JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذا البروتوكول مقايسة غزو عمودي مقلوب التي يمكن أن تستخدم لقياس قدرات الهجرة وغزو الخلايا في أجواء ثلاثية الأبعاد مع الحفاظ على المكروية الخلية. هذا التحليل مناسبة لخلايا نادرة و/أو الحساسة.

Abstract

على الرغم من أن قد وضعت فحوصات غزو 3D، يظل التحدي هو دراسة الخلايا دون التأثير على سلامة المكروية بهم. فحوصات 3D التقليدية مثل قاعة Boyden تتطلب أن الخلايا المشردين من موقع الثقافة الأصلية ونقلها إلى بيئة جديدة. هذا تعطيل العمليات الخلوية التي متأصلة المكروية، بل أنه كثيرا ما يؤدي إلى فقدان الخلايا. هذه المشاكل تنطوي على تحديات خاصة عند التعامل مع الخلايا التي أما نادرة، أو حساسة للغاية لتلك المكروية. هنا، نحن تصف وضع مقايسة 3D غزو أن يتجنب كل الشواغل. في هذا الفحص، يتم مطلي الخلايا داخل صغيرة جيدا ووضعت مصفوفة إدارة المحتوى في المؤسسة التي تحتوي على تشيمواتراكتانت من فوق الخلايا. هذا يتطلب لا خلية التشرد، ويسمح للخلايا بغزو صعودا في المصفوفة. في هذا التحليل، يمكن تقييم غزو الخلية، فضلا عن مورفولوجيا الخلايا داخل جل الكولاجين. يمكننا استخدام هذا الفحص، تميز الغازية قدرة خلايا نادرة وحساسة؛ الخلايا المختلطة الناتجة عن اندماج بين خلايا سرطان الثدي MCF7 والوسيطة/multipotent الخلايا الجذعية/ستروما (MSCs).

Introduction

خلية حركية عملية إنمائية والفسيولوجية طبيعية من الخلايا. ومع ذلك، تغييرات في النمط وقدرة الخلايا على الهجرة وغزو ترتبط بالحالات المرضية بما في ذلك أمراض التهابات وسرطان خبيث1،،من23. ورم خبيث هو يمكن القول أن الجانب الأكثر غير مفهومة في السرطان. السرطاني، خلايا السرطان يجب أن تتحلل المصفوفة الخلوية إضافية (ECM)، تغزو الأنسجة المحلية وإينترافاساتي. مرة واحدة في الدورة الدموية، والخلايا السرطانية سيتم نشر إلى الموقع البعيد واكسترافاساتي وتشكل الأورام الثانوية. ولذلك، القدرة الخلايا تتحلل إدارة المحتوى في المؤسسة، لترحيل، وغزو مرتبط بامكاناتهم المنتشر. وضعت نهوج مختلفة لتحليل وقياس قدرات الهجرة وغزو الخلايا. وتشمل النهج الأكثر استخداماً الجرح الشفاء المقايسة والوقت الفاصل بين الفحص المجهري والمقايسة الدائرة Boyden. الجرح الشفاء المقايسة4 ووقت مرور الفحص المجهري هي فحوصات بسيطة ومريحة التي سوف تعطي فكرة أولية عن الهجرة الخلية. ومع ذلك، وكلاهما فحوصات 2D لا تعكس البيئة ثلاثية الأبعاد التي توجد فيها الخلايا في الجسم الحي. وقد أظهرت الدراسات أن الخلايا تستجيب بشكل مختلف لبيئة ثلاثية الأبعاد بالمقارنة مع واحد 2D5،6. وعلاوة على ذلك، يصعب فحوصات شفاء الجرح إلى إنتاج وأن تسفر عن نتائج كمية7،،من89. والرزن خلية منطقة الاستبعاد، وتعديل 3D للجرح شفاء المقايسة، تحليل ذات صلة أكثر فسيولوجيا لكن أنها ليست مناسبة للخلايا منخفض في عدد مثل الخلايا المختلطة الناتجة عن خلية الانصهار الأحداث10،11 .

فحص الدائرة Boyden هو فحص ثلاثي الأبعاد الذي يوفر ميكرونفيرونمينتس ذات الصلة للدراسات الخلوية. ومع ذلك، فإنه يتطلب الخلايا المراد إزالتها من على المكروية الأصلي وأن تودع في مجلس الشيوخ نظام مقايسة Boyden لترحيل وغزو نازلا نحو المتوسطة المحتوية على تشيمواتراكتانت. هذا النهج ثلاثي الأبعاد غير المناسبة في تحليل القدرة على الهجرة وغزو الخلايا الضعيفة المكروية و/أو محدودة في عدد10،،من1112. اتباع نهج جديدة لتحليل الهجرة الخلية وغزو هو مقايسة13دائرة التدرج موائع جزيئية. على الرغم من مناسبة وموثوق بها في دراسات الهجرة والغزو، هذا التحليل هو أكثر تكلفة ويمكن أن تكون صعبة من الناحية الفنية لمختبر نموذجي. يصف لنا هنا مقايسة بسيطة غزو عمودي مقلوب هو متوافق مع العديد من أنواع الخلايا بما فيها الخلايا الحساسة لما المكروية و/أو المقيدة في عدد. وكان هذا التحليل مقتبس من البروتوكول المقترح من هوبر وآخرون 14-في هذا التحليل، تبقى الخلايا في بهم المكروية الأصلي وهجرتها ويرصد الغزو كما أنها تتحرك صعودا في جل الكولاجين التي تحتوي على تشيمواتراكتانت11. هذا التحليل استنساخه وقد الأمثل والتحقق من صحتها في الطبق الثقافة 35 ملم. فإنه يمكن تكييفه لظروف المقايسة مختلفة بما في ذلك الثقافة خلية مختلفة الأحجام، ومصفوفات مختلفة أو قوة الالتصاق، وتشيمواتراكتانتس المختلفة. يمكن هذا التحليل بمثابة منصة في المختبر للفحص الأولى في عملية اكتشاف المخدرات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: يتم وصف هذا البروتوكول في مكاردلي et al. 11-وضع جدول زمني ويرد في الشكل 1.

1-إعداد لوحة الثقافة

  1. أغسل الطبق الثقافة 35 ملم التي تحتوي على 10 ملم زجاج السفلي جيدا مع 1 مل حامض الهيدروكلوريك 1 م (HCl) لمدة 15 دقيقة لخفض hydrophobicity من الزجاج-الأسفل.
  2. أغسل لوحة الثقافة مرتين مع 1 مل من المحلول الملحي العازلة الفوسفات (PBS) للتخلص من جميع HCl.
  3. أغسل لوحة الثقافة مرتين مع 1 مل إيثانول 70%.
  4. شطف لوحة الثقافة مع 1 مل مستنبت الخلية المحددة (هنا، استخدام α-الفنزويلية وتستكمل مع الحرارة 10% إبطال FBS والأحماض الأمينية غير الأساسية 1%).
    ملاحظة: يمكن تخزين لوحة الثقافة المعالجة التي تحتوي على المتوسط الثقافة في الحاضنة2 CO مع مرطب عند 37 درجة مئوية حتى اليوم التالي.
  5. تنمو الخلايا (MSCs و MCF-7 ثقافة المشاركة) في أسفل الزجاج المعالجة جيدا للطبق الثقافة 35 ملم إلى 100% كونفلوينسي. شارك الثقافة 35,000 MSC الخلايا و 000 75 خلايا MCF7 ح 24.

2-إعداد جل الكولاجين

  1. تخزين نصائح ميكروبيبيتي تستخدم بيبيتينج جل الكولاجين في الثلاجة لمنع البلمرة الكولاجين عند الاتصال.
    ملاحظة: وهذه هي الخطوة الأكثر أهمية.
  2. تحديد وحدة تخزين الكولاجين ذيل الجرذ الأول لاستخدامها استناداً إلى تركيز المخزون الكولاجين. إعداد 100 ميليلتر من جل الكولاجين لهذا التحليل.
    ملاحظة: تركيزات عالية من الكولاجين ذيل الجرذ أنا الأسهم يعمل بشكل أفضل. تحديد حجم 10 × المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو لاستخدامها لتمييع الكولاجين تبعاً لذلك.
  3. ضم على الجليد فأر الذيل الكولاجين أنا (3.8 ميكروغرام/مل الأسهم) والمتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو x 10 والمتوسطة الثقافة الخلية x 1 تستكمل مع 2% مصل بقرى الجنين و chemoattractant مناسبة لتركيز نهائي للكولاجين من 2.4 ملغ/مل.
  4. إضافة إلى الخليط 4.5% من حل بيكربونات الصوديوم لتحييد جل الكولاجين.
    ملاحظة: قد تختلف حجم الحل بيكربونات الصوديوم المضافة على درجة الحموضة الدقيق الكواشف الأخرى. فمن الأفضل لاختبار الخليط مع شرائح الأس الهيدروجيني ضمان حل محايدة، أو استخدام مؤشر الرقم الهيدروجيني في الأجلين المتوسط والثقافة.
  5. تكمن ميليلتر 80 من خليط الكولاجين فوق الخلايا داخل الزجاج-أسفل جيدا للطبق الثقافة.
  6. السماح الكولاجين هلام بلمرة لمدة 30 دقيقة في حاضنة2 CO مع مرطب عند 37 درجة مئوية.
  7. تغطي جل الكولاجين مع 2 مل من الخلية المتوسطة مع انخفاض مصل (2 في المائة)، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO مع مرطب 24 أو 48 أو 72 ح.
    تنبيه: اللوحة يجب أن تعالج الرعاية للحيلولة دون فصل من أسفل الزجاج جل الكولاجين.

3-مثال لإعداد الكولاجين هلام استخدام مخزون الكولاجين ذيل فأر من 3.8 ميكروغرام/mL

  1. على الجليد، والجمع بين ميليلتر 114.5 الكولاجين ذيل الفئران، 16.6 ميليلتر من 10 × دميم، وميليلتر 33.1 متوسطة الثقافة التي تحتوي على تشيمواتراكتانت.
  2. تحييد الخليط الكولاجين مع 14.0 ميليلتر من بيكربونات الصوديوم.
  3. ما زالت كما في الخطوة 2، 5.

4-التصوير من الخلايا

  1. قم بإزالة الوسائط بلطف من الطبق.
  2. بلطف شطف الجل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. إصلاح الخلايا مع 1 مل بارافورمالدهيد 4% لمدة 15 دقيقة.
  4. تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  5. وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على الحل DAPI (100 نانوغرام/مل) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. صورة الخلايا باستخدام مجهر [كنفوكل] في مواقع مختلفة، وأخذ 400 ميكرون z-رص الصور من كل موقع في 16 ميكرومتر الخطوات. وقد المجهر يستخدم قرص المسح الضوئي وحدة تمكن [كنفوكل] التصوير باستخدام الضوء الأبيض، ومصدر الإثارة القوس. استخدام عدسة X 20 المستخدمة مع الفتحة العددية من 0.75.
  7. إعادة تشكيل الصور.
    1. فتح الصور لجل معين (حوالي 25 الصور) وإنشاء رصة صورة عن طريق النقر فوق الصورة ← مكدسات ← الصور المكدس. تقابل الصورة الأولى إلى الجزء السفلي من الهلام (z = 0 ميكرومتر)، الصورة الثانية يناظر الخطوة الأولى في اتجاه z (z = 16 ميكرومتر)، تقابل الصورة الثالثة إلى الخطوة الثانية في اتجاه z (z = 32 ميكرون). تقييم كل نواة في كل عمق الصورة وتعيين العمق الذي كان النواة في أشد التركيز كعمق الغزو لأن خلية معينة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لقد استخدمنا طبق ثقافة 35 ملم مع زجاج السفلي والفئران الكولاجين ذيل الأول لتطوير وتحسين في المختبر غزو 3D الاعتداء البروتوكول. باستخدام هذا الفحص، واظهرنا ذلك الثدي الخلايا السرطانية MCF7 ولجنة السلامة البحرية يمكن أن تغزو الخلايا في جل الكولاجين إلى متوسط مسافة من 0.04 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا، نحن تصف مقايسة غزو عمودي مقلوب بسيطة وملائمة لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا التي نادرة و/أو تعتمد على بهم المكروية. في هذه المقايسة غزو 3D، الخلايا تظل في بهم المكروية الأصلي ومشمولة جل الكولاجين التي تحتوي على تشيمواتراكتانت. الخلايا ثم ترحيل وغزو في الكولاجين. ف?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وقد أعلن الكتاب أنه لا يوجد أي المصالح المتنافسة.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" (نيمهد-G12MD007581) من خلال ركمي-المركز "الصحة البيئية" في جامعة ولاية جاكسون والإدارة الأمريكية للدفاع، فكرة جائزة 11-1-0205.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MatTek P35G-1.5-10CMatTek Corporation, Ashland, MAP35G-1.5-10-Cmattek glass bottom dishes
Rat tail collagen ICorning, Corning, NY, USA354236Collagen gel
Hydrochloric acidSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USAH1758HCl
Phosphate buffered salineThermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA10010023PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USAD242910X DMEM
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USAS5761NaHCO3
Confocal Fluorescent microscopeOlympus America, Center Valley, PA, USAOlympus IX81Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine SerumGE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USASH30070.03FBS
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscopePrarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA40x NA 0.8 objectiveMPLSM
Imaris softwareBitplane Inc. Zurich, CHImaris 7.5.2Imaris software
DAPISigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USAD9542DAPI
ParaformaldehydeThermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA50980487PFA
α-minimum essential mediumSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USAM0894
MDA-MB-231ATCC; Manassas, VA, USAHBT-22
MSCTrivedi and Hematti, 2007
20X lens UPLAPOOlympus America, Center Valley, PA, USA36-064Olympus UPLSAPO 20X Objective

References

  1. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  2. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  3. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
  4. Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21(2004).
  5. Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
  6. Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
  7. Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198(2008).
  8. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
  9. Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
  10. Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
  11. McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
  12. Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
  13. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
  14. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
  15. Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved