طبق بتري كبيرة عقيمة لتجف.
      ملاحظة: هي قصاصات ورق ماء PTFE الأغشية مشابهة للأغشية في إدراج الثقافة. يساعد استخدام قصاصات ورق التصوير الحي لشرائح مفردة يمكن نقلها بسهولة من الإدراج للإعداد المجهر برفع قصاصات من الورق بالملقط (انظر 4.8. لمزيد من التفاصيل). وبدلاً من ذلك، يمكن مثقف شرائح المخ دون حلويات (الذي سيتم إرفاق الشرائح مباشرة إلى الغشاء لإدراج الثقافة). وفي هذه الحالة، يجب قطع إدراج غشاء مع مشرط بنقل الشريحة إلى حمام المجهر.
   2. إضافة 1 مل من الثقافة المتوسطة (الوصفة في الكواشف ' الجدول) لكل بئر من أطباق الثقافة ستة آبار.
   إدراج
   3. مكان ثقافة واحدة في كل بئر باستخدام الملقط العقيمة. تجنب فقاعات الهواء بين الإدراج والمتوسطة الثقافة-
      ملاحظة: لتوفير المال والبيئة، من الممكن لإعادة إدراج الثقافة. يمكن أن يتم ذلك قبل الشطف دقيق في المقطر ح ₂ س (dH ₂ س) تليها الحضانة في 70% EtOH لمدة 24 ساعة حتى إعادة استخدامها. عند التحضير لثقافة جديدة، الجاف لتدرج في صفيحة ثقافة خلية تحت الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الضوء على 15-30 دقيقة
   إدراج
   4. مكان حلويات (معقمة وجافة) اثنان في كل ثقافة. ضع حلويات نحو الحواف من إدراج للحصول على الحد الأدنى من التداخل-
   5. وضع اللوحات في حاضنة الثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية مع 5% CO ₂-
4. فقاعة تشريح الباردة المتوسطة (الوصفة في الكواشف ' الجدول) مع بيوكسيدي الغاز (95% O ₂/5%CO ₂). لإبقاء الحل العقيمة، الاتصال الأنبوب من اسطوانة غاز إلى عامل تصفية المحاقن معقمة (حجم المسام ميكرومتر 0.22). تصفية
   1. الزوجين الطرف الآخر من المحاقن لأنبوب عقيمة متصلاً ماصة زجاجية معقمة. ضع ماصة زجاجية في الحل، وتغطي مع بارافيلم وتشغيل الغاز. تبقى متوسطة تشريح على مدت
5. تعد المنطقة/تشريح تشريح.
   ملاحظة: من الناحية المثالية، هذا الإجراء ينبغي أن يتم بغطاء معقم. إذا لم يكن هذا ممكناً، يمكن أن تترك فيبرتوم على مقعد في عمل. وفي هذه الحالة، من المستحسن استخدام قناع الشبكة والوجه شعر.
   1. باستخدام شفرة حلاقة حافة واحدة، قطع قطعة مستطيلة الشكل (حوالي 2 × 0.5 سم) من [اغروس] هلام (الوصفة في الكواشف ' الجدول) والصق هذا على خشبة المسرح فيبرتوم أن تواجه الجانب البعيد بليد فيبرتوم.
   2. تنظيف جميع الأسطح وأجزاء فيبرتوم مع 70% EtOH ومسح مع مناديل الأنسجة يعقم.
      ملاحظة: من المهم أن جميع القطع التي سوف تكون على اتصال بأنسجة المخ جافة تماما منذ EtOH يمكن أن تلحق الضرر الخلايا-
   3. إرفاق شفرة حلاقة عقيمة فيبرتوم وإجراء فحص الاهتزاز إذا كان فيبرتوم هذه الدالة.
   4. مناديل أدوات تشريح يعقم مكان في هود جنبا إلى جنب مع أنسجة يعقم، أربعة أطباق بيتري الصغيرة، مشرط الحافة المستديرة، الماصات الزجاجية 2 مع المصابيح المطاطية، الماصات الزجاجية انفك اثنين (انظر نقطة 1.1) وسوبر الغراء (رش مع EtOH)-
   5. من أجل تشريح فقاعات المتوسطة إلى القارب فيبرتوم وفي أربعة أطباق بيتري الصغيرة-
      ملاحظة: هذه الخطوة ينبغي أن يتم إلا مباشرة قبل تشريح منذ المتوسطة من هذه النقطة لا bubbled أو أبقى على مدت
6. ديسيكت وجبل العقول.
   ملاحظة: للحصول على شرائح صحية، هذه الخطوة يجب أن يتم بسرعة ودقة. هناك حاجة إلى بعض الممارسات.
   1. Euthanize الحيوان #1 بتفكك نيكر وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية وثم قطع رأس مع مقص كبير.
   2. الصغيرة، واستخدام مقص حاد، بسرعة إزالة الجلد بجعل شق السهمي من الرقبة للأنف وسحب جانبا للكشف عن الجمجمة.
      1. قص على طول خياطة السهمي، تليها شقوق جانبية على الجزء الداخلي من العظام أمامي وخياطة لامبويد (الحدود بين المخ والمخيخ).
      2. استخدام الملقط لثني فتح الجمجمة على كل جانب. يتم اقتطاع الأعصاب من المخ بإدراج ملعقة مدورة، حادة تحت الجانب البطني للدماغ، وتتحرك برفق الملعقة أفقياً.
   3. استخدام شفرة حلاقة حافة واحدة لجعل كرونال قطع روسترال إلى المخيخ-
      ملاحظة: هذا الخفض سوف تحدد الزاوية التي تقطع الشرائح. ، ولذلك ينبغي أن بزاوية مستقيمة.
   4. الوجه المخ خارج الجمجمة وإلى طبق بتري صغيرة تحتوي على تشريح المتوسطة-
   5. كرر الخطوات 1.6.1--1.6.4. للحيوان #2 ومكان طبق هذا الدماغ في بتري ثاني.
      ملاحظة: الحيوانات ليست عقيمة. إجراء التشريح على جانب واحد من غطاء محرك السيارة وثم الانتقال إلى الجانب الآخر، نظيفة بمجرد العقول قد أزيلت من الجمجمة.
   6. تغيير القفازات.
   7. إرفاق الدماغ لمرحلة فيبرتوم: إضافة طبقة رقيقة من الغراء سوبر إلى مرحلة فقط أمام المركبة [اغروس] هلام. عقد الجانب الدماغ #1 مع كبير مسطح ملعقة مع قطع طازجة (والذيلية) لمس الملعقة وتواجه الجانب البطني (ويجري أقرب ما يكون إلى) [اغروس] هلام.
      1. ثم ضع برفق في الدماغ على الغراء بدفعها قبالة الملعقة مع مجموعة من الملقط. تأكد من ترك مساحة كافية للدماغ #2-
         ملاحظة: من المهم أن العقول موصولة جيدا للمرحلة، ولكن دون الغراء المفرطة، كهذا يمكن أن يعرقل القطع.
   8. مباشرة بعد تركيب الدماغ #1، استخدم ملعقة كبيرة لإضافة بعض قطرات من تشريح المتوسطة أعلى الدماغ. هذا سيتم الحفاظ على الدماغ رطبة وتتصلب الغراء ومنعه من الالتصاق بالجانبين من العقول.
   9. كرر الخطوتين 1.6.7 و 1.6.8. للدماغ #2-
   10. إرفاق المرحلة على القارب فيبرتوم.
7. قطع 230 ميكرومتر سميكة الاكليلية شرائح مع سعة 1-1.5 مم، وتواتر 85 هرتز وسرعة من 0.2 مم/س. شرائح جمع تقريبا بين 1.4 روسترال و 2.1 ملم والذيلية إلى بريجما-
   1. جمع شرائح بعد قطع كل شريحة باستخدام الماصات الزجاجية انفك (بنط 1.1). نقل الشرائح إلى طبق بتري يحتوي على تشريح المتوسطة. استخدام مشرط مدورة لقص الشرائح إلى جزئين، تقسيم نصفي.
8. عندما يتم قطع جميع الشرائح، وضع الشرائح في أطباق الثقافة-
   1. أخذ الطبق الثقافة (في الوقت واحد) خارج الحاضنة.
   2. بعناية استخدام الماصات الزجاجية المضربين، نقل شريحة واحدة لكل من حلويات.
      ملاحظة: يجب وضع الشرائح المسطحة في منتصف قصاصات من الورق. وهذا يتطلب بعض المهارة. ومع ذلك، إذا بعض شرائح ليست مثالية، فمن الأفضل أن تترك لهم من قضاء الوقت في محاولة لنقل لهم كما أنها هامة للحصول على كافة الشرائح في حاضنة أسرع وقت ممكن.
   استخدام
   3. ماصة زجاجية (نهاية مدبب) لإزالة الزائدة المتوسطة بلطف دون لمس الشريحة.
      ملاحظة: شرائح ينبغي أن لا تكون مغمورة في سائل أثناء الاحتضان. وهكذا، يجب أن يستنشق المتوسطة الزائدة أن الشرائح تتعرض للهواء (طبقة رقيقة من المتوسطة سوف لا تزال تغطي الشرائح). الشرائح التي ما زالت مغمورة في سائل عادة ما تكون غير صحية أو يموت (4 وملاحظاتنا).
   4. تحريك الطبق مرة أخرى في الحاضنة بمجرد حلويات كل شريحة واحدة-
   5. كرر الخطوات 1.7.8.-1.8.4-للطبق #2-
9. تغيير المتوسطة الثقافة.
   ملاحظة: يجب أن يتم هذا اليوم بعد تشريح (اليوم الأول في المختبر، DIV1) وبعد ذلك كل 2-3 أيام.
   1. يسخن المتوسطة الثقافة في حمام مائي أو الحاضنة.
   2. في غطاء عقيمة، استخدام شفط فراغ أو ماصة انتظام مع تلميح عقيمة لنضح المتوسطة الثقافة من كل بئر. ويتم ذلك بلطف البقشيش الطبق (بحوالي 30 درجة) ووضع طرف الماصة عند الحافة من إدراج الثقافة-
   3. إزالة ما يقرب من 800 ميليلتر من كل بئر (ترك فقط ما يكفي المتوسطة للحفاظ على الجزء السفلي من إدراج المشمولة في المتوسط). ثم، باستخدام ماصة نظيفة، إضافة 800 ميليلتر من المتوسط قبل ساخنة لكل بئر. ثم ضع الأطباق مرة أخرى في حاضنة الثقافة الخلية.

2. توصيل الفيروسية

آفس

1. ، أو شراء مع بلازميد اهتمام، كما هو موضح سابقا ^{10 ، 11}-
   ملاحظة: يصف هذا البروتوكول الاستخدام من النمط المصلي المسيطر إف 2/8 (إف 2/8) تحمل المتقدرية مستهدفة دسريد أو بروتينات فلورية خضراء كجينات مراسل تحت سيطرة المروج البروتين الأساسية المايلين ¹² النسخي (AAV2 أو MBP_mito_dsred AAV2/8/ 8 MBP_mito_GFP) لتصور oligodendrocyte الميتوكوندريا. إف 2/8 تحمل بروتينات فلورية خضراء أو تدتوماتو كمراسل الجينات مدفوعا بالمروج المساعدة النقدية العامة (إف 2/8 CAG_GFP أو إف 2/8 CAG_tdtomato) يستخدم لتصور oligodendrocyte السيتوبلازم. وبالتالي، يعطي المزيج من MBP_mito_dsred AAV2/8 مع CAG_GFP إف 2/8 الميتوكوندريا الأحمر والأخضر السيتوبلازم في oligodendrocytes، بينما الجمع بين MBP_mito_GFP AAV2/8 و 2/8 إف CAG_tdtomato يعطي الميتوكوندريا الأخضر والأحمر السيتوبلازم. بنيات موصوفة في المزيد من التفاصيل في مكان آخر ¹³-
2. في يوم 7 في المختبر (DIV7)، ترانسدوسي أوليجوديندروسيتيس آفس.
   تنبيه: يرجى اتباع قواعد السلامة للعمل مع آفس. تأكد من أن يكون التدريب السليم والموافقة على مستوى السلامة المطلوبة. ينبغي أن تنفذ جميع النقاط التالية في خزانة السلامة الأحيائية "الصف الثاني" باستخدام قفازات ومعطف المعمل. هنا، يرد تطبيق إف إلى منطقة اللحاء الشرائح، وهذا هو المجال الذي يظهر انتعاش أفضل. متوسط الثقافة
   1. ديلوت إف في مياه دافئة قبل (37 درجة مئوية). ينصح بتخفيف حوالي 2 × 10 ⁹ الجينوم نسخ/مل (GC/mL) للحصول توصيل متفرق من أوليجوديندروسيتيس الذي يتيح لتصوير خلايا مفردة داخل الشريحة. ينبغي أن يتم بيد تجريبية باستخدام التتر مختلفة لضمان كثافة oligodendrocytes ترانسدوسيد التي مناسبة لتجارب محددة. إذا استخدمت اثنين آفس مختلفة، وينبغي مختلطة في نفس الحل وإضافتها إلى الشريحة في نفس الوقت.
   إضافة
   2. ميليلتر حوالي 1.3 المخفف إف لكل شريحة: تأكد من خارج طرف ماصة جافة. "الماصة؛" ميليلتر 1.3 المخفف إف وعقد الماصة فوق القشرة، أقرب وقت ممكن دون لمس الشريحة بنصيحة ماصة (حوالي 1 مم في بعيداً).
   ثم دفع
   3. ببطء الحل خارج الماصة. عند الحل يلامس الشريحة، تلميح ماصة حرك القشرة لنشر الحل على منطقة اللحاء كله.
      ملاحظة: هذا الإجراء ينبغي القيام بأسرع وقت ممكن لتجنب حفظ الشرائح من غطاء محرك السيارة لمدة أطول من اللازم. القيام بذلك على صحن واحد في الوقت ووضع الطبق أول مرة أخرى في الحاضنة قبل البدء في الطبق #2. للحصول على توزيع إف بصورة مرضية دون إتلاف الأنسجة يتطلب بعض الممارسة ومطرد من ناحية.
3. إذا كان متوفراً مجهر الأسفار تستقيم في مختبر الخلية، يمكن التحقق من التعبير البروتين أثناء الوقت في الثقافة عن طريق وضع صحن تحت المجهر.
   ملاحظة: الطبق ينبغي لا أن تبقى خارج الحاضنة لأكثر من 2-5 دقائق-

3. الوقت الفاصل بين التصوير

ملاحظة: يمكن إجراء التصوير كلما تكفي مستويات التعبير من علامات مضيئة والشرائح تبدو صحية (عادة 14-DIV11).

1. ضمان مجهر ونضح وتدفئة يتم إعدادها بشكل صحيح حيث أن حل التصوير فقاعات ساخنة ويمكن الدخول والخروج من الحمام.
   ملاحظة: توجد حلول مختلفة للدوائر حمام. ويرد هنا صيغة بسيطة.
   1. منافذ للحمام بابر المحاقن يتثلم (بنت في ~ 45°) المرفقة بالجانبين من الحمام حسب تك بلو-تك/متعة وتقديم في--
   2. التأكد من أن أنابيب يمر من زجاجة من حل التصوير فقاعات باستمرار، عن طريق مضخة تمعجية، من خلال أنبوب تدفئة سخان وحدة، ومن ثم إلى مدخل إبرة المحقن في الحمام-
   3. ربط أنبوب آخر إلى منفذ إبرة المحقن. ثم يذهب هذا الأنبوب عن طريق مضخة تمعجية والعودة إلى الزجاجة من التصوير الحل (أو باستخدام زجاجة نفايات).
2. فقاعة التصوير الحل (الوصفة في الكواشف ' الجدول) مع الغاز بيوكسيدي.
   ملاحظة: يجب أن يكون هذا staرتيد على الأقل 15 دقيقة قبل التصوير وتستمر طوال التجربة.
3. بدوره على مضخة تمعجية وسخان وتشغيل الحل عن طريق الحمام للحصول على درجة الحرارة المثلى حمام (37 ± 0.5 درجة مئوية). التأكد من أن جهاز استشعار الحرارة متصل بوحدة درجة الحرارة هي غارقة في حل حمام.
4. تشغيل المجهر والأسفار مصباح أشعة الليزر المناسبة.
مسار
5. مجموعة ضوء مناسب للعينة.
   ملاحظة: هذا سوف تختلف تبعاً للإعداد مجهر والتحقيق. المعارف العامة عن كيفية استخدام المجهر [كنفوكل] مطلوب ولن يتم تناول هنا.
استخدام
6. هدفا غمر مياه مع التكبير المناسبة والفتحة العددية (السلطة الوطنية). ونحن نستخدم 40 x الماء غمر أبوتشرومات خطة هدف (n.a. 1.0)-
7. فتح الثقب لتحقيق قسما بصري من حوالي 2-2.5 ميكرون للفيديو الوقت الفاصل بين. وهذا يقلل من حدوث الانتقال من التركيز خلال الوقت الفاصل بين الميتوكوندريا-
8. نقل شريحة أورجانوتيبيك للحمام:
   1. إضافة قطره من التصوير الحل أو مستنبت لبلاستيك صغيرة طبق بيتري.
   2. في غطاء عقيمة، إدراج استخدام الملقط العقيمة لنقل شريحة أورجانوتيبيك واحدة من الغشاء إلى الانخفاض. ينبغي إلا اللمس الملقط قصاصات من الورق ولا الشريحة.
   3. وضع الغطاء على طبق بيتري.
   4. فورا بوضع الطبق الثقافة التي تحتوي على بقية الشرائح مرة أخرى في الحاضنة.
   5. صحن "جلب بيتري" الذي يحتوي على شريحة للمجهر.
   6. إيقاف مضخة تمعجية حين نقل الشريحة إلى حمام المجهر. أولاً، استخدام الملقط لرفع حلويات مع شريحة من طبق بيتري إلى الجزء العلوي من الحمام (سوف تطفو قصاصات من الورق). ثم ضع النصائح اثنين الملقط على كل من جانبي قصاصات من الورق بحيث أنهم على اتصال حلويات دون لمس الشريحة، ودفع حلويات من خلال الحل إلى الجزء السفلي من الحمام. مركز حلويات في وسط الحمام.
   7. استخدام الملقط مكان الربط هولددوون (القيثارة) على رأس قصاصات من الورق دون لمس الشريحة.
      ملاحظة: هو قيثارة مرساة البلاتين على شكل حدوة حصان يستخدم لمنع الشريحة من العائمة أو الانجراف في الحمام. لشرائح الحادة، تشغيل سلاسل رقيقة من جانب واحد من القيثارة إلى أخرى (تشبه قيثارة موسيقى). لشرائح أورجانوتيبيك، ينبغي أن سترينجلس القيثارة وتناسب حجم قصاصات من الورق في مثل هذه طريقة أنه يمكن أن تضع على رأس حلويات دون لمس الشريحة.
   8. إعادة تشغيل مضخة تمعجية.
9. أدنى هدف وصولاً إلى العينة.
10. حدد الخلية والمنطقة إلى الصورة.
    ملاحظة: تجنب التعرض المفرط للخلايا لضوء الليزر وهذا يمكن أن يسبب سمية الخلية (انظر نصائح في النقاط الواردة أدناه).
    استخدام
    1. العدسات والمصابيح الفلورية للعثور أوليجوديندروسيتي صحية يبحث مع التعبير الصحيح. عادة، تظهر أوليجوديندروسيتيس التي تحتوي overexpression قوي من البروتينات الفلورية غير صحية. أوليجوديندروسيتيس غير صحية العمليات مع مظهر تضع،، وسوف تظهر الميتوكوندريا مجزأة. في oligodendrocytes صحية، سوما والعمليات التي تظهر متجانسة والميتوكوندريا لها أطوال مختلفة (على الرغم من أن عادة أقصر بكثير من الخلايا العصبية وأستروسيتيس ^{13 ، 14 ، 15})-
    2. مكان خلية الفائدة في منتصف مجال الرؤية.
    3. استخدام " يعيش " تعمل في البرمجيات (لمجاهر إيكا وزايس) لتحديد الخلية على الشاشة واختيار مجال يحظى باهتمام، مثلاً، جزء من الخلية التي تحتوي على العديد من العمليات الأساسية أو اﻷغماد المايلين، أو عملية واحدة أو غمد المايلين.
       ملاحظة: ليتمكن من الصورة كجزء كبير من العمليات/مانعات قدر الإمكان، اختيار المناطق التي تحتوي على العمليات التي تقع نسبيا شقة في الاتجاه س-ص.
    4. التكبير والتصغير في ميدان المصالح (عادة إنتاج صورة ذات حجم بكسل من 0.14-0.30 ميكرون).
    5. استخدام " المناطق " أداة ورسم مستطيل حول المنطقة واختيار الخيار لمسح المنطقة المحددة فقط. المسح الضوئي الوقت، وبالتالي التعرض لليزر، يتم تقليل بمسح المنطقة المحددة فقط-
       ملاحظة: سيتم تفحص مناطق مستطيلة أفقية أسرع من المناطق العمودية بسبب عدد الأسطر الممسوحة ضوئياً بحاجة أقصر. إذا يتم تفحص منطقة مستطيل رأسي، يمكن تقليل وقت المسح بالتناوب في مجال المسح الضوئي بمقدار 90 درجة (باستخدام أداة الاستدارة).
11. ضبط الليزر السلطة وتحقيق مكاسب للحصول على عرض جيد في الميتوكوندريا.
    ملاحظة: استخدم قوة الليزر الحد الأدنى اللازم. إذا كان ذلك ممكناً، بدوره كسب بدلاً من زيادة الليزر الطاقة. بالإضافة إلى تسبب سمية الخلية، سوف التبييض الكائنات المصورة على مر الزمن، مما يتطلب زيادة السلطة الليزر طاقة الليزر مرتفعة جداً أو اكتساب أثناء المسح الضوئي. قوة الليزر المطلوبة وكسب سيتوقف على مستوى التعبير والمجهر. مع مجهر [كنفوكل] LSM700، يمكننا استخدام ليزر نانومتر 555 في سلطة من 20-40 µW للصورة دسريد أو تدتوماتو و 488 نانومتر ليزر يستخدم في 20-30 µW الصورة في التجارة والنقل (الليزر الطاقة تقاس في الفتحة الخلفية للهدف). يتم تعيين مكاسب عالية للتصوير، ويعيش عادة في حدود 700-800 للتجارة والنقل و 850-980 دسريد وتدتوماتو. مكاسب عالية قد يسبب بعض المزيد من الضوضاء الخلفية، الذي يتم إزالته عن طريق زيادة الإزاحة الرقمي (الإزاحة القيم عادة ما تقع بين 0 و 15). في تجربتنا، استخدام MBP_mito_GFP يعطي أفضل إشارة إلى ضجيج من MBP_mito_dsred-
12. تحديد سرعة المسح الضوئي-
    ملاحظة: تقليل وقت المسح الضوئي باستخدام سرعة المسح ضوئي ورسم منطقة مسح صغيرة (انظر النقطة 4.10.5 أدناه). من الممكن أيضا لحفظ المسح الضوئي الوقت بإجراء المسح الضوئي ثنائي الاتجاه. ومع ذلك، هذا غير مستحسن بسبب جودة الصورة الأكثر فقراً-
13. مجموعة تواتر ومدة تسجيل الوقت الفاصل، مثل التقاط الصور كل 2 ثانية لمدة 20 دقيقة لتصوير المتقدرية في أوليجوديندروسيتيس-
    ملاحظة: يجب تعيين تواتر ومدة وفقا لتنقل كائنات الفائدة. تردد أعلى وسوف يعرض العينة ضوء الليزر أكثر، ولكن تتطلب الكائنات تتحرك بشكل أسرع كما تمتد فترة أقصر من الوقت الفاصل بين أشرطة الفيديو (مثل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية، التي تتحرك على نحو أكثر تواترا وسرعة أعلى بكثير من الميتوكوندريا في oligodendrocytes، يتم عادة تصوير كل ثانية لما مجموعة 2 دقيقة ¹⁶)-
14. بدء تسجيل الوقت الفاصل بين-
    ملاحظة: قد الميتوكوندريا الانتقال من التركيز أو الانجراف خارج المنطقة المصورة أثناء التسجيل. للتقليل من الاهتزازات والحركة، ضبط في-ومنافذ للحمام وتقليل سرعة المضخة إذا لزم الأمر. تحدث التغييرات الصغيرة في التركيز لا يزال عادة. وهكذا، الرصد المستمر للشاشة أثناء التصوير المطلوب، مع تعديلات بسيطة للتركيز أثناء التسجيل-
15. التقاط z-كومة من خلية كاملة لتحديد المستقبل من الخلية وتصوير عملية-
    ملاحظة: لأفضل قرار، يجب إعادة تعيين الثقب لوحدة مهواة 1 z-مكدس.
16. اختياري: تصور المايلين أونستينيد.
    ملاحظة: في أوليجوديندروسيتيس ترانسدوسيد مع التجارة والنقل (هيولى)، اﻷغماد المايلين يمكن عادة تحديد كخطوط مستقيمة من السيتوبلازم (التلال هيولى) متصل بعملية الأولية (انظر الشكل 2 أ وب). ومع ذلك، إذا كان التعبير بروتينات فلورية خضراء ضعيفة جداً أو لا يتم استخدام علامة هيولى، أنه من الممكن تصور غمد المايلين بالانعكاس [كنفوكل] مجهرية (الأساسية) كما هو موضح هنا.
    1. إعداد مسار ضوء جديد في البرنامج مع الإثارة الليزر في 488 نانومتر والتقاط ينبعث الضوء حول الطول الموجي نفسه، مثلاً 470-500 نانومتر.
    2. ضبط الليزر السلطة وكسب حتى مرئياً المايلين (راجع المثال في < طبقة قوية = "إكسفيج "> 3 الرقم). استخدام مجهر الفوقية 510 LSM، نحن عادة استخدام قوة ليزر µW 7-12 (يتم قياسها في الفتحة الخلفية للهدف)-
17. اختياري: إعداد شرائح إيمونوستينينج. التقاط صورة تكبير منخفضة (10 x) من الخلية
    1. إذا كان يجب تحديد الخلية المصورة بعد إيمونوستينينج، وتشير إلى موقعها في الصورة عن طريق رسم سهم أو ما شابه ذلك. للمساعدة في الكشف عن الخلية، من المستحسن أيضا رسم خريطة يدوية لشريحة كاملة، مما يشير إلى موقع الخلية.
    2. إصلاح شريحة في بارافورمالدهيد 4% (PFA) على شاكر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة-
       تنبيه: منهاج عمل بيجين ضار. استخدام ملابس واقية واستخدام فقط في غطاء التهوية.
    3. تمييع مثبت 01:10 في برنامج تلفزيوني وترك عند 4 درجة مئوية حتى تبدأ إيمونوهيستوتشيميستري كما هو موضح في مكان آخر من ¹⁷-
       ملاحظة: على الرغم من أن يمكن أن تترك شرائح في مثبت المخفف لعدة أسابيع، قد تتلاشى الأسفار. يوصي بإجراء إيمونوهيستوتشيميستري في غضون 10 أيام تثبيت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

شرائح المخ أورجانوتيبيك مثقف وترانسدوسيد كما هو موضح أعلاه تبين توزيع oligodendrocytes القشرية الإعراب عن mito_dsred والتجارة والنقل بصورة متفرقة. إيمونوستاينينج مع الأجسام المضادة ضد Olig2 و MBP أكدت أن التعبير معين إلى oligodendrocytes (الشكل 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

البروتوكول المتعلق بجعل الثقافات أورجانوتيبيك الموصوفة هنا هو نسخة معدلة¹⁸ بروتوكول وصف سيموني دي ويو (2006)⁵. وقد أوجزت أهم التغييرات أدناه. يتم إضافة تريس المخزن المؤقت إلى متوسط الثقافة، مما يحسن من بقاء الشرائح عند خارج الحاضنة أثناء توصيل الفيروسية وتغيير الوس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
BD Microlance 19G	BD	301500	Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas	AGA	105701
Brand pipette bulbs	Sigma-Aldrich	Z615927	Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner)	VWR	89038-530
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	64-0106	Temperature controller - thermometer part
CaCl2	Fluka	21100
CO2	AGA	100309	CO2 for incubator
Cover glass, square Corning	Thermo  Fischer Scientific	13206778	To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021
Delicate forceps	Finescience	11063-07	For dissection
Diamond scriber pen	Ted Pella Inc.	54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm	VWR	612-1702	Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade	Electron Microscopy Sciences	#7200	Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)	Gibco-Invitrogen	24010-043
Filter paper circles	Schleicher & Schuell	300,220	Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack	Loctite	1270884	Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2	Katrin	344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber,	Warner Instruments	64-1418	Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3	Sigma	H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2	Heto-Holten	96004000M	Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated	Gibco-Invitrogen	26050-088
KCl	Sigma	P9541
LCR Membrane, PTFE,	Millipore	FHLC0130	Confetti
Leica VT1200	Leica	14048142065	Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES	Thermo  Fischer Scientific	42360024
MgCl2	R.P. Normapur	25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B	Electron Microscopy Sciences	62411-B	Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit	Millipore	SLGPM33RA	Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm	Millipore	PICM03050	Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module	GILSON	F155001	Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282
NaHCO3	Fluka	71628
Nunclon Delta Surface	Thermo  Fischer Scientific	140675	Culture plate
Nystatin Suspension	Sigma-Aldrich	N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC	Zeiss	441452-9900-000	Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm	VWR	291-1211
Paraformaldehyde, granular	Electron Microscopy Sciences	#19208
PC-R perfusion chamber	SiSkiYou	15280000E	Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid	Invitrogen	15070-063
Petri dish 140 mm	Heger	1075	Large Petri dish
Petri dish 92x16 mm	Sarstedt	82.1473	Medium Petri dish
Petridish 55x14,2 mm	VWR	391-0868	Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P4417	PBS tablets
R2 Two Channel Head	GILSON	F117800	Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel	VWR	82027-528	Large spatula for dissection
Sand paper	VWR	MMMA63119	Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm	Finescience	14130-17	Large scissors for dissection
Scissors, 8,5	Finescience	14084-08	Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade	Electron Microscopy Sciences	#71972	Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm	Millipore	SCGPT05RE	Filter to sterilize solutions
Super glue precision	Loctite	1577386
Surgical scalpel blade no. 22	Swann Morton Ltd.	209	Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B	Warner Instruments	64-0100	Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base	Sigma	T1503
Trizma HCl	Sigma	T3253
Water jacketed incubator series II	Forma Scientific	78653-2882	Incubator