نهج بسيط للحث على العصب الذاتية التجريبية في الفئران C57BL/6 للتقييمات الفنية ولاثيل

Summary

يوجز هذا التقرير نهج بسيط للحث على نجاح العصب الذاتية التجريبية (EAN) استخدام البروتين المايلين صفر الببتيد_180-199 (P0) في تركيبة مع adjuvant فروند بالكامل والسمية السعال الديكي. نحن نقدم نموذجا متطورة قادرة على دقة تقدير مدى عجز وظيفي وأمراض الأعصاب التي تحدث في هذا EAN.

Abstract

العصب الذاتية التجريبية (EAN) نموذج تجريبي يحظى بتقدير جيد لأمراض المناعة الذاتية دملينتينغ الطرفية. فعل المرض EAN تحصين الفئران مع الببتيدات العصبية لتوجيه هجوم تحريضية تجاه مكونات الجهاز العصبي المحيطي (PNS). ومكنت التطورات الأخيرة استحثاث EAN في السطر الماوس C57BL/6 مقاومة نسبيا استخدام البروتين المايلين صفر (P0)_106-125 أو الببتيدات_180-199 P0 تسليمها في adjuvant جنبا إلى جنب مع حقن السم السعال الديكي. القدرة على حفز EAN في سلالة C57BL/6 يسمح باستخدام العديد من الأدوات الوراثية الموجودة على هذه الخلفية الماوس، ويسمح بالتالي دراسة إمراضية المرض متطورة والاستجواب للعمل آليا للمداواة الرواية في تركيبة مع نهج محوره وراثيا. في هذه الدراسة، ندلل على نهج بسيط لحمل EAN استخدام الببتيد_180-199 P0 في الفئران C57BL/6 بنجاح. أننا أيضا مخطط بروتوكول لتقييم العجز الوظيفية التي تحدث في هذا النموذج، مصحوبا بمجموعة من الميزات لاثيل. وهكذا، هذا النموذج هو نموذج تجريبي قوية لدراسة الآلية المرضية لاعتلالات الأعصاب دملينتينغ الطرفية البشرية، وتحديد مدى فعالية العلاجات المحتملة التي تهدف إلى تشجيع إصلاح المايلين وحماية ضد تلف الأعصاب في المناعة الذاتية العصب.

Introduction

اعتلالات الأعصاب الطرفية يمكن أن تكون وراثية في الأصل أو المكتسبة، أما مع اعتلالات الأعصاب المكتسبة بعد أما الإقفارية الأيضية،، بريسيبيتانتس الملتهبة أو السامة. يكون من المفيد أيضا تصنف هذه الأمراض أما محواري أو ديميليناتيفي في الأصل. الأكثر شيوعاً اكتسب دملينتينغ اعتلالات الأعصاب المحيطية هي "اعتلال دملينتينغ الالتهابات الحادة" (الرابطة، المعروف أيضا بمتلازمة غيان-باريه GBS) واعتلال دملينتينغ التهاب مزمن (سبب)^{1، 2 , 3 , 4}؛ باثوجينيتيكالي على حد سواء تتسم بفعل المناعة الذاتية ضد غمد المايلين، مما تسبب في ديمييلينيشن الأعصاب المحيطية. في هذه الأمراض، وتنشيط خلايا تي عبور حاجز الدم في الأعصاب وتولد رد فعل المناعة في السندات الإذنية. يؤدي تنشيط الضامة داخل العصب ثم demyelination أما مباشرة عن طريق هجوم متجولة أو غير مباشر عن طريق وسطاء التهابات يفرزها، نتج عنه عجز السريرية مثل الشلل والخلل الحسي⁵. بينما محاور عصبية ديميليناتيد الاحتفاظ بالقدرة على أن تكون ريميليناتيد بعد ديميليناتيون، ريميليناتيون غالباً ما يتأخر أو غير مكتملة، أسفر عن قابلية محاور عصبية عارية لضرر لا يمكن إصلاحه، وهو السبب الرئيسي للدائم السريرية العجز. حاليا العلاجات الأكثر فعالية إيمونومودولاتوري، ولكن على الرغم من فعاليتها، في كثير من الحالات الانتعاش بطيء غالباً، والمرضى ~ 25% سوف تواجه العجز الوظيفية المتبقية التي تقلل إلى حد كبير على نوعية حياة^{6، 7}.

EAN هو نموذج حيوانية مستخدمة على نطاق واسع من دملينتينغ الأعصاب الطرفية التي قدمت أفكاراً قيمة في المرضية ووسيلة لتقييم العوامل العلاجية رواية⁴. يمكن أن يتسبب هذا الطراز في الأنواع المختلفة مثل الأرانب، الجرذان، الفئران وخنازير غينيا، وهو فعل التحصين مع المستضدات العصبية. ومع ذلك، في نهاية المطاف التعريفي EAN ناجحة يعتمد على استجابة مناعية مناسبة للمرض إلى حدوث. ونظرا للاختلافات الأنواع (وبينها species/سلالة) في وظيفة المناعة، قد وضعت مجموعات متعددة من المستضدات، ومأمونية بنجاح حمل EAN. من حيث الأدوات الوراثية مورين، C57BL/6 هو الأكثر استخداماً؛ ومع ذلك، الببتيد بروتين P2 التقليدية 57-81 (P2_57-81) التي ينتج عنها مرض في سلالة من الماوس سخل عرضه⁸ غير قادر على المرضية غير المشروعة مما أدى إلى عجز وظيفي في سلالة C57BL/6. لحسن الحظ، تسليم نماذج التوعية باستخدام P0_106-125 أو الببتيدات P0_180-199 ، في adjuvant جنبا إلى جنب مع حقن السعال الديكي السمية يمكن التغلب على هذا الحاجز، تمكين أدوات الجينية المتطورة التي ستستخدم في موريني EAN النموذجي.

ويرد هنا، طريقة بسيطة لاستحثاث EAN في الفئران C57BL/6. وباﻹضافة إلى ذلك، تقدم نهجاً مفصلة شاملة لتقييم العجز الوظيفي ولاثيل المرتبطة بهذا المرض. واختير P0_180–199 الببتيد⁹ تفضيل البديل_57-81 P0¹⁰. الطراز_{199 180–}P0 قد وصفت لإنتاج علامات سريرية أقل حدة بالمقارنة مع البديل_57-81 P0¹⁰فمن المرجح أن تحمل إدخال يحتمل أن الاضطرابات الوراثية الضارة، التعافي من العمليات الجراحية (مثل غرس مضخة ناضح)، وهي قابلة للمطحنة مشيه دالة اختبار⁴. ومع ذلك، الاختبارات الدالة مشيه المطحنة وغذائها البروتوكولات المذكورة هنا يمكن بسهولة تطبيق عند دراسة هذا المرض في متغير_57-81 التي يسببها P0.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

كافة الإجراءات الموصوفة هنا أقرها المعهد فلوري لعلم الأعصاب والصحة العقلية (مركز الدماغ ملبورن) الحيوان لجنة الأخلاقيات واتبع "قانون الممارسة الأسترالية" "استخدام الحيوانات" للعلم الأغراض-

1-تحريض EAN

ملاحظة: EAN يمكن أن يتسبب بنجاح في الفئران C57BL/6 الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 6 8 أسابيع. البروتوكول التوجيهي يأخذ 9 أيام في المجموع. اليوم 0 يشير إلى يوم التحصين الأولى. لهذا البروتوكول، وقد أجريت الحقن تحت التخدير (راجع الخطوة 1-1-2 أدناه)-

1. "في اليوم"-1:
   1. إعداد "السم السعال الديكي" حل (انظر الجدول للمواد) 1.6 ميكروغرام/مل باستخدام الفوسفات متساوي التوتر الماوس عقيم في م 0.1 مخزنة المالحة (طن متري-برنامج تلفزيوني).
   2. أنيسثيتيزيشن مع إيسوفلوراني:
      1. ضع الماوس (C57BL/6، ذكر، 6-8 أسابيع) في قاعة أنيسثيتيزيشن وضبط تدفق الأوكسجين إلى 1 لتر/دقيقة
      2. قم بتشغيل المرذاذ isoflurane وضبطه إلى 2.5 في المائة لمراقبة التنفس وأنيسثيتيزيشن، وانتظر لمدة 2 دقيقة، أو حتى ردود الفعل الأولية (أطرافهم القرنية وهند) التي لم تعد تستجيب
   3. إزالة الماوس من قاعة أنيسثيتيزيشن وإدارة 250 ميليلتر من الحل "السمية السعال الديكي" أعلاه عن طريق حقن داخل (القائمة) استخدام 0.5 مل حقنه بإبرة 30 ^1/2 ز.
   4. تعد العدوى عن طريق الحقن للتحصين:
      1. تحضير الحل استخدام حل 2 مغ/مل من P0 الببتيد _180-199 (مع > نقاوة 98%، تسلسل S-S-K-R-G-R-قتبفلياملدهسرس) في المحلول الملحي 0.9 ٪.
      2. تحضير حل ب استخدام الحل 20 ملغ/مل من بكتريا السل (انظر الجدول للمواد) في فروند ' s كاملة adjuvant (قانون المنافسة المنصفة، تتألف من: مونولاتي مانيدي 15% + 85% من زيت البارافين و 0.5 ملغ/مل من يهتمان قتلوا والمجففة الزبدية متفطره M)-
      3. جعل العدوى النهائي للحقن، الجمع بين أجزاء متساوية الحجم من حلول A و B في الخافق حبة ومزجها في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
         ملاحظة: الحلول A و B يمكن الاحتفاظ بها كمخزون وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها شهر واحد ولكن العدوى النهائي الموحد يجب أن يكون مستعدا طازجة في يوم حقن الفأر.
2. "في اليوم" 0، إدارة 50 ميليلتر من العدوى (الإعداد المذكورة في الخطوة 1.1.4) في ماوس عن طريق حقن تحت الجلد استخدام إبرة 23 ز.
   ملاحظة: الحقن يمكن أن توضع بين ريش الكتف، أو بين أطرافهم هند وذيل على dorsum والذيلية.
3. في اليوم 1، جعل الحل "السمية السعال الديكي" 1.2 ميكروغرام/مل (في النقل المتعدد الوسائط-برنامج تلفزيوني) وإدارة 250 ميليلتر في ماوس عن طريق الحقن القائمة باستخدام 0.5 مل حقنه بإبرة 30 ^1/2 ز.
4. في 3 يوم، كرر الخطوة 1-3 أعلاه.
   ملاحظة: يمكن أن تتكون حلول الأسهم A و B والمخزنة في ˚C 4 لمدة أقصاها شهر واحد. غير أن العدوى عن طريق الحقن النهائي، أنتجت عن طريق الجمع بين الحلول الأسهم A و B، يجب أن يتم في اليوم للحقن.
5. في يوم 8، إدارة 50 ميليلتر من العدوى (الإعداد المذكورة في الخطوة 1.1.4) في ماوس عن طريق حقنه تحت الجلد (راجع الخطوة 1-2 أعلاه)، في موقع الحقن نفسها كما في الخطوة 1، 2 (لكل الحيوانات)

2-"التهديف السريرية"

1. أداء التهديف السريرية بها يوميا ابتداء من اليوم 0.
2. إعطاء كل الماوس على درجة من 0، 1، 2، 3، أو 4 وفقا لمعايير منشورة ⁴. انظر الجدول 1 للتهديف السريرية EAN.
   ملاحظة: للاتساق، ينبغي بذل مجهود نقاط الفئران في نفس الوقت يوميا بنفس الباحث.

3. السيارات "تقييم الدالة"

ملاحظة: تقييم أداء المحرك بالتوازي مع التهديف السريرية للفوج نفسه من الحيوانات. يجب أن تكون متصلاً جهاز تقييم الدالة السيارات إلى جهاز كمبيوتر أن له (انظر الجدول للمواد) تركيب جهاز تصوير دالة مشيه. من المستحسن أيضا أن جميع الفئران تقييم ينبغي أن اعتادوا على المهمة قيد التشغيل قبل التعريفي EAN. للقيام بذلك، تتم ممارسة تشغيل (تشغيل الاختبار 2 للماوس) ثلاثة أيام قبل تحريض المرض (اليوم-3)-

1. بدوره على جهاز تقييم وظيفة الحركة والتبديل على زر الضوء.
2. القفا الماوس بحزم والحبر قدميها بتخفيض على حاوية مليئة بالحبر الأحمر بينما يمسك ذيله.
   ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة لسلالة C57BL/6، ولكن يمكن تخطي إذا كان يتم استخدام سلالة ماوس مع لون معطف أبيض-
3. ضع الماوس في المقصورة المشي وتعيين سرعة المطحنة في 15 سم/س.
4. تشغيل في حلقة مفرغة وانقر " سجل " الزر لالتقاط حركة تشغيل الماوس باستخدام الدالة مشيه نظام التصوير (انظر الجدول للمواد).
استخدام جهاز ضبط وقت
5. وقياس كل تشغيل 36 s. بعد 36 ثانية، وإيقاف التسجيل ووقف حلقة مفرغة.
   ملاحظة: تعتبر الفئران التي لا يمكن إكمال بنجاح هذه المهمة قيد التشغيل لهذا الفاصل s 36 لم.
6. حفظ ملف الفيديو في مجلد معين.
7. كرر الخطوات أعلاه لكل الماوس لتقييمها. اختبار الفئران بنفس المهمة قيد التشغيل كل 3 أيام-
8. تحليل ملفات الفيديو تم تحريرها باستخدام البرمجيات لمعلمات الدالة مشيه (انظر الجدول للمواد)-
   ملاحظة: تفاصيل كيفية تحليل معلمات الحركية المختلفة تختلف بين البرامج حتى الرجاء الرجوع إلى الشركة المصنعة ' تعليمة s قبل التحليل. للحصول على أدلة النسيجي محواري وتلف المايلين عبر إيمونوهيستوتشيميستري أو المجهر الإلكتروني، الحيوان الأنسجة يمكن أن تتخذ في أي مرحلة وظيفة وظيفة الحركة التقييم اعتماداً على أهداف محددة للبحوث-

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الببتيد_180-199 P0 المستحث EAN C57BL/6 الفئران يؤدي إلى مرض أحادية الطور مع نقاط سريرية بداية من بعد 6 أيام ويلاحظ أول التحصين (نقطة في البوصة)، والأعلى درجة الخطورة من 25 نقطة في البوصة متبوعاً ببعض نقاط السريرية تحسن من 40 نقطة في البوصة المدة (الشكل 1)^...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويوجز هذا التقرير طريقة بسيطة لحمل EAN استخدام الببتيد_180-199 P0 في الفئران C57BL/6، وتمكين التحديد الكمي للعجز لاثيل والوظيفية الرئيسية في الفئران التي يسببها مع EAN. متميزة في بروتوكول التعريفي EAN الموصوفة هنا استخدام التخدير أثناء إجراء حقن التحصين. استخدام التخدير isoflurane يعزز إلى حد كبير ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old	Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin	List Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS)			Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane	Pharmachem, QLD, Australia		Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)	Difco, MI, USA	#231141
Freund's complete adjuvant (FCA)	Difco, MI, USA	#263910
16% Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	#15710	Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium	Sakura Finetek, CA, USA	#4583
Normal donkey serum	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, USA	#90o2-31-1	Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, USA	S12700	Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)	Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel		Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies	Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA	Various	Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution	Dako (Agilent), CA, USA	#S3023	Each laboratory will have their own preference.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles	BD	#326105
23 g needles	BD	#305143
Red ink pad			Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch			Any timer may be used.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope	Zeiss		Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments			Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber			Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene	GeneTex (USA)		Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope	Zeis LSM780		Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J	National Institues of Health		Available from www.fiji.sc