تقييم نفاذية حاجز الدم في الدماغ بالتسريب الوريدي الزلال المسمى فيتك في نموذج ماوس لأمراض الأعصاب

Summary

في هذه الدراسة، نقدم إجراءات سهلة وفعالة لتقييم اضطراب حاجز الدم في الدماغ تحت ظروف الأعصاب. ولتحقيق هدفنا، نحن غرست عالية الوزن الجزيئي fluorescein isothiocyanate المسمى (فيتك)-الزلال في الماوس حبل الوريد وتقييمها التسرب إلى حمة الدماغ بالفحص المجهري الأسفار.

Abstract

الإخلال بسلامة حاجز الدم في الدماغ (BBB) سمة مشتركة لمختلف الأمراض العصبية والأعصاب. على الرغم من أن التفاعل بين القلق BBB التوازن والآلية المرضية لاضطرابات الدماغ يحتاج إلى مزيد من التحقيق، تطوير والتحقق من صحة إجراءات موثوقة لدقة الكشف عن التعديلات BBB قد تكون حاسمة وتمثل أداة مفيدة للتنبؤ باحتمال المرض تستهدف التقدم وتطوير استراتيجيات علاجية.

نقدم هنا، إجراءات سهلة وفعالة لتقييم BBB التسرب في حالة حدوث مثل هذا في نموذج ماوس الإكلينيكية لمرض هنتنغتون، فيها عيوب في نفاذية BBB قابلة للاكتشاف وضوح بريكوسيوسلي في الأعصاب هذا المرض. على وجه التحديد، ارتفاع الوزن الجزيئي fluorescein isothiocyanate المسمى (فيتك)-الزلال، التي قادرة على عبور BBB فقط عندما يكون هذا الأخير البصر، التي غرست حادة في الوريد ماوس وتوزيعها في مناطق الأوعية الدموية أو متني ثم تحددها مجهرية الأسفار.

تراكم الزلال الفلورية الخضراء في حمة الدماغ يعمل كمؤشر الشاذة BBB النفاذية، وعندما كوانتيتاتيد باستخدام برامج معالجة "الصورة ي"، يتم الإعلام عن "كثافة الفلورية الخضراء".

Introduction

التوازن داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS) شرط أساسي للاتصال السليم ووظيفة الخلايا العصبية. حمة الجهاز العصبي المركزي هو محكم أغلقت من الهامش ببطانية حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي)، الذي يمثل الواجهة بين مجرى الدم المحيطي والدماغ، وتلعب دوراً محوريا في عبر الحديث بين هاتين المنطقتين^{1 ،2}. BBB معقدة ودينامية بنية ثلاثية الأبعاد تتألف أساسا من السفينة الصغيرة غشائي الخلايا المتخصصة (ECs) مرتبطة ببعضها البعض عن طريق المجمعات هالة بين الخلايا-تقاطعات ضيق (TJs)-وهو محاط بيريسيتيس، العصبية النهايات و astrocyte القدم العمليات^1،2.

في ظل الظروف الفسيولوجية، نفاذية منخفضة للغاية من BBB سليمة يضمن التنظيم الصارم لنقل المواد الغذائية والجزيئات الأخرى داخل وخارج الدماغ، ويوفر الجهاز العصبي المركزي مع حماية فريدة من نوعها من التغيرات التي تحدث في تكوين الدم التي قد تؤثر على النشاط العصبي وضد احتمال الطرفية الشتائم^1،،من²³.

الإخلال بسلامة BBB ونفاذيه معززة فترة طويلة كان معروفا لتشكل إحدى سمات رئيسية للعديد من العصبية واضطرابات الأعصاب⁴ بما في ذلك مرض هنتنغتون (HD)^5،6، ومع ذلك ، ما إذا كان مثل هذا خلل ظاهرة المسبّب للمرض أو حدثاً معوي أثناء المرض لا يزال غير واضح. توقيت انهيار BBB أيضا لا يزال بعيد المنال، بيد أن تبرز أدلة من مجموعتنا وغيرها تشير إلى أن تعطل BBB وحدة لا يمثل الراحل حدثاً في تطور المرض، ولكن بدلاً من ذلك خطوة مبكرة^{6،7 , 8}، والتي قد تكون لها آثار طويلة الأجل.

مع هذا في الاعتبار، من المهم أن بريكوسيوسلي تكشف عن انهيار BBB في نيوروديجينيريشن من أجل وضع استراتيجيات مفيدة للتنبؤ بتطور المرض وتلف الدماغ وتطوير التدخلات البديلة وأكثر استهدافاً قادر على بنجاح التخفيف من آثار هذه إلى اضطراب السريرية. تصوير موثوق بها من ضعف BBB ولذا، ذات أهمية كبيرة في البحوث التجريبية والمعالجة السريرية لأمراض المخ.

في هذه الورقة، يصف لنا إجراء ناجح وبسيطة لتقييم نفاذية BBB في طراز ماوس عالية الدقة باستخدام ارتفاع الوزن الجزيئي fluorescein isothiocyanate المسمى الزلال (فيتك الزلال). وتم قياس التسرب الزلال فيتك، التي عادة لا يمكن عبور الحاجز، إلى حمة الدماغ كمؤشر التسرب بي بي بي. هذا الأسلوب سهولة التكيف للفئران وغيرها من الحالات المرضية التي تتميز بضعف سيريبروفاسكولاتوري^9،10.

Protocol

وافق جميع الإجراءات على الحيوانات إيرككس الحيوانات نيوروميد رعاية المجلس استعراض ومن جانب " Istituto Superiore دي الصحة " (رقم تصريح: 1163/2015-العلاقات العامة)، ووفقا للمبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي التوجيه 2010 /63/الاتحاد الأوروبي للتجارب على الحيوانات-

1. إعداد الحل الزلال فيتك بالحقن في الوريد

ملاحظة: جميع التجارب كانت الرقابة تتم في بيان الفئران HD R6/2 (11-أسبوع من العمر) وفي سن والمطابقة بين الجنسين البرية من نوع (WT) ليتيرماتيس.

1. حل فيتك الزلال مسحوق (انظر الجدول للمواد) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 10 ملغ/مل.
   ملاحظة: لتحقيق أفضل النتائج، وهذا ينبغي إعداد جديدة لكل رد فعل التوسيم.

2. إعداد المعدات "يتم استخدامها أثناء جراحة"

1. وضع الأدوات الجراحية يعقم سابقا (انظر الجدول للمواد)-
2. نظيفة على مقاعد البدلاء الجراحية مع الكحول (70% إيثانول الحل). تعد منطقة الجراحية (45 سم × 45 سم) مع ثني جراحية معقمة منشفة المتاح وإعداد ستيريوميكروسكوبي التشغيل-

3. إجراء العمليات الجراحية لضخ فيتك الزلال في حبل الوريد

1. تسجيل وزن الجسم الماوس للتخدير.
2. الماوس أنيسثيتيزي مع حقن داخل (الملكية الفكرية) الجرعة المناسبة من الكيتامين (100 مغ/كغ)-إكسيلازيني (10 مغ/كغ) الحل.
التخدير
3. مراقبة الحيوانات برشة إصبع لطيف سحب منعكس كما هو موضح في والانتوس et al. ^{11 ، 12}-
4. ضع الماوس أنيسثيتيزيد في موقف ضعيف الوجه للأعلى وإصلاح أربعة أرجل والذيل على طاولة العمل الجراحي بشريط لاصق.
5. بعد أن يتم تأمين الماوس، يحلق بعناية الهامش الجراحية المناسبة على الرقبة مع حلاقة الكهربائية (انظر الجدول للمواد) وتطهير أنه مع الإيثانول الحل و 70% بوفيدون.
6. الجاف للسطح حلق مكشوف مع مسحات القطن.
7. بلطف سحب الجلد حلق، وجعل 1.5 سم طويلة طولية شق، بدون مشرط، في الكتفي خط ابتداء من منتصف الطريق في الصدر، وتمتد إلى أسفل الرقبة.
8. بعناية تمتد إلى جانب النسيج الضام مع الملقط تحت الملاحظة المجهرية (5 X التكبير) لفضح حبل الوريد الخارجي.
9. التأكد من مساحة كافية على اليمين وعلى اليسار من حبل الوريد لتسهيل إدخال الإبرة ز 30 لضخ الحل الزلال فيتك.
10. حقن الحيوان عن طريق الوريد (الحق حبل الوريد) ببطء (أكثر من 3 دقيقة) مع 100 ميليلتر من 10 مل/كغ الزلال فيتك باستخدام إبرة 30 ز.
11. بعد 15 دقيقة، euthanize الماوس بقطع الرأس وسرعة إزالة الدماغ من الجمجمة كما هو موضح سابقا ¹³ وتزج عليه لمدة 15 دقيقة على الأقل 10 × حجم الدماغ نفسها من قبل برود إيسوبينتاني.
12. نقل إيسوبينتاني تجميد الدماغ في أنبوب مبردة مسبقاً وتخزينها في ثلاجة-80 درجة مئوية حتى تقطيع غذائها.

4. النسيجي "تمزيقها للدماغ يملؤه" الزلال فيتك

1. Embed تجميد الدماغ في درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) مجمع السابقة (انظر الجدول للمواد) لتقطيع كريوستات.
2. متسلسل قص الدماغ إلى 20 ميكرومتر سميكة أقسام، مع كريوستات (انظر الجدول للمواد)، وجبل لهم على الشرائح الزجاجية المجهر.
3. أداء فيتك-الزلال/laminin المشترك تلطيخ باستخدام محدد الأجسام المضادة-لامينين (انظر "الجدول للمواد") كما تم وصفه سابقا ⁶-
   1. بإيجاز، احتضان الأقسام مع جسم الأساسي مكافحة--لامينين (pAb 1: 1000) طوال الليل والمضي قدما في جسم الثانوية المناسبة مترافق إلى Cy3-
   2. ساترة الشرائح مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) (ذروة امتصاص = 360 نانومتر؛ وذروة الانبعاثات = 460 نانومتر (انظر الجدول للمواد).
   3. ترك الشريحة للمبيت الجافة في 4 درجات مئوية في الظلام-
   مراقبة
   4. fluorescence تلطيخ تحت مجهر الأسفار (انظر الجدول للمواد) في 20 X التكبير مجهزة بكل فيتك (ذروة امتصاص = 495 نانومتر؛ وذروة الانبعاثات = 525 نانومتر) ومرشحات Cy3 (ذروة امتصاص = 550 نانومتر؛ والانبعاثات ذروة = 570 نانومتر).
      1. لعرض العينات مباشرة بعد تلطيخ، تأمين ساترة في الزوايا باستخدام طلاء الأظافر ودراستها تحت المجهر أعلاه (4.3.3)-

5. الإعداد حتى مجهر الأسفار واقتناء صور ملونة

1. إعداد المجهر الأسفار كما يلي.
   1. بدوره على مصباح الأسفار حوالي 10 دقائق قبل الاستخدام. قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر متصل، والكاميرا الرقمية. قم بتشغيل برنامج تحليل الصورة (انظر الجدول للمواد)-
   2. استخدام الهدف المناسب لجمع الإشارات الأمثل والقرار المكاني، وتحديد عوامل التصفية المناسبة.
2. الحصول على صور ملونة
   1. تحديد الأمر [يعيش] في صورة برامج التحليل (انظر الجدول للمواد) وإعداد المعلمات الإضاءة الأمثل لكل مرشح.
   2. تحديد الأمر [التجميد] أخذ صورة ملونة قناة واحدة وإضافة شريط مقياس (' تحرير > "مقياس حرق" ')
   3. حفظ كل صورة في '.tiff ' الشكل.
   4. دمج القنوات في صورة واحدة عن طريق تحديد ' ملف > دمج قناة ' وحفظه في
   5. المشاجرة ' الشكل.
   6. الحصول على حد أدنى من أربعة أربعة وعشرين بت لون صورة (2200 مكم x 3400 ميكرومتر) كل شريحة الدماغ (6 أقسام كل شريحة).

6. تقييم التسرب الزلال فيتك

1. تحليل شدة الأسفار لكل قناة واحدة باستخدام ال ^{14 ،} إيماجيج متاحة بحرية ¹⁵-
2. تطبيع كثافة إشارة الفلورسنت مجموع الزلال فيتك حدة نيون CY3-لامينين المجموع في كل صورة وتقرير الزلال اكسترافاساتيد خارج السفن "كثافة الفلورية الخضراء".

النتائج

الخطر السليم ضخ فيتك الزلال في نتائج حبل الوريد في التسرب التتبع الفلورية الخضراء من مجرى الدم إلى بارينتشيماوهين الدماغ BBB⁶. في ظل الظروف الفسيولوجية، توزيع الزلال الفلورسنت التي غرست مقيد إلى داخل الأوعية الدموية في الدماغ ولا توجد إشارة في حمة ارتشاح الم?...

Discussion

الأسلوب الذي يصف لنا هنا أساسا مفيداً للكشف عن التسرب BBB ظروف مرض المخ. الخلل بي بي بي يكتسب اهتماما كسمة مشتركة من اضطرابات عصبية متنوعة⁴. كنا سابقا هذا النهج لوصف الاختلال المبكر BBB السلامة في طراز ماوس من مرض الأعصاب نادرة مثل HD⁶.

يأخذ هذا الأسلوب م...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate	SIGMA	A9771-100MG
pAb anti-Laminin	Novus Biologicals	NB300-144
CY3 anti-rabbit made in goat	MILLIPORE	AP132
SUPERFROST PLUS	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Cover Slips 24 X 50 mm	Thermo Scientific (DIAPATH)	61050
Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound	Bio Optica	05-9801
VECTASHIELD Mounting Media	VECTOR	H-1500	Mounting media with DAPI
iNSu/Light Insulin Disposible Syringe	RAYS Health & Safety	INS1ML26G13
30G 1/2"	BD Microlance	304000	Needle for Insulin disposible Syringe
Scalpel Handle	F.S.T.	91003-12
#22 Disposable Scalpel blads	F.S.T.	10022-00
Fine Iris scissors 10.5 cm	F.S.T.	14094-11
Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm	F.S.T.	11251-35
Graefe Forceps 10 cm	F.S.T.	11051-10
Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm	F.S.T.	11251-20
Medical patch	Medicalis	34788
Sterile disposable towel drape	Dispotech	TVO50VE
Stereoscopic Microscope	NIKON	SMZ 745 T
Optic Illuminator LED light (C-FLED2)	NIKON	1003167	Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope
Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	932162	Epifluorescence Microscope
Microscope digital Camera	Nikon	DS-Ri2	Microscope camera
Intenslight	Nikon	C-HGFI	Microscope lamp
NIS-Elements 64 bit	Nikon	AR 4.40.00	Analysis Software
Electric Razor	Gemei	GM-3007