التسلسل الفائق موازية "قياس اللياقة البدنية" الإصابة إينتيروجانس Leptospira ينقول الإدراج طفرات خلال الذهبي السوري الهامستر

Kristel Lourdault; James Matsunaga; Karen V. Evangelista; David A. Haake

doi:10.3791/56442

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يصف لنا هنا أسلوب الذي يجمع بين الطفرات ينقول مع التسلسل الفائق لتحديد وتقدير حجم ينقول ليبتوسبيرال طفرات في الأنسجة بعد تحديا الهامستر. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لطفرات الشاشة للبقاء على قيد الحياة، ونشر في الحيوانات، ويمكن تطبيقها أيضا على الدراسات في المختبر .

Abstract

في هذه المخطوطة، يصف لنا ينقول التسلسل (Tn-Seq) تقنية لتحديد وتقدير حجم Leptospira إينتيروجانس طفرات غيرت في اللياقة البدنية خلال عدوى الهامستر السوري الذهبي. تينيسي-Seq يجمع بين الطفرات ينقول عشوائي مع قوة تكنولوجيا التسلسل الفائق. وتحدي الحيوانات مع مجموعة من ينقول طفرات (تجمع الإدخال)، متبوعاً بحصاد الدم والأنسجة بضعة أيام في وقت لاحق لتحديد وقياس عدد طفرات في كل جهاز (مجمعات الإنتاج). تتم مقارنة في تجمعات الإخراج إلى تجمع الإدخال لتقييم اللياقة في فيفو كل متحولة. ويتيح هذا النهج فحص مجموعة كبيرة من طفرات في عدد محدود من الحيوانات. مع تعديلات طفيفة، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول مع أي نموذج من نماذج حيوانية لداء البريميات، وخزان المضيف نماذج مثل الفئران، ونماذج الإصابة الحادة مثل الهامستر، فضلا عن الدراسات في المختبر . تينيسي-Seq يوفر أداة قوية للشاشة لطفرات بعيوب اللياقة البدنية في الجسم الحي وفي المختبر .

Introduction

من الصعب تحديد الجينات الفوعة لبعض أنواع البكتيريا، مثل Leptospira spp.، بسبب العدد المحدود من الأدوات الجينية المتاحة. أحد النهج استخداماً هو إنشاء مجموعة من طفرات من الطفرات العشوائية ينقول متبوعاً بتحديد موقع الإدراج في كل متحولة واختبار الفوعة طفرات ينقول الفردية في نموذج حيوان. وهذا النهج هو مضيعة للوقت ومكلفة، ويتطلب عدد كبير من الحيوانات.

عندما الطفرات العشوائية وضعت أولاً لمسببات المرض Leptospira إينتيروجانس، حددت الجينات المعنية بضراوة عن طريق اختبار طفرات الفردية في نموذج حيوان¹. واختيرت طفرات استناداً إلى معايير مثل أدوارها المحتملة في الإشارات أو حركية أو الغشاء الخارجي المتوقعة أو موقع السطحية. كما أن غالبية ليبتوسبيرال ترميز الجينات البروتينات افتراضية لدالة غير معروفة²، اختيار طفرات استناداً إلى هذه الحدود معايير القدرة على اكتشاف الجينات الفوعة ليبتوسبيرال الرواية.

في الآونة الأخيرة، تم فحص برك طفرات ينقول إينتيروجانس L. للعدوى في نماذج الهامستر والفأر³. وطعن كل الحيوانات مع مجموعة طفرات تصل إلى 10. وكان سجل العدوى متحولة إيجابية لو أنه تم الكشف عن طريق PCR للثقافات التي تم الحصول عليها من الدم والكلى. وكان اختبار PCR شاقة لأنه يتطلب فعل PCR فردية لكل متحولة في حوض السباحة. لأنه كان لم يحدد كمياً تواتر كل متحولة في الثقافات، كان متحيزا النهج نحو تحديد طفرات عالية الموهن.

يصف لنا ينقول التسلسل (Tn-Seq) تقنية، كاستراتيجية للشاشة أكثر كفاءة للجينات الفوعة. تينيسي-seq يتكون من إنشاء مكتبة طفرات من الطفرات ينقول متبوعاً تسلسل المتوازية الضخمة⁴^،^،من⁵⁶. بإيجاز، تجميع طفرات ينقول وطعمت في الحيوانات واستردادها في وقت لاحق من أجهزة مختلفة (مجمعات الإنتاج). استخراج الحمض النووي من مجمعات الإنتاج ويهضم مع إنزيمات التقييد أو المنفصمة ب sonication. يتم إجراء جولتين من PCR استهداف وصلات مواقع الإدراج ينقول. هذه الخطوة يمكن إضافة المحولات اللازمة للتسلسل. ويتم تحليل منتجات PCR الناتجة بالتسلسل الفائق لتحديد موقع الإدراج ينقول كل متحولة تجمع جنبا إلى جنب مع هذه الوفرة النسبية، الذي هو مقارنة مع التكوين الأولى لمجمع المسخ.

الميزة الرئيسية لهذا النهج هو القدرة على الشاشة في نفس الوقت عدد كبير من طفرات مع عدد قليل من الحيوانات. تينيسي-Seq لا تتطلب معرفة مسبقة من مواقع الإدراج ينقول مما يزيد من فرص اكتشاف جديد Leptospira-جينات معينة تشارك في الفوعة بأقل وقت وقدر أكبر من الكفاءة. نظراً للعبء ليبتوسبيرال في أنسجة مرتفع نسبيا في القوارض نماذج العدوى عرضه لقاتله (عادة 10⁴ إلى 10⁸ البكتيريا/غرام من الأنسجة)⁷^،^،من⁸⁹ كذلك كما هو الحال في مستودعات مضيفة¹⁰^،¹¹، يمكن تحليل الأنسجة مباشرة دون الحاجة إلى الثقافة والحد من التحيز بسبب النمو في المختبر .

في تينيسي Seq الدراسات مع معظم مسببات الأمراض البكتيرية ووصف حتى الآن، سمح عالية التردد من الطفرات insertional العدوى مع تجمعات كبيرة تحتوي على طفرات جماعياً بعد غرز متباعدة عن كثب ينقول متعددة داخل كل الجينات⁴ ^،^،من¹²¹³^،¹⁴. كما وضعت Tn Seq لبكتيريا التي تردد الطفرات هو كثير أقل من⁶. مع Leptospira، يمكن إنشاء مكتبة طفرات ينقول بإدخال ينقول على بلازميد متمركزة بالاقتران كما هو موضح سلامتي وآخرون¹⁵. ومع ذلك، تواتر الطفرات ينقول لام إينتيروجانس منخفض. عندما ينقول Himar1 أدخل على بلازميد كونجوجاتيفي، تواتر ترانسكونجوجانت أفيد بأن الخلية مع الضغط لأي من إينتيروجانس ل¹⁶ فقط 8.5 × 10^-8 كل مستلم ومن المرجح أن تكون وبالمثل الفقيرة مع معظم السلالات الأخرى لام إينتيروجانس. بروتوكول الموصوفة هنا في جزء على أساس أن البلدان المتقدمة النمو البورليه burgdorferi، الذي هو أيضا تواتر الطفرات insertional ينقول منخفضة⁶.

لدينا تجربة رائدة مع بروتوكول¹⁷، أجرينا الطفرات ينقول مع إينتيروجانس L. سرفار مانيلا سلالة L495 بسبب نجاح الفئات الأخرى في عزل ينقول الإدراج طفرات في سلالة جنبا إلى جنب مع انخفاض LD₅₀ (جرعة مميتة) لضراوة¹. نحن فحص طفرات 42 من تينيسي-Seq وحددت العديد من المرشحين متحولة معيبة في الفوعة، بينهم اثنان مع الملاحق في جين adenylate cyclase مرشح. وأكدت التجارب الفردية من طفرات اثنين في الهامستر أن كانت قاصرة في الفوعة¹⁷.

Protocol

تنبيه: يجب معالجة سلالات ممرضة من Leptospira spp. تحت إجراءات الاحتواء 2 مستوى السلامة الأحيائية (BSL-2). يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية). ثانيا فئة السلامة الأحيائية مجلس الوزراء يجب أن يستخدم لجميع المعالجات من الممرضة Leptospira spp.

1-إنشاء ينقول مكتبة متحولة¹⁵

نقل ينقول إلى spp Leptospira . بتصريف (رقم 1)
1. تطعيم كمية من ثقافة المرحلة الأسية spp المسببة للأمراض في. Leptospira الموافق 10⁷ الخلايا إلى 10 مل من الينغاوسين-مكولوغ-جونسون-هاريس متوسطة¹⁸^،(امجه)¹⁹. احتضان عند 30 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة تهتز حتى الكثافة تصل إلى 2-8 × 10⁸ خلايا/مل.
  ملاحظة: مضاعفة وقت ليبتوسبيريس المسببة للمرض ح 12 إلى 24، اعتماداً على سلالة.
2. تلقيح 50 ميليلتر من المانحين الإشريكيّة القولونية سلالة β2163²⁰ تحمل ينقول متمركزة بلازميد (pCjTKS2)¹⁶ إلى 5 مل من مرق لوريا (رطل) وتستكمل مع 0.3 مم 2, 6-ديامينوبيميليكاسيد (حزب العمل الديمقراطي)، 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين (كم)، و 50 ميكروغرام/مل بالسبيكتينوميسين (Spc) ومكان بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية 255 لفة في الدقيقة.
3. تطعيم 60 ميليلتر من الخلايا كولاي إلى 3 مل أمية وتستكمل مع 0.3 مم من حزب العمل الديمقراطي (أمية + سماد). احتضان عند 37 درجة مئوية في الانفعالات 255 لفة في الدقيقة ح 3-4 حتى ≈_600nmOD 0.3.
4. لتجميع وحدة الترشيح (الشكل 1)، وضع القاعدة على 125 مل جانب-ذراع قارورة Erlenmeyer، وضع عامل تصفية خلات السليولوز (المسام حجم 0.1 مم؛ وقطرها 25 ملم) على قاعدة، والمشبك القمع على القاعدة. قم بتوصيل وحدة الترشيح إلى نظام فراغ.
5. إضافة 5 مل من Leptospira spp. الثقافة و 0.5 مل من الثقافة كولاي إلى القمع. الفراغ السائل من خلال عامل تصفية.
6. نقل عامل التصفية مع سطح البكتيريا التي تواجه على امجه + دابلاتي. احتضان عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع عامل التصفية مواجهة.
7. وضع عامل التصفية في أنبوب 15 مل يحتوي على 1 مل امجه ودوامه 10 s لإطلاق سراح البكتيريا في وسائل الإعلام. انتشار ميليلتر 200 تعليق على 5 أمية بلاتيسكونتاينينج 50 ميكروغرام/مل كم استخدام 10-15 ملم 1 زجاج معقمة الخرز أو الناشرة المتاح عقيمة. التفاف اللوحات مع بارافيلم واحتضانها لهم رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 3 إلى 4 أسابيع حتى مستعمرات مرئية.
8. نقل مستعمرات منفردة إلى 3 مل أمية التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل من كم (أمية + كم) عند 30 درجة مئوية تحت الانفعالات 150 دورة في الدقيقة لمدة 7 إلى 10 أيام حتى تصل إلى الثقافة كثافة ≈ 10⁸/mL.
  ملاحظة: يمكن تخزين الثقافات في-80 درجة مئوية أو في النتروجين السائل (مع والغليسيرول 4%).
تحديد موقع الإدراج ينقول من يعشق [بكر] (الشكل 2)
1. 50 ميليلتر من كل متحولة ينقول في أنابيب PCR بالحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  ملاحظة: الحمض النووي يمكن أن تكون تنقية بدلاً من ذلك، استخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي.
2. إعداد مزيج PCR مع الإشعال Deg1 و Tnk1 (الجدول 3) وفقا الجدول 1. نقل 23.7 ميليلتر من المزيج لكل أنبوبة بكر وإضافة 1.3 ميليلتر من تفكيك الخلايا. تشغيل البرنامج: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورات 40: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 40 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
3. جعل هذا المزيج PCR مع الإشعال العلامة و TnkN1 (الجدول 3) وفقا الجدول 2. نقل 24.2 ميليلتر من المزيج لكل أنبوبة بكر وإضافة ميليلتر 0.8 لتفاعل PCR #1. تشغيل البرنامج: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورات 35: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
4. تشغيل 3 ميليلتر من منتجات بكر على 1% [اغروس] هلام مع المخزن المؤقت تريس-خلات-يدتا X (تاي) 1 في 10-15 V/سم (الشكل 2).
5. تنقية منتجات PCR إيجابية العينات باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR. الوتي الحمض النووي مع حجم أدنى يسمح به عدة لزيادة تركيز الحمض النووي استردادها.
6. إرسال المنتجات بكر المنقي سانغر التسلسل باستخدام التمهيدي TnkN1 (الجدول 3).
7. تحديد مواقع الإدراج بمقارنة التسلسل الناتج مع تسلسل الجينوم للسلالة الأبوية بتحليل بلاستن (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) أو باستخدام قاعدة البيانات (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage) سبيروسكوبي²¹.
8. تأكيد موقع الإدراج ينقول واسطة PCR باستخدام كبسولة تفجير الصلب إلى تسلسل المضيف ترافقه.
  ملاحظة: ينقول يزيد من حجم تسلسل البرية من نوع من ≈ 2 كيلو بايت.

2-تجربة الحيوان (الشكل 3)

ثقافة طفرات Leptospira
1. تنمو منفردة كل متحولة ينقول المحدد في 10 مل من أمية + كم عند 30 درجة مئوية في الانفعالات 150 لفة في الدقيقة بكثافة من⁸ 10⁷-10 ليبتوسبيريس/mL.
2. عد ليبتوسبيريس بالفحص المجهري الظلام--الميدانية مع عداد هاوسير بيتروف، أو كما وصفت ميلر²³.
3. تمييع كل ثقافة في أمية بنفس الكثافة، وعلى سبيل المثال 10⁶ خلايا/مل.
4. لتجميع مجموعة الإدخال، تخلط معا ثقافات المخفف بكميات متساوية.
  ملاحظة: تتضمن عناصر التحكم في تجمع الإدخال عن طريق إضافة طفرات بعيوب اللياقة البدنية المعروفة مثل loa22¹⁷^،²⁴ وطفرات مع غير معدلة اللياقة البدنية مثل ليجب¹⁷^،²⁵، على التوالي. ويمكن تخزين برك طفرات مع والغليسيرول 4 ٪ في-80 درجة مئوية أو في سائل النيتروجين.
التحدي
ملاحظة: الأساليب الموصوفة هنا وافق قدامى المحاربين في الشؤون أكبر لوس أنجليس المؤسسية الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة (بروتوكول #09018-14).
1. حقن إينترابيريتونيلي 1 مل تجمع الإدخال لكل الحيوانات حقنه الأنسولين U-100 مع 26 x ½ "إبرة.
  ملاحظة: في تجربة رائدة، تم طعن الحيوانات 8 مع 1 مل تجمع المدخلات، أي 10⁶ البكتيريا إجمالي¹⁷. العدوى سمح بالمضي قدما لمدة 4 أيام قبل القتل الرحيم.
2. جمع 10 مل تجمع الإدخال، وتدور عن 20 دقيقة في غ. س 3,220 بعناية إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه. تخزين بيليه الخلية في-80˚C حتى استخدام (الخطوة 3.1.3).
3. مراقبة الحيوانات يوميا حتى أنها تنتهي في نقطة نهاية محددة سلفا. تزن الهامستر يوميا، والبحث عن معايير نقطة النهاية: فقدان الشهية أو مشيه أو تنفس صعوبة، والسجود، والفراء تكدرت، أو فقدان > 10% من بلوغ الحد الأقصى للوزن.
تجربة في المختبر
1. في يوم التحدي، تطعيم 3 قوارير 25 مل من أمية + كم مع 5 مل مجموعة الإدخال. تنمو الثقافات عند 30 درجة مئوية تحت الانفعالات 150 دورة في الدقيقة.
2. عد ليبتوسبيريس يوميا باستخدام أحد أساليب الفقرة 2.1.2. عندما تصل الكثافة إلى ≈ 1 × 10⁸/mL، تدور أسفل كل تعليق لمدة 20 دقيقة في 3,220 س ز.
3. تخزين الكريات الخلية في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
الحصاد والتخزين للأنسجة
1. Euthanize الحيوانات باستنشاق isoflurane تليها thoracotomy الثنائية²⁶.
2. جمع فورا 1 إلى 2 مل دم من خلال ثقب القلب مع 3 مل حقنه وابرة 25 x 5/8 ". نقل الدم في أنبوب يحتوي على يدتا. مزيج من انعكاس، 5 إلى 6 مرات.
3. جمع أحد الكلي و ⅓ إلى ½ الفص المتوسط البطني من الكبد إلى كريوتوبيس.
4. تخزين الأنسجة في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3-تشييد المكتبات الجينوم للتسلسل الفائق (الشكل 4)

استخراج الحمض النووي
1. استخراج الحمض النووي من الدم.
  1. نقل 100 ميليلتر من الدم من الأنبوب أدتا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي.
  2. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي. اتبع إرشادات الشركة المصنعة.
2. استخراج الحمض النووي من الأنسجة.
  1. استخدام المشارط والمقص، النرد بين 50 إلى 80 ملغ كل جهاز إلى قطع صغيرة (1 مم × 1 مم)، وتحويلها إلى أنبوب جاف ملولبة عقيمة. قياس وزن الأنسجة بدقة توازن.
  2. إضافة 500 ميليلتر من PBS العقيمة في الأنبوب.
  3. مجانسة العينات باستخدام disruptor 1 دقيقة في حركات 5 في الثانية الواحدة.
  4. حساب حجم الموافق 25 ملغ أنسجة باستخدام المعادلة التالية:
  5. نقل وحدة التخزين المحسوبة في الطقم استخراج الحمض النووي. المضي قدما في تنقية الحمض النووي اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
3. استخراج الحمض النووي من ثقافات حوض سباحة و في المختبر الإدخال.
  1. ذوبان الجليد الكريات البكتيرية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق.
  2. المضي قدما في استخراج الحمض النووي اتباع التعليمات المصاحبة لهذه المجموعة.
4. تخزين الحمض النووي في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
قص الحمض النووي (الرقم 5)
1. نقل 50 ميليلتر من الحمض النووي المستخرج على أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
2. ضع الأنابيب في الرف سونيكاتور القرن الأفريقي كأس مليء بالماء البارد (4 درجات مئوية).
3. قم بتشغيل سونيكاتور لمدة 3 دقائق في كثافة 80% مع 10 ق على النبض و 5 s إيقاف النبض.
  تنبيه: ارتداء الإذن قد يفشل أو سدادات الإذن لحماية السمع.
4. تشغيل 2.5 ميليلتر من المنفصمة الحمض النووي على 2% [اغروس] هلام للتأكد من أن معظم من الحمض النووي < 600 شركة بريتيش بتروليوم في الحجم.
إضافة ج-الذيل
1. قياس تركيز الحمض النووي مع جهاز المطياف الضوئي صغيرة حجم.
2. حساب حجم المقابلة إلى 500 نانوغرام من الحمض النووي باستخدام المعادلة التالية:
3. إعداد رد فعل تراجع (الجدول 4). احتضان ح 1 في 37 درجة مئوية؛ إلغاء تنشيط عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  ملاحظة: للعينات التي تحتاج إلى تعديل لوحدة تخزين أكبر من 14.5 ميليلتر، زيادة حجم النهائي من رد فعل ميليلتر 40 والارتقاء بالمكونات المتبقية وفقا لذلك.
4. تنظيف العينات مع مجموعة تنقية PCR. الوت الحمض النووي مع 12 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت.
يعشق [بكر]
1. بكر #1
  1. إعداد يمزج PCR وفقا الجداول 3 و 5. نقل 22 ميليلتر من مزيج مكتبة لكل أنبوبة بكر وإضافة 3 ميليلتر لتنقية الحمض النووي. المضي قدما وبالمثل مع مزيج التحكم.
    ملاحظة: TnkN3 التمهيدي¹⁷ محددة إلى ينقول والتمهيدي olj376⁶ محددة إلى ج-الذيل. مزيج التحكم ينقصنا التمهيدي TnkN3، التي تستهدف على وجه التحديد ينقول.
  2. تشغيل البرنامج التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ دورات 24: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
2. بكر #2.
  1. إعداد يمزج PCR الثانية وفقا الجداول 3 و 6. نقل ميليلتر 49 من هذا المزيج مكتبة لكل أنبوبة بكر وإضافة 1 ميليلتر من رد فعل المكتبة بكر #1. نقل ميليلتر 24.5 مزيج التحكم لكل أنبوبة بكر وإضافة 0.5 ميليلتر بكر #1 مراقبة رد الفعل.
    ملاحظة: pMargent2 التمهيدي محددة إلى ينقول، و الإشعال الملكية الفكرية⁶ تحتوي على ستة-قاعدة-زوج الباركود وتسلسل معين المعترف بها منصة الجيل المقبل تسلسل.
  2. تشغيل البرنامج التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ دورات 18: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
3. تشغيل 3 ميليلتر 2% [اغروس] هلام. يجب أن تظهر المكتبة تشويه مع غالبية إشارة بين 200 إلى 600 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 6) وأي تضخيم لمراقبة رد فعل.
تنقية منتجات PCR.
ملاحظة: تنظيف المكتبات الجينوم مع مجموعة تنقية PCR اتباع إرشادات الشركة المصنعة. الوت الحمض النووي مع 30 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت.
قياس تركيز الحمض النووي باستخدام فلوروميتير. متوسط القراءات 2 إلى 3.
حساب حجم كل مكتبة ما يعادل 15 أو 20 نانوغرام باستخدام المعادلة التالية:
ميكس جميع المكتبات معا وفقا لحسابات سابقة. تحديد التركيز المولى من الحمض النووي مع المعادلة في الموقع التالي:
http://www.molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_07.html
تنبيه: تعتمد متطلبات تركيز وحجم الحمض النووي على منصة التسلسل.

4-الفائق تسلسل وتحليل البيانات

التسلسل
1. تسلسل المكتبات ك 64 بي بي واحد في نهاية ما يلي: استخدام pMargent3 التمهيدي تسلسل مخصصة والتمهيدي تسلسل التجارية القياسية. سوف توفر لك منصة تسلسل ملفات فستق مع جميع ما يلي التسلسل.
تحليل مع برنامج غالاكسي
1. تحميل ملف تسلسل الجينوم
  1. في الصفحة الرئيسية قاعدة البيانات سبيروسكوبي (راجع الخطوة 1.2.7 للارتباط)، حدد الكائن المستخدمة للتجربة، وانقر فوق "تحميل في مستعرض الجينوم".
  2. في شريط الأدوات (بالقرب من الجزء العلوي من الصفحة الرئيسية)، حدد "البحث والتصدير > تحميل البيانات"، في السطر "تسلسل (فاستا)"، انقر فوق "الجينوم" لتحميل التسلسل.
  3. افتح الملف باستخدام المفكرة (PC) أو TextEdit (Mac) وإعادة تسمية الكروموسوم (على سبيل المثال "شري"). الاحتفاظ بتنسيق فاستا.
  4. اتبع نفس الخطوات لتحميل تسلسل كروموسوم الثاني. الجمع بين كلا تسلسل كروموسوم في ملف txt واحد عن طريق النسخ واللصق.
    ملاحظة: تسلسل كروموسوم يمكن أيضا تحميلها من موقع نكبي (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) ودمجها في ملف txt واحد.
2. تحميل ملفات إلى ملقم غالاكسي
  ملاحظة: نظام غالاكسي هو مفتوح مصدر، منصة المستندة إلى ويب لإدارة البيانات المعلوماتية الحيوية المكثفة مهام سير العمل²⁷^،^،من²⁸²⁹^،³⁰ ويمكن الوصول إليها في https://usegalaxy.org/.
  1. في القائمة أدوات، حدد "الحصول على البيانات > تحميل ملف من جهاز الكمبيوتر الخاص بك". سحب وإسقاط الملفات.fastq المتولدة عن منهاج التسلسل في الإطار ثم انقر فوق "ابدأ".
  2. اتبع نفس الخطوات لتحميل الملف.txt Leptospira تسلسل الجينوم.
3. العريس يقرأ
  1. حدد "خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب > فستق [غروومر]" من القائمة أدوات.
  2. بجوار الملف العريس، حدد في المكتبات التي تم تحميلها في الخطوة 4-2-2. في "فستق مدخلات" نوعية عشرات نوع، حدد نظام التسلسل الملائم. "الحصول على خيارات متقدمة"، ترك "إخفاء مكتب متقدمة" مختارة.
  3. انقر فوق "تنفيذ".
4. إزالة التحف التسلسل
  1. حدد "خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب > إزالة تسلسل القطع الأثرية". بجوار مكتبة للتصفية، قم بتحديد الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.3 أعدادهم. انقر فوق "تنفيذ".
5. إزالة تسلسل ج-الذيل
  ملاحظة: تكرار تتم إزالة هذه الخطوات مرة واحدة أو مرتين لضمان جميع ج-ذيول.
  1. حدد "خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب > مقطع تسلسل محول".
  2. حدد أو أدخل ما يلي:
    مكتبة قصاصة: قم بتحديد الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوة 4-2-4.
    طول التسلسل الحد الأدنى: 15
    المصدر: أدخل تسلسل مخصص
    أدخل تسلسل القطع المخصصة: ككككككك
    قم بإدخال قيمة غير صفرية للحفاظ على تسلسل محول وقواعد x التي تليه: 0
    تجاهل تسلسل مع غير معروف (ن) القواعد: نعم
    خيارات الإخراج: إخراج تسلسل المقطوعة وغير قص
  3. انقر فوق "تنفيذ".
6. إزالة تسلسل محول
  1. حدد "خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب > مقطع تسلسل محول".
  2. حدد أو أدخل ما يلي:
  3. مكتبة قصاصة: قم بتحديد الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.5.
  4. طول التسلسل الحد الأدنى: 15
  5. المصدر: أدخل تسلسل مخصص
  6. أدخل تسلسل القطع المخصصة: كجتاتجككجتكتكتجكتج
  7. قم بإدخال قيمة غير صفرية للحفاظ على تسلسل محول وقواعد x التي تليه: 0
  8. تجاهل تسلسل مع غير معروف (ن) القواعد: نعم
  9. خيارات الإخراج: إخراج تسلسل المقطوعة وغير قص
  10. انقر فوق "تنفيذ".
7. تصفية ما يلي بناء على جودتها
  1. حدد "خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب > تصفية حسب نوعية".
    ملاحظة: هذه الأداة بتحديد ما يلي: استناداً إلى نقاط الجودة.
  2. حدد ما يلي:
    مكتبة لتصفية: تحديد الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.6.
    قيمة إنتاج نوعية: 20
    في المئة من قواعد في التسلسل الذي يجب أن يكون لديك نوعية على قدم المساواة إلى/أعلى من قيمة الوقف: 95
  3. انقر فوق "تنفيذ".
    ملاحظة: هذه الإعدادات، يتم تجاهل ما يلي: أقصر من النيوكليوتيدات 20 أو مع درجة جودة من 20 أو أقل من 95 في المائة من الدورات. التكيف مع إعدادات التقشف للتجربة الخاصة بك.
8. يقرأ الخريطة³²
  1. حدد "خ ع: رسم الخرائط > Bowtie2"³².
  2. حدد ما يلي في الحقول في الإطار الرئيسي:
    هو مكتبة مفردة أو إقران هذه: واحدة في نهاية
    ملف فستق: حدد المكتبة التي تمت تصفيتها للجودة من الخطوة 4.2.7.
    كتابة القراءات محازى (في شكل فاستق) لفصل الملف (الملفات): لا يوجد
    كتابة القراءات المنحازة (في شكل فستق) لفصل الملف (الملفات): لا يوجد
    سوف حدد جينوم إشارة من التاريخ الخاص بك أو استخدام فهرس مدمج؟: استخدام جينوم من التاريخ وبناء الفهرس
    حدد مرجع الجينوم: اختر تحميل الملف genome.txt Leptospira في خطوة 4-2-2.
    مجموعة قراءة معلومات مجموعات؟: لا تقم بتعيين
    حدد تحليل الوضع: 1: الإعداد الافتراضي فقط
    هل تريد استخدام الإعدادات المسبقة؟: لا، مجرد استخدام الإعدادات الافتراضية
    حفظ الإحصاءات رسم الخرائط bowtie2 للتاريخ: لا
    وظيفة معلمات الموارد: استخدام المعلمات الافتراضية مورد الوظيفة
  3. انقر فوق "تنفيذ" لمحاذاة ما يلي للجينوم.
9. تحويل الملفات
  1. حدد "خ ع: سامتولس > تحويل سوق بكارا للأسلحة إلى سام أم سام".
  2. حدد ما يلي:
    ملف أم لتحويل: حدد تعيين مكتبة من الخطوة 4.2.8.
    خيارات رأس: تضمين رأس في إخراج سام (-h)
  3. انقر فوق "تنفيذ".
10. تحويل الملفات
  1. حدد "خ ع: سامتولس > تحويل سام للفاصل الزمني".
  2. حدد ما يلي:
    حدد مجموعة البيانات لتحويل: حدد ملف المكتبة المعينة سام التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.9.
    طباعة كافة؟: نعم
  3. انقر فوق "تنفيذ".
11. فرز ما يلي:
  1. حدد "عامل تصفية وفرز > فرز البيانات في ترتيب تصاعدي أو تنازلي".
  2. حدد ما يلي:
    نوع البيانات: حدد ملف الفاصل الزمني التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.10.
    في عمود: 2
    مع نكهة: الترتيب العددي
    كل شيء في: ترتيب تصاعدي
  3. انقر فوق "تنفيذ".
12. حدد ما يلي: مطابقة كروموسوم أنا
  1. حدد "عامل تصفية وفرز > حدد الخطوط التي تتطابق مع تعبير".
  2. حدد ما يلي:
    حدد أسطر من: حدد ملف مع فرز القراءات التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.11.
    أن: مطابقة
    النمط: أدخل اسم كروموسوم كما تحدد في الخطوة 4.2.1.3 (على سبيل المثال، "تشري").
  3. انقر فوق "تنفيذ".
13. حدد مطابقة الكروموسوم الثاني ما يلي:
  المضي قدما في أعقاب الخطوة 4.2.12.
14. مجموعة يقرأ وفقا لمواقع عمليات الإدراج في كروموسوم
  1. حدد "Join، طرح والمجموعة > تجميع البيانات حسب عمود وتنفيذ عملية تجميعية على الأعمدة الأخرى".
  2. حدد ما يلي:
    حدد البيانات: حدد الملف الناتج من الخطوة 4.2.12.
    مجموعة من الأعمدة: 2
    تجاهل القضية أثناء التجميع؟: لا
    تجاهل الأسطر التي تبدأ بهذه الأحرف: Ø
    العملية > + عملية الإدراج
    النوع: العد
    في عمود: 2
    تقريب النتيجة إلى أقرب عدد صحيح: لا
  3. انقر فوق "تنفيذ".
15. يقرأ مجموعة وفقا لمواقع الإدراج في الكروموسوم الثاني
  المضي قدما في أعقاب الخطوة 4.2.14.
16. الإدراج فرز المواقع على كروموسوم
  1. حدد "عامل تصفية وفرز > فرز البيانات في ترتيب تصاعدي أو تنازلي".
  2. حدد ما يلي:
    نوع Dataset: حدد الملف من الخطوة 4.2.14.
    في عمود: 1
    مع نكهة: الترتيب العددي
    كل شيء في: ترتيب تصاعدي
  3. انقر فوق "تنفيذ".
17. فرز المواقع الإدراج على كروموسوم الثاني
  المضي قدما في أعقاب الخطوة كلية 4.2.16.
التحليل الإحصائي
1. نقل البيانات غالاكسي في ملفات جدول بيانات عن طريق نسخ ولصق العمودين من الخطوات كلية 4.2.16. و 4.2.17. إلى ملف Excel.
  ملاحظة: العمود الأول هو إحداثي الموقع الإدراج ينقول النوكليوتيدات، والعمود الثاني هو عدد ما يلي في كل موقع الإدراج.
2. تحديد الجينات إيواء ينقول استخدام تنسيق النوكليوتيدات المنصوص عليها في الجدول.
  ملاحظة: على سبيل المثال، ينقول إدراجها في النوكليوتيدات #30718 من كروموسوم الموجود في الجينات LIC10024 ، الذي يمتد النيوكليوتيدات كروموسوم في 29263-31539 أنا.
3. حساب الترددات النسبية (و) لكل متحولة في كل الأنسجة وفي تجمع الإدخال بعد المعادلة أدناه:
4. حساب نسب الإخراج/الإدخال (R) لكل المسخ والأنسجة باستخدام المعادلة التالية:
5. اختبار رتبة وقعت الرتبي
  1. تطبيع جميع النسب الإدخال/الإخراج بتعيين نسبة متوسط لكل الأنسجة في كل الحيوانات إلى 1.0. أي بنسبة 1.0 محايد، > 1.0 غير ملائم، و < 1.0 هو مفيد³³.
  2. مقارنة نسب الإخراج/الإدخال إلى 1.0 (اللياقة البدنية المحايدة) باستخدام اختبار التصنيف الرتبي مع قيم P < 0.05 نظرت يعتد به إحصائيا.

النتائج

إنشاء مكتبة طفرات ينقول في إينتيروجانس L. بالاقتران يتطلب وحدة ترشيح، كما هو مبين في الشكل 1. أننا تعافي ترانسكونجوجانتس 100-200 من كل التزاوج.

يتم تحديد موقع الإدراج ينقول في كل متحولة حسب تسلسل المنتج بكر ولده بكر شبه عش...

Discussion

على الرغم من أن يتم عرض النتائج من لدينا تجربة رائدة لتحدي إينترابيريتونيلي مع 42 إينتيروجانس L. طفرات الهامستر¹⁷، ونتوقع أن تجمعات أكبر من طفرات يمكن أن يكون صاحبها ما يليها تينيسي لأن تواتر ترانسكونجوجانتس منخفضة (100-200 ترانسكونجوجانتس/التزاوج)، ماتينجس عدة ضرورية لإنشاء...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

أيد هذا العمل على "جائزة الجدارة شؤون قدامى المحاربين" (إلى D.A.H.)، و "المعهد الوطني للصحة" منح R01 منظمة العفو الدولية 034431 (D.A.H.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma-Aldrich	K4000
2,6-diaminopimelic acid	Sigma-Aldrich	D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate	Sigma-Aldrich	S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser	Zeiss	490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit	Qiagen	69504/69506
MinElute PCR Purification	Qiagen	28004/28006
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB-505
2.5" Cup horn	Fisher Scientific	FB-4625
Bead Ruptor 24	Omni International	19-010	Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase	Promega	M828C
Master mix Phusion	Thermo Scientific	F531	Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix	Thermo Scientific	K9011/K9012	Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP	Thermo Scientific	R0151
ddCTP	Affymetrix/ USBProducts	77112
T100 Thermal cycler	BioRad	1861096
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q32851/Q32854	step 3.6.
Qubit assay tubes	life technologies	Q32856	step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X)	Gibco	20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10	Feather	2975#10
Plastic K₂ EDTA 2 ml tubes	BD vacutainer	367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle	BD vacutainer	329652	IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe	BD vacutainer	309657	Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle	BD vacutainer	305901	Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper	EMD Millipore	XX1002502	Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp	EMD Millipore	XX1002503	Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel	EMD Millipore	XX1002514	Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask	EMD Millipore	XX1002505	Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm)	EMD Millipore	VVLP02500

References

Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
Wunder, E. A., et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
Miller, J. . Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

130 Leptospira

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: