JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف لنا هنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة بطلاء البكتيريا مع البيوتين وستريبتافيدين.

Abstract

Typhimurium السالمونيلا هو بكتيريا داخل الخلايا اختياري الذي يسبب التهاب المعدة والأمعاء في البشر. وبعد غزو بروبريا الصفيحة, S. البكتيريا تيفيموريوم يتم بسرعة الكشف عن فاجوسيتيزيد التي الضامة والواردة في حويصلات المعروفة فاجوسوميس من أجل أن يتحلل. عزل من س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة كيفية س. العدوى تيفيموريوم يغير عملية نضج يبلوع لمنع تدهور البكتيرية. كلاسيكي، عزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس قامت به السكروز التدرج الطرد المركزي. بيد أن هذه العملية تستغرق وقتاً طويلاً، ويتطلب معدات متخصصة ودرجة معينة من المهارة. الموصوفة هنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة بطلاء البكتيريا مع البيوتين-ستريبتافيدين-مترافق الخرز المغناطيسية. يمكن تعليق فاجوسوميس التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة في أي مخزن من الاختيار، مما يتيح الاستفادة فاجوسوميس معزولة لمجموعة واسعة نطاق من فحوصات، مثل تحليل المستقلب، البروتين والدهن. باختصار، هذا الأسلوب لعزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس محددة، وتتسم بالكفاءة، السريعة، يتطلب الحد الأدنى من المعدات، وهو أكثر تنوعاً من الأسلوب الكلاسيكي للعزل بواسطة السكروز التدرج-تنبيذ فائق.

Introduction

يتم تعميم الضامة الخلايا متجولة المتخصصة التي كشف وتبتلع وتحط أي الجسيمات الأجنبية موجودة في الأنسجة المحيطية، بدءاً من الخلايا أبوبتوتيك إلى غزو الكائنات الدقيقة مثل البكتيريا. عند الحصول على الاعتراف بوساطة مستقبلات سطحية الممرض علامات محددة عادة موجودة على السطح من الكائنات الحية الدقيقة (المعروفة باسم أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة أو بامبس)، الضامة الشروع في إعادة تنظيم معقدة للغشاء الخلوي في النظام المحيطي و الممرض1فاجوسيتيزي.

ثم يرد الممرض انجولفيد بلعم في حويصلة داخل الخلايا المعروفة باسم يبلوع. من خلال سلسلة من الانصهار والانشطار الأحداث مع حويصلات أخرى مثل اندوسوميس وليسوسوميس، يكتسب يبلوع التي تحتوي على الكائنات الممرضة مجموعة من البروتينات اللازمة للقضاء على المحتوى فاجوسومال. ولذلك تكوين الانزيمية يبلوع اختلافاً كبيرا أثناء هذه العملية، المعروفة باسم يبلوع نضوج2.

بعد قليل من البلعمه، مولتيميريك ATPase رغوي المعقدة (الخامس-ATPase) أدمجت في الغشاء يبلوع بالانصهار مع اندوسوميس3. يستخدم هذا المركب ATP لمضخة البروتونات من سيتوسول إلى التجويف يبلوع4. تحمض يبلوع أمر ضروري لإحداث الانصهار مع غيرها من حويصلات5 لتفعيل عدد كبير من إنزيمات بوليمرات تعتمد على درجة الحموضة6. آخر مولتيميريك الانزيمية المعقدة التي يتم تجميعها بسرعة على الغشاء يبلوع هو مجمع نادف-أوكسيديز (NOX). أكاسيد النيتروجين المعقدة يكسد نادف بغية إنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) التي هي مخفي في التجويف يبلوع، وأن تسهم إسهاما كبيرا في قتل الكائنات الحية الدقيقة التي اجتاحت7.

أثناء الخطوات الأولى من النضج، يقدم فاجوسوميس علامات عادة مثل Rab5 و Rab7 من اندوسوميس المبكرة والمتأخرة على التوالي جنبا إلى جنب مع وحدة فرعية0 V v-ATPase8. نتائج انصهار فاجوسوميس مع ليسوسوميس واندوسوميس الراحل في التعرض لمسببات المرض فاجوسيتيزيد لمجموعة متنوعة من الإنزيمات هيدروليكي مثل البروتياز كاثيبسين، ليباسيس، وبيتا-جالاكتوسيداسي9. تحمض التجويف مطلوب أيضا لتفعيل هذه الإنزيمات. على سبيل المثال، هو انقسام كاثيبسين د لإنتاج النموذج القصير نشطة تعتمد على درجة الحموضة10. هذه الإنزيمات تتحلل مسببات المرض والتوسط من أجل إنتاج الببتيدات القصيرة المستمدة من العوامل الممرضة التي ترد بها بلعم histocompatibility الرئيسية (MHC) الفئة الثاني جزيئات معقدة لخلايا تي يؤدي استجابة المناعية تكيفية11.

ومن ثم، نضوج يبلوع حاسمة بالنسبة للاستجابة المناعية الفطرية ووصلات بالأسلحة الفطرية والتكيف في الجهاز المناعي. لا عجب أن مسببات الأمراض تطورت استراتيجيات للتغلب على القضاء بالضامة خلال عملية النضج يبلوع الموصوفة أعلاه. على سبيل المثال، منع البكتيريا داخل الخلايا متفطره و المستروحة فيلقيه يبلوع نضوج المثبطة الخامس-ATPase الجمعية وما يترتب عليها من التجويف التحمض12،13 . حمل البكتيريا الأخرى، مثل الليستريه المستوحدة أو فليكسنيري دوسنتاريا تشكيل المسام في غشاء يبلوع الهروب إلى14،سيتوسول15. من ناحية أخرى، انتيريكا السالمونيلا سرفار تيفيموريوم (S. تيفيموريوم) غير قادرة على تعديل خصائص يبلوع داخل المنقبضة لتحويله إلى موقع مناسب ل النسخ المتماثل16. هذه القدرة يجعل س. تيفيموريوم نموذجا مثيرا للاهتمام لدراسة التدخل الممرض بوساطة من النضج يبلوع.

س. تيفيموريوم هو بكتيريا داخل الخلايا اختياري الذي يسبب التهاب المعدة والأمعاء في البشر. وبعد غزو بروبريا الصفيحة، س. البكتيريا تيفيموريوم يتم بسرعة الكشف عن فاجوسيتيزيد التي الضامة والواردة ضمن فاجوسوميس17. ووصفت بعض تقارير سبق أن س. تيفيموريوم-فاجوسوميس التي تحتوي على صناع ل اندوسوميس وليسوسوميس18، وقد وجدت دراسات أخرى الانصهار يبلوع-يحلول حالت دون بناء س. تيفيموريوم العدوى19.

وفي البداية، يبلوع النضج عند س. كانت قد أجرت التحقيق الإصابة تيفيموريوم المجهري الفلورة. تطوير تقنيات لعزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس تمكين إجراء دراسة أكثر دقة لمحتوى يبلوع من حيث علامات دخلول ويحلول. وحتى الآن، والطريقة الرئيسية المستخدمة لعزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس هو تجزئة سوبسيلولار على السكروز خطوة التدرجات18،20. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب عدة خطوات الطرد المركزي التي يمكن أن تتسبب في الأضرار الميكانيكية إلى فاجوسوميس ويمكن أن يؤثر على استقرار مكونات فاجوسومال (البروتينات والدهون) ومضيعة للوقت. وعلاوة على ذلك، فإنه يتطلب استخدام أولتراسينتريفوجي: قطعة من المعدات المتخصصة التي لا يمكن الوصول إليها لكل مختبر.

مؤخرا، تم تطبيق نهج جديد لعزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس، التي وصفت مسببات الأمراض البكتيرية مع بيوتينيلاتيد ليبوبيتيدي (ليبوبيوتين) وفي وقت لاحق المستخرجة باستخدام الخرز المغناطيسي مترافق ستريبتافيدين21 . ونحن نقترح طريقة تكميلية بديلة بوسم البكتيرية الجزيئات السطحية التي تحتوي على أمين مع دائرة الصحة الوطنية--البيوتين تليها مترافق streptavidin الخرز المغناطيسية. فاجوسوميس التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة يتم التخصيب في علامات دخلول ويحلول ويمكن استخدامه لمجموعة واسعة نطاق من فحوصات، من تحليل البروتين بتحليل اوميكس. بالإضافة إلى ذلك، فإنه لا يتطلب معدات متخصصة مثل أولتراسينتريفوجيس. وعلاوة على ذلك، عن طريق القضاء على الخطوات الطرد المركزي، الأضرار الميكانيكية إلى فاجوسوميس ومقدار الوقت المستخدمة هي خفض كبير. هذا الأسلوب يمكن تكييفها بسهولة لعزل فاجوسوميس التي تحتوي على البكتيريا الأخرى، مثل إيجابية المكوّرات العنقودية الذهبية، وشملت أيضا في هذه المخطوطة. باختصار، هذا الأسلوب لعزل س. تيفيموريوم-تحتوي على فاجوسوميس وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة، وأقل استهلاكاً للوقت من عزلة الكلاسيكية من السكروز أثري تنبيذ فائق التدرج، مما يجعل درجة عالية فاجوسوميس المحتوية على البكتيريا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

جميع الخطوات التي تنطوي على استخدام الممرضة س. يجب أن يتم تيفيموريوم في BSL-2 أو مرفق أعلى من المستوى الأمن البيولوجي. الثقافة وطلاء من س. تيفيموريوم، فضلا عن انتقال العدوى إلى المشتقة من نخاع العظم الضامة (بمدمس) يجب أن يتم تحت غطاء الاندفاق الصفحي لمنع التلوث. عزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس يمكن أن يؤديها على أي مقعد مختبر BSL-2-

استخراج النخاع من الفئران لأن التفريق في الضامة كان يؤديها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية على الرفق بالحيوان ووافقت عليها "وكالة الدولة" شمال الراين-ويستفاليا للطبيعة، البيئة، وحماية المستهلك [لانديسامت für Natur، أومويلت وفيربراوتشيرشوتز (لانوف) نوردراين-فيستفالن؛ ملف لا: 84-02.05.40.14.082 و 84-02.04.2015.A443] وجامعة كولونيا-

1-كولتورينج تيفيموريوم س.

  1. إينوكولاتي س. تيفيموريوم (سلالة SL1344) من مستعمرة بكتيرية واحدة إلى 5 مل من الدماغ القلب ضخ (بهي) مرق استخدام حلقة بكتيرية.
  2. احتضان تعليق البكتيرية في حاضنة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الهز.
  3. اليوم التالي، نقل 1 مل تعليق البكتيرية إلى 19 مل مرق بهي في قارورة مخروطية واحتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة بالهز.
    4. رصد
  4. س. تيفيموريوم النمو عن طريق قياس الكثافة البصرية (OD) 600 نانومتر (OD 600) مع جهاز المطياف الضوئي. ينبغي أن تؤخذ قياسات تقريبا كل 30 دقيقة
  5. OD عند 600 تصل إلى 1.0، وإزالة تعليق البكتيرية من الحاضنة ونقل في أنبوب 50 مل. الطرد المركزي البكتيريا في 5,400 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 ° C.
  6. إزالة المادة طافية وريسوسبيند في 10 مل من المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS).
  7. أجهزة الطرد المركزي في 5,400 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  8. إزالة المادة طافية والبكتيريا في مل 4.9 من PBS العقيمة ريسوسبيند.

2. طلاء من S. typhimurium مع دائرة الصحة الوطنية--البيوتين/ستريبتافيدين-مترافق "المغناطيسي الخرز"

  1. إضافة 100 ميليلتر من 10 ملغ/مل البيوتين ربط الحل (دائرة الصحة الوطنية--البيوتين حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد، [دمس]) طازج، إلى تعليق البكتيرية إعدادها في الخطوة السابقة. على سبيل المثال، يؤدي إلى تمييع 5 ملغ من دائرة الصحة الوطنية--البيوتين إلى 0.5 مل من العقيمة [دمس]. مزيج صحيح من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات.
  2. تقسيم المزيج إلى خمسة أنابيب 1.5 مل.
  3. إينكوباتي ح 2 في درجة حرارة الغرفة (RT) على ثيرموبلوك مع الهز المستمر في 350 دورة في الدقيقة-
  4. الطرد المركزي أنابيب في 15,000 س ز لمدة 10 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية.
  5. ريسوسبيند في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، أجهزة الطرد المركزي في 15,000 س ز لمدة 10 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية.
  6. كرر الخطوة 2.5 أكثر مرتين لإزالة البيوتين الزائدة التي تربط الحل.
  7. بعد الغسيل الأخير، ريسوسبيند بيليه في 1 مل PBS العقيمة.
  8. نقل 100 ميليلتر من 10 ملغ/مل مترافق streptavidin المغناطيسي الخرز الحل في أنبوب 1.5 مل وترك الأمر على الرف المغناطيسي للحد الأدنى 5
  9. إزالة المذيب مع ماصة، واتخاذ الحل الخرز المغناطيسي streptavidin-مترافق من الرف المغناطيسية، وريسوسبيند أنه مع 1 مل تعليق البكتيريا المغلفة البيوتين إعدادها في الخطوة 2.7.
  10. إينكوباتي ح 1 في RT على ثيرموبلوك مع الهز المستمر في 350 دورة في الدقيقة-
  11. وضع الحل على الرف المغناطيسي؛ والانتظار لمدة 5 دقائق ثم قم بإزالة البكتيريا التي لم تتقيد على الجدار مع ماصة (يبقيه في أنبوب وصفت " البكتيريا المغلفة بغير "). هو الكسر التمسك بجدار الأنبوبة على اتصال بالمغناطيس البكتيريا البيوتين/ستريبتافيدين-المغلفة.
  12. إزالة الأنبوب الذي يحتوي على البكتيريا المسماة من الرف المغناطيسية وريسوسبيند في 1 مل PBS العقيمة.
  13. وضعه مرة أخرى على الرف المغناطيسية، والانتظار لمدة 5 دقائق، واستخدام ماصة لإزالة برنامج تلفزيوني-
  14. كرر الخطوتين 2.13 و 2.14 مرتين أخريين لإزالة جميع البكتيريا التي هي غير مطلي بالخرز المغناطيسي مترافق streptavidin.
  15. بعد الغسيل الأخير، ريسوسبيند هذه البكتيريا المغلفة في 500 ميليلتر من PBS العقيمة وتسمية الأنبوب ك " مغلفة بالبكتيريا ".
  16. عد مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) على حد سواء " البكتيريا المغلفة بغير " و " مغلفة بالبكتيريا " الحلول بطلاء تخفيف المسلسل على لوحات أجار بهي. يتم الحصول على حوالي 2 × 10 8 زيمبابوي/مل من البكتيريا المغلفة من 20 مل تعليق البكتيرية الأولية مع OD 600 من 1.0. تبقى وقف البكتريا المغلفة عند 4 درجة مئوية لاستخدامها في اليوم التالي لتصيب الضامة.

3. عدوى بدمدس

  1. في نفس اليوم عندما المغلفة البكتيريا مع البيوتين والخرز المغناطيسي مترافق streptavidin، لوحة كاملة بمدمس المتباينة 22 في الأطباق 6 سم في كثافة 5 × 10 6 خلايا كل صحن.
  2. في اليوم التالي، الطرد المركزي بتعليق البكتيريا المغلفة في 15,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
  3. إزالة المادة طافية وريسوسبيند في معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) بتركيز 10 × 10 6 زيمبابوي/مل.
    4. إزالة المتوسطة من بمدمس
  4. لتصيب الضامة في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 10، وإضافة 5 مل تعليق البكتيريا المغلفة أعدت. يمكن تقييم موي الأمثل لكل نوع من الخلايا أو التجريبية والغرض من فاجوسوميس معزولة.
  5. إينكوباتي على RT لمدة 10 دقائق لمزامنة البلعمه.
  6. إينكوباتي في 37 درجة مئوية في 5% CO 2 حاضنة لمدة 30 دقيقة الشروع في البلعمه. أنواع خلايا أخرى قد تتطلب أوقات الاحتضان مختلفة لضمان استيعاب البكتيريا.
  7. إزالة المتوسطة المحتوية على البكتيريا من الصحون وتغسل الخلايا مع ربمي ثلاث مرات لإزالة البكتيريا غير مستوعبة.
  8. وأخيراً إضافة 10 مل ربمي الذي يحتوي على 10% FBS ومع الجنتامايسين 50 ميكروغرام/مل لقتل أي بكتيريا غير فاجوسيتيزيد-
  9. احتضان بمدمس المصابة في 37 درجة مئوية مع 5% CO 2 حتى نقطة الوقت المطلوب. يجب أن تحدد نقطة الوقت المطلوب تجريبيا وفقا للبكتيريا ونوع الخلية المستخدمة والغرض من التحليل. لدراسة الأحداث الانصهار يبلوع-دخلول المبكر في س. بمدمس تيفيموريوم المصابة، ينصح حضانة و 30 دقيقة. لتحليل أحداث لاحقة، يمكن استخراج فاجوسوميس بعد ح 2 أو 4 ح للحضانة. حضانة طويلة من الضامة مع س. نتائج تيفيموريوم بعد 24 ساعة في وفاة الضامة. تمديد العدوى داخل الخلايا قبل استخراج يبلوع ربما يؤدي إلى تدهور الجزيئات البيوتين. ومع ذلك، أن نحن لم يلاحظ فقدان البيوتين على البكتيريا المغلفة حتى حاء 24

4. عزل من س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس

  1. إعداد حجم يبلوع المطلوب عزلة المخزن المؤقت (50 ملم أنابيب، pH.7، 50 مم مجكل 2، 5 ملم عطا) بإضافة ديثيوثريتول (DTT) بتركيز نهائي من 1 مم، ب سيتوتشالاسين إلى نهائي تركيز مثبطات ميكرومتر، ومبطلات والفوسفاتيز 10 حسبما أوصت به الشركة المصنعة.
    ملاحظة: DTT وب سيتوتشالاسين يجب إضافة إلى عزل يبلوع المخزن المؤقت باستخدام دائماً فورا من قبل. يعطل ب سيتوتشالاسين سيتوسكيليتون، تيسير تمزق غشاء الخلية.
  2. وفي الوقت المطلوب أشر، وإزالة المتوسطة من الخلايا المصابة ويغسل مع PBS العقيمة استعد الرايت
  3. 750 إضافة ميليلتر من فاجوسومالمخزن المؤقت بكل طبق ه العزلة واحتضان 20 دقيقة على الجليد. عند استخدام أرقام الخلية مختلفة، ينبغي تعديل حجم المخزن المؤقت لعزله بالتناسب.
  4. إضافة 250 ميليلتر يبلوع عزلة المخزن المؤقت ب (الأنابيب 50 مم، pH.7، 50 مم مجكل 2، 5 ملم اجتا، 220 مم المانيتول والسكروز 68 ملم). روك اللوحة ضمان وصول المخزن المؤقت إلى السطح الكامل للطبق. عند استخدام أرقام الخلية مختلفة، ينبغي تعديل حجم المخزن المؤقت للعزلة ب تناسبياً.
  5. إزالة الخلايا من الطبق بلطف إلغاء استخدام شرطي مطاط وتحويلها إلى أنبوب مبردة مسبقاً 1.5 مل.
  6. يمر بتعليق خلية إبرة ز 26 استخدام المحاقن 1 مل على الأقل 15 مرة (تطلع واحد بالإضافة إلى طرد واحدة من التهم تعليق خلية كمرة واحدة). وهذا يكفي لإطلاق سراح سيتوسوليك محتوى بمدمس. عدد يمر عبر الإبرة يجب أن يكون الأمثل لكل نوع من أنواع الخلايا.
    7. وضع تعليق خلية على الرف المغناطيسية
  7. والانتظار مدة 5 دقائق. جسيمات تعلق على المغناطيس هي فاجوسوميس التي تتضمن المغلفة-س. تيفيموريوم. التعليق يحتوي على بقية المكونات الخلوية.
  8. نقل التعليق في أنبوب 1.5 مل وصفت " سيتوسول "-
  9. إزالة الأنبوب مع فاجوسوميس المعزولة من الرف المغناطيسية وريسوسبيند لهم في 1 مل PBS العقيمة.
  10. وضع تعليق يبلوع على الرف المغناطيسية، والانتظار لمدة 5 دقائق، وإزالة برنامج تلفزيوني-
  11. كرر الخطوات 4.9 و 4.10 لغسل معزولة س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس-
  12. وأخيراً إزالة برنامج تلفزيوني وريسوسبيند فاجوسوميس في المخزن المؤقت المطلوب؛ فعلى سبيل المثال، في مخزن فحص (RIPA) راديويمونوبريسيبيتيشن لتحليل البروتين. يتم الحصول على ما يقرب من 50-200 ميكروغرام من البروتين كل عينة عقب هذا البروتوكول، تبعاً لكمية الخلايا الأولية ووزارة الداخلية من العدوى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

العزلة التي تحتوي على البكتيريا فاجوسوميس بهذا البروتوكول يتطلب بيوتينيليشن البكتيريا كخطوة أولى. ولذلك قمنا بتقييم فعالية س. بيوتينيليشن تيفيموريوم بالتحليل المجهري [كنفوكل] للمصابين بيوتينيلاتيد بمدمس متشيري-S. تيفيموريوم المسمى مع Cy5-ستريبتافيدي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

أسلوب جديد لعزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس بطلاء البكتيريا مع البيوتين ومترافق streptavidin المغناطيسي الخرز ويرد هنا. بعد تعطل رقيقة من غشاء الخلية، فاجوسوميس المحتوية على البكتيريا ويمكن بسهولة استخراج استخدام رف مغناطيسي. نظهر أن وسم البكتيريا يحافظ على قدرة مسببات ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

البحوث في مختبر لروبنسون هي مدعومة بتمويل من "كولونيا التميز الكتلة" على "استجابات الإجهاد الخلوية" في "الأمراض أجينجاسوسياتيد"، جامعة كولونيا، ألمانيا (سكاد؛ تمولها DFG ضمن "مبادرة الامتياز" للحكومة الاتحادية الألمانية و الدولة الحكومات) والمنح المقدمة من دويتشه الأوقيانوغرافية (SFB 670) وثروة كولون ومؤسسة ماريا Pesch من جامعة كولونيا، ألمانيا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
EZ-Link NHS BiotinThermo Fisher Scientific20217
FluidMag StreptavidinChemicell4205
PIPESCarl Roth9156.2
MgCl2Carl RothA537.4
EGTACarl Roth3054.3
SucroseCarl Roth4621.1
MannitolCarl Roth4175.1
DTTSigma43816
Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific1861280
Cytochalasin BSigmaC6762
DYNAL or DynaMag MagnetThermo Fisher Scientific12321D
SmartSpec 3000 SpectrophotometerBio-Rad170-2501
Bacterial loop (10µl)Sarstedt86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures
RPMIBiochromFG1415
PBSBiochromL1825
Cy5-streptavidinInvitrogenSA1011
anti-beta-actin antibodySanta Cruz Biotechnologysc-47778
anti-mCherry antibodyThermo Fisher ScientificPA5-34974
anti-Rab5 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-46692
anti-Rab7 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-10764
anti-v-ATPase (V0) antibodySanta Cruz Biotechnologysc-28801
anti-v-ATPase (V1) antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20943
anti-cathepsin D antibodySanta Cruz Biotechnologysc-6486
anti-Tomm20 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-17764
anti-calnexin antibodySanta Cruz Biotechnologysc-46669
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20357

References

  1. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
  2. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
  3. Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758(2008).
  4. Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
  5. Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
  6. Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
  7. Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
  8. Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
  9. Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
  10. Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
  11. Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
  12. Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
  13. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
  14. Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
  15. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  16. Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
  17. Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
  18. Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
  19. Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
  20. Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
  21. Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
  22. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  23. Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
  24. Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
  25. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
  26. Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
  27. Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
  28. Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved