JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

دراسة ورم المكروية يمكن تحديد المؤشرات الحيوية تشخيصية أو التنبؤي للاستجابة السريرية للعلاج المناعي. قدم هنا، هو طريقة مبتكرة تستند إلى في الموقع الأسفار المتعددة الأطياف التصوير لتحليل وحساب تلقائياً مختلف الفئات السكانية الفرعية من CD8+ تي الخلايا. هذا الأسلوب استنساخه وموثوق به مناسبة لتحليلات فوج كبير.

Abstract

الخلايا المناعية هي مكونات هامة لورم المكروية والتأثير على نمو الورم وتطور في جميع مراحل التسرطن. جدير بالذكر أن الآن ثبت أن التغلغل محصنة في الأورام البشرية يمكن أن ترتبط بالتشخيص والاستجابة للعلاج. تحليل ارتشاح محصنة في ورم المكروية أصبح تحديا رئيسيا لتصنيف المرضى والاستجابة للعلاج.

التعبير المشترك عن المستقبلات المثبطة مثل برنامج موت الخلية البروتين 1 (PD1؛ ويعرف أيضا باسم CD279) والسامة للخلايا اللمفاويات T المرتبطة البروتين 4 (كتلاً-4)، تي خلية الغلوبولين المناعي والميوسين التي تحتوي على البروتين-3 (تيم-3؛ ويعرف أيضا باسم CD366) واللمفاويات تنشيط الجين 3 (تأخر-3؛ المعروف أيضا CD223)، سمة مميزة لاستنفاد الخلايا T. لقد طورنا الفلورة مولتيباراميتريك في الموقع تلطيخ لتحديد وقياس على المستوى الخلوي التعبير المشترك عن هذه المستقبلات المثبطة. في سلسلة أثر رجعي من الأنسجة المجمدة من سرطانات الخلايا الكلوية (مجلس قيادة الثورة)، استخدام تكنولوجيا تصوير المتعدد الأطياف fluorescence مقترنة ببرنامج تحليل صورة، وأنه تم العثور على هذا التعبير المشارك PD-1 و 3-تيم على الورم تسلل CD8+ تي الخلايا يرتبط بسوء تشخيص في مجلس قيادة الثورة. لدينا المعرفة، ويمثل هذا الدراسة الأولى مما يدل على أن هذه الآلية التكنولوجيا المتعددة في الموقع قد يكون لها بعض الأهمية السريرية.

Introduction

في السنوات القليلة الماضية، برز العلاج المناعي لعلاج العديد من أنواع السرطان، بما في ذلك مجلس قيادة الثورة واعدة جداً. خاصة، مثل العلاج المناعي استناداً إلى تثبيط نقاط التفتيش المثبطة PD-1 وتم الإبلاغ عن 4 كتلاً تكون فعالة سريرياً1،2،3،،من45، 6-الأجسام المضادة ضد كتلاً-4، PD-1، أو برنامج الموت [ليغند] 1 (PD-L1) التي أقرت بالفعل في العديد من أنواع السرطان وتؤدي إلى استجابات سريرية طويلة الأمد في أكثر من 20 في المائة من المرضى7. ومع ذلك، ليس جميع المرضى من المستجيبين وتكلفة العلاج مرتفعة، وهذه العلاجات مواد سامة، مما يؤدي إلى احتمال آثار جانبية خطيرة في المناعة الذاتية مثل. ذلك التحدي الحالي لتحديد علامات التنبؤية لهذه إيمونوثيرابيس الجديدة. أبلغ عن معدل الطفرات في الورم أو التعبير عن PD-L1 مستويات intratumoral CD8+ تسلل خلية T ترتبط باستجابة سريرية. ومع ذلك، هذه الرابطة لا تزال ضعيفة للغاية للتوصية باستخدام هذه المؤشرات الحيوية السريرية في الممارسة السريرية باستثناء اختبار رفيق PD-L1 قبل إدارة بيمبروليزوماب في الخلية غير الصغيرة الرئة مرضى السرطان (NSCLC)8 ،،من91011،12. وقد ثبت أن التعبير المشترك عن العديد من المستقبلات المثبطة مثل PD-1، تيم 3، 3 متخلفة، وكتلاً-4، الحث النمط الظاهري استنفاد الخلايا ومقاومة للعلاج13،،من1415. منذ الدم الطرفية لا يمثل ورم المكروية، أنها ذات الأهمية العالية لتحليل السمات المظهرية للخلايا في الموقع. خلايا تي المشترك أعرب PD-1 و 3-تيم معروفة لتكون خلايا البصر وظيفيا في عدة سياقات13،،من1617. في هذه الدراسة، وأثر تنبؤاتها للتعبير المشترك عن المستقبلات المثبطة اثنين PD-1 وتيم-3 في CD8+ تي تم تقييم الخلايا.

تم أداء أعلى حتى الآن دراسة التعبير المشترك عن عدة علامات على الورم التسلل إلى الخلايا الليمفاوية (تيلس) أساسا بتحليل التدفق الخلوي، مما يجعل من الضروري العمل على أورام جديدة وتحليل استعادي النافية لذلك. مع التقليدية في الموقع تلطيخ، يمكن أن يؤديها تلطيخ واحد فقط في كل مرة، وليس من الممكن وصف نوع الخلية التي شاركت تعرب العلامات. على سبيل المثال، أعرب PD-L1 بالعديد من أنواع الخلايا للأورام المكروية، مما يجعل من الصعب على تعريف بواسطة immunohistochemistry التقليدية تحليل الخلايا التي تعرب عن PD-L1 هي أكثر صلة بالدراسات الارتباطية. في هذا العمل، قمنا بتطوير أسلوب الفلورة مولتيباراميتريك مبتكرة في الموقع مع العد الكمبيوتر للربط بين التعبير المشارك PD-1 و 3-تيم بورم في التسلل إلى CD8+ خلايا تي مع النتائج السريرية في مجلس قيادة الثورة. هذا الأسلوب له العديد من المزايا، بما في ذلك إمكانية لتحليل على مستوى خلية واحدة وعلامات متعددة في نفس الوقت باستخدام كاميرا متعددة الأطياف التي يمكن القبض على فترات محدودة > 10 نانومتر من خلال الكريستال السائل مرشحات18. وعلاوة على ذلك، هذا الإجراء التلقائية التي تمكن إمكانية تكرار مشغل بين نتائج وتحليل مختصر مقارنة بالتقنيات اليدوية19. وأفادت عدة دراسات في مجال السرطان، مقنعة ستينينجس العديد من الجزيئات المناعية مثل PD-1 و PD-L1 و CD8 في سرطان خلايا ميركل، وسرطان الرئة والرأس والرقبة سرطان20،،من2122، 23-عدد الخلايا الآلي ممكن مع التدريب من جانب المستخدم (الخطوة phenotyping). ويقاس الأسفار في المقصورات خلية مختلفة (نويات والسيتوبلازم والغشاء).

هنا، مجموعات فرعية مختلفة من الورم--تسلل CD8+ تي الخلايا تعرب عن PD-1 و/أو أحصى تيم-3 في مجموعة كبيرة من مجلس قيادة الثورة والنتائج كان يرتبط بدرجات الخطورة السريرية والمعلمات البقاء على قيد الحياة. كما أنه من الممكن لتحليل الغشاء fluorescence كثافة في القرار الخلوية مع كثافة Fluorescence يعني (MFI) البيانات مثل في الخلوي. وبقدر ما نعلم، وهذا يمثل أول الإبلاغ تنبؤاتها نتائج الدراسة باستخدام هذه التقنية استناداً إلى عدد مرات التصوير المتعدد الأطياف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

هذه الدراسة قد أجريت وفقا "إعلان هلسنكي" وأقرته لجنة الأخلاقيات المحلية (حزب الشعب الكمبودي إيل دو فرانس nr. 2012-05-04). تم الحصول على الموافقة المستنيرة من المشاركين المدرجة في الأفواج.

1-المواد الأنسجة

  1. جمع عينات الأنسجة مجلس قيادة الثورة اليوم لعملية جراحية. التعامل مع العينة الجراحية في درجة حرارة الغرفة (قسم علم الأمراض).
  2. جمع عينة ورم من حوالي 0.5 سم × 0.5 سم × 0.5 سم الحجم في أنبوب جافة. الأداة الإضافية تجميد في النتروجين السائل وتخزينه في-80 درجة مئوية.
  3. معطف العينات في درجة حرارة القطع الأمثل مركب. قسم العينات مع كريوستات في-20 درجة مئوية إلى 4-6 ميكرون سميكة أقسام. واسمحوا عينات الهواء الجاف على الشرائح ح 12 وتخزينها مباشرة في-80 درجة مئوية لتجنب جفاف.
  4. التحقق من جودة العينة عن طريق عرض الهيماتوكسيلين وويوزين الملون المقطع.

2. في الموقع تلطيخ الفلورة من تيلس

  1. المبادئ التوجيهية الإجرائية
    1. تنفيذ كافة الخطوات التجريبية في درجة حرارة الغرفة.
    2. جميع الخطوات، إجراء تخفيف مع "المخزن المؤقت تريس المالحة" (TBS؛ انظر الجدول للمواد).
    3. أداء الغسيل في تبس لجميع الخطوات ما عدا بعد الاحتضان جسم الأولية. لهذا الأخير، استخدام المخزن المؤقت تريس Tween20 المالحة (تبسة، انظر الجدول للمواد). لتكوين المخزن المؤقت وإعادة تشكيل رؤية تكميلية الجدول 1.
    4. استخدام غرفة رطوبة لجسم إينكوبيشنز وَجْرَةَ المصبوغة للغسيل.
    5. لا تدع المقطع تجف أثناء الإجراء.
  2. المعالجة المسبقة
    1. ذوبان الجليد الشريحة التي تحتوي على عينات الأنسجة والجاف بعناية للشريحة حول العينة مع منشفة ورقية. جارك رد فعل المنطقة التي تحتوي على الأنسجة بقلم حاجز مسعور (انظر الجدول للمواد). جاف لمدة 2 دقيقة.
    2. إصلاح العينات في الأسيتون 100% لمدة 5 دقائق، الجافة لمدة 2 دقيقة، ويغسل مع TBS لمدة 10 دقائق.
  3. التشبع والحصار
    1. بريتريات الشرائح لمدة 10 دقائق مع 3 قطرات avidin 0.1%، وبرنامج المساعدة التقنية و/أو نقر الشريحة لتوزيعها أفيدين وإزالة فقاعات الهواء، وثم علاج لمدة 10 دقيقة مع 3 قطرات من البيوتين 0.01 ٪ (انظر الجدول للمواد)، انقر فوق، و/أو نفض الغبار. يغسل مع tbs.
    2. تنفيذ حصار مستقبلات Fc. 100 ميليلتر 5% حجم/حجم من المصل العادي المخفف في "استخدام tbs." المصل من نفس الأنواع المضيفة كجسم الثانوية أو التعليم العالي المسمى تطبيق (انظر الجدول للمواد)؛ وهنا استخدمت المصل حمار. احتضان لمدة 30 دقيقة.
    3. أثناء الاحتضان، تدور بإيجاز المضادة-CD8، PD-1، والأجسام المضادة تيم-3 (جدول المواد). إعداد مزيج الأجسام الأولية في تبس كما هو موضح في الجدول 2 تكميلية.
  4. المناعية تلطيخ ل CD8، PD-1، و 3 تيم
    1. إعداد الخليط جسم الأولية. الرجوع إلى الجدول للمواد و تكميلية الجدول 2 للأجسام المضادة المستخدمة (مكافحة CD8، PD-1، تيم--3، وهذه الأجسام المضادة الثانوية المقابلة) وتركزاتها.
    2. اضغط و/أو نفض الغبار المصل حمار المتبقية (إضافة في الخطوة 2.3.2). احتضان الشرائح مع 100 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية غير المسماة ح 1 في دائرة هوميديفيد.
    3. أثناء الحضانة، بإيجاز تدور أرنب المضادة 5 سينين، AF488-ضد-الماعز، وبيوتينيلاتيد الماوس المضادة الأجسام المضادة، وإعداد المزيج من الأجسام المضادة الثانوية كما هو موضح في الجدول 2 تكميلية.
    4. تغسل شرائح تبسة لأدنى 5 الجاف الشرائح.
    5. احتضان الشرائح مع 100 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة في دائرة هوميديفيد.
    6. إعداد خليط جسم التعليم العالي التي تحتوي على Cy3-ستريبتافيدين كما هو موضح في الجدول 2 تكميلية.
    7. تغسل شرائح تبس لأدنى 10 الجاف الشرائح.
    8. احتضان الشرائح مع 100 ميليلتر من خليط جسم التعليم العالي لمدة 30 دقيقة.
    9. تغسل شرائح تبس لأدنى 10 الجاف الشرائح.
  5. تركيب الخلية
    1. تحميل الشرائح في 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي، وتصاعد المتوسطة (1.5 ميكروغرام/مل DAPI) مع ساترة متوافقة للفحص المجهري fluorescence المحتوية على DAPI هيدروكلوريد (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: كعنصر تحكم سلبية لكل تجربة، استخدمت شريحة واحدة مع الأجسام المضادة ايستب المطابقة في تركيز نفسه كالأجسام المضادة المقابلة. لهذا التلوين، استخدمنا الماوس IgG1 وارنب مفتش ومفتش الماعز مراقبة سلبية أضداد (انظر الجدول للمواد). كعنصر إيجابي، استخدمنا لوزة هايبربلاسيك البشرية التي من المعروف أن تكون إيجابية لعلامات اختبار، لكل تجربة. ويرد تلطيخ نموذجية في النتائج (الشكل 1). مونو-تلطيخ CD8، PD-1، وتيم-3 ينبغي أن يقوم على حدة (تلطيخ واحد كل شريحة) مع نفس المعاملة السابقة ودون DAPI. وينبغي أيضا إجراء شريحة في نفس الظروف التجريبية دون أي جسم وإلا DAPI تصاعد المتوسطة. ينبغي تصويرها شريحة باستخدام نفس الشروط التجريبية دون أي جسم ودون DAPI.

3-الأسفار التحليل والآلي عدد خلايا

  1. الحصول على الصور بالمجهر الآلي
    1. إنشاء بروتوكول.
      1. قم بتشغيل برنامج المجهر الآلي وإضاءة الأسفار.
      2. في شريط القوائم، انقر فوق "ملف"، "إنشاء بروتوكول،" حدد "DAPI،" "فيتك"، و "تريتك."
      3. انقر فوق "التالي" "قسم الأنسجة،" وانقر فوق "التالي"، اسم "البروتوكول". اختر اسم، على سبيل المثال، "CD8-PD-1-تيم-3،" انقر فوق "التالي"، و "حفظ".
      4. يدوياً ضع شريحة على المسرح.
      5. في شريط القوائم، انقر فوق "إعداد"، "إعدادات." انقر فوق "تعيين Z الوطن" في نافذة جديدة.
      6. ضبط وقت التعرض مع عنصر تحكم إيجابية الشريحة أي CD8، PD-1 و 3-تيم الثلاثي الملطخة بعينه DAPI.
      7. في شريط التحكم انقر فوق "تعيين التعرض".
      8. ضبط وقت التعرض لكل مرشح حتى يتم الحصول على إشارة كافية ولكن لا تشبع.
      9. للصور أحادية اللون، نفذ ما يلي:
      10. حدد اقتناء وتحت 'اوتوفوكس' اختيار عامل تصفية DAPI.
      11. "مسح منطقة الحد الأقصى"، نقل العليا هدف إلى الركن الأيمن العلوي من الشريحة. انقر فوق "علامة". قم بنفس الزاوية اليمنى السفلي.
        ملاحظة: هذه الخطوة ديليميتاتيس مجال طاقة منخفضة التصوير (تصوير ليرة لبنانية) في 4 ×؛ كن على علم بوضع العلامة جيد جداً فيما يتعلق بتطويق جميع العينات من السلسلة.
      12. لطاقة عالية (HP) التصوير، نفذ ما يلي:
      13. ضمن 'ضبط تلقائي'، اختر "DAPI".
      14. ضمن الفرقة 'شراء'، اختر "DAPI"، "فيتك"، "Cy3"، و "Cy5". انقر فوق "موافق". على شريط القائمة انقر فوق "ملف"، "احفظ البروتوكول".
    2. مسح الشرائح.
      1. تحميل البروتوكول بواسطة النقر فوق "ملف"، "تحميل بروتوكول" من شريط القوائم. انقر فوق "ابدأ".
      2. أدخل 'معرف مختبر' (موقع مجلد لتخزين الصور). أدخل معرف الشريحة لتحديد الشريحة. انقر فوق "التالي".
      3. انقر فوق "الصور أحادية اللون" (لمسح الشريحة كلها تحت ضوء مشرق الميدان والحصول على صور متسلسلة باستخدام هدفا 4 x).
        ملاحظة: هذا يعطي نظرة رمادي للشريحة.
      4. انقر فوق "البحث عن العينة". حدد منطقة الأنسجة لفحصها بدقة منخفضة (4 x): اضغط على المفتاح 'Ctrl' وانقر فوق حقل باستخدام المؤشر لتحديد أو إلغاء تحديد الحقول (الشكل 2A).
      5. انقر فوق "ليرة لبنانية التصوير" (4 × تصوير) لاقتناء الصورة "أحمر أخضر أزرق" نيون لكل حقل.
      6. لتحديد حقل HP، اضغط باستمرار على المفتاح 'Ctrl' وانقر فوق حقل باستخدام المؤشر لتحديد أو إلغاء تحديد الحقول التي تتطابق مع المنطقة الأنسجة التي سيتم فحصها بدقة عالية (20 س). حدد حقول 5 (الشكل 2).
      7. انقر فوق "إتش بي التصوير" (20 × تصوير) لاقتناء صور المتعددة الأطياف كل حقل (الشكل 2).
      8. انقر فوق "تخزين البيانات" لتخزين الصور في المجلد الذي تم تحديده في البداية في لابيد.
        ملاحظة: العملية تلخيص وهو موضح في الشكل 2. لكل خطوة (الكشف عن الأنسجة، واختيار الحقل) يمكن زيادة خوارزمية وتدريبهم من قبل المستخدم لعملية مسح الآلي كلياً.
  2. تحليل الصور الفلورية والآلي خلية العد مع برمجيات التحليل إلى جانب
    1. بناء المكتبة الطيفية.
      1. فتح برنامج تحليل الصورة.
      2. في اللوحة اليمنى، قم بفتح "بناء المكتبات". تحت 'تحميل الصورة'، انقر فوق "استعراض" وحدد الملون مونو صورة واحدة (مثلاً، سينين CD8/5).
      3. حدد فلوروفوري، (مثلاً، 5 سينين). انقر فوق "استخراج". انقر فوق "حفظ" لتخزين في المكتبة. انقر فوق "حفظ".
      4. كرر نفس العملية للمشتريات-1، تيم--3، والشرائح الملون مونو DAPI بغية إدماج الطائفة من كل فلوروفوري من الفائدة.
        ملاحظة: بناء المكتبة الطيفية يتكامل الطيف لكل فلوروفوري التي تستخدم للأنسجة محددة (هنا، الكلي)، ولكن يمكن استخدام مكتبات "الاصطناعية" موجودة بالفعل. كما الطيف أوتوفلوريسسينسي بدقة بالنسبة للأنسجة، من المهم أن تؤدي إحدى السيارات-الأسفار ومكتبة الطيفية لكل مشروع.
    2. قم بإنشاء مشروع جديد.
      1. من شريط القوائم، انقر فوق "ملف"، "مشروع جديد". في علامة التبويب 'ميزة البحث'، حدد "تقسيم الخلايا". في علامة التبويب 'فينوتيبينج'، حدد "فينوتيبينج". انقر فوق "إنشاء".
      2. دمج الصور التمثيلية في المشروع.
        1. في علامة التبويب 'ملف'، انقر فوق "فتح الصورة". اختيار 10 إلى 30 الصور التمثيلية للسلسلة بأكملها. إضافة الشريحة غير ملون لإزالة أوتوفلوريسسينسي. في اللوحة اليسرى: المكتبة تحديد المصدر. حدد فلوروفوري واختر تلك المقابلة للمكتبة الطيفية بنيت سابقا.
      3. لإزالة الأنسجة أوتوفلوريسسينسي، انقر فوق الزر "AF" وثم حدد مجال أوتوفلوريسسينسي على الشريحة فارغة.
      4. معالجة الصور وتوليد الصورة المركبة.
        1. انقر فوق "إعداد جميع" لدمج مكتبة الأسفار والأطياف أوتوفلوريسسينسي لتوليد صورة مركبة (الشكل 3). انقر فوق الرمز 'العين' لفتح لوحة 'محرر طريقة العرض' وحدد البيانات المعروضة: حدد العلامات CD8، PD-1، تيم--3، و DAPI. قم بإزالة أوتوفلوريسسينسي. اتبع الخطوات التي قدمها البرنامج.
      5. تقسيم الخلايا.
        1. لتقسيم الخلايا، في 'حجرة'، حدد "نواة" و "غشاء". في علامة التبويب "نوى"، حددت DAPI كونتيرستاين النووية.
        2. في علامة التبويب 'الحد الأقصى والحد الأدنى للحجم (px)' إدخال "40" و "176" كحجم الحد الأدنى والحد الأقصى، على التوالي. بالنسبة لإشارة 'الحد الأدنى'، وتعيين "0.13". في علامة التبويب "انقسام"، تعيين "2.60". في علامة التبويب "نوى"، تعيين "0.81". حدد "استخدام الأغشية إشارة إلى المعونة تجزئة".
        3. انقر فوق "تقسيم الخلايا" في الجزء السفلي من الشاشة. التحقق من تجزئة النوى، وأغشية الخلايا وإعادة المحاولة مع معلمات مختلفة إذا كانت أنها لا تطابق الأسفار DAPI وغشاء الخلايا.
          ملاحظة: البرنامج تسلم الخلايا مع DAPI النووية تلطيخ واستنادا إلى حجم الخلية. ضبط معلمات الخلية (الحجم، سبليت، بكسل) وفقا للمشروع.
      6. النمط الظاهري الخلايا.
        1. في علامة التبويب 'النمط الظاهري', انقر فوق "إضافة". إنشاء خلية فئات النمط الظاهري: CD8 (النقطة الزرقاء)/CD8-PD-1 (نقطة حمراء)/CD8-PD-1-تيم-3 (النقطة الخضراء)/أخرى (نقطة سوداء) (الشكل 4).
        2. حدد أمثلة أكثر من 5 خلايا لكل فئة. انقر فوق "تدريب المصنف".
          ملاحظة: هذا يولد خوارزمية تصنيف الإحصائي بالبرنامج.
        3. انقر فوق "النمط الظاهري كافة" للحصول على النمط الظاهري لكل خلية.
          ملاحظة: البرنامج يعطي النمط الظاهري خلية واحدة مع فاصل الثقة (CI) من الدقة.
        4. تحسين الخوارزمية بالتدريب البرمجيات حتى يصبح الفرق بين العين والعد الآلي متطابقة (خطأ < 5%). اختر CI مقبول للخلايا للفائدة.
          ملاحظة: لقد اخترنا جعل التدريب على أساس 55% CI كمقبولة.
      7. حفظ الخوارزمية والمشروع.
      8. وفي إطار "ملف' حدد"المشروع". تسميته، ثم انقر فوق "حفظ".
    3. القيام بتحليل مجموعة من السلسلة.
      1. حدد "دفعة تحليل". حدد المشروع. إضافة الصور إلى تحليل. حدد مجلداً لتخزين البيانات. انقر فوق "تشغيل". التحقق من جودة الصورة المركبة. تحقق من فينوتيبينج لجميع الصور من السلسلة.
        ملاحظة: برنامج تحليل الصورة إلى جانب يدمج جميع الإشارات مقصورات (غشاء/السيتوبلازم/نوى) خلية. الخطوة فينوتيبينج أمر حاسم أن كان تدريب الخوارزمية يمكن أن تكون خطوة تستغرق وقتاً طويلاً. جميع البيانات الخاصة بكل صورة في ملف.txt. جميع البيانات لخلية واحدة (خاصة النمط الظاهري معين مع ما CI) في سطر واحد. لكل شريحة، والحصول على الصور وتهم لاحقة أجريت على حقول 5.
  3. تكامل البيانات الخام وتوليد عدد خلايا الآلي
    1. حساب البيانات ببرنامج الإحصائي.
      1. حساب كافة البيانات من الصور 5 المقابلة للحقول 5 تحليل للمريض 1. استخدام منصة إحصائية، ولها خبرة خبير إحصائي، وإدارة البيانات، أو عالم البيانات إجراء التحليل. إنشاء برنامج نصي تلقائياً حساب الخلايا اعتماداً على النمط الظاهري، تحديد CI > 55%.
      2. وضع كافة ملفات.txt سلسلة في نفس المجلد.
    2. استخراج البيانات.
      1. ضع جميع ملفات.txt في مجلد واحد. تشغيل البرنامج النصي التلقائي في خطوة 3.3.1 بني. افتح الملف.csv الإخراج إنشاؤها بواسطة البرنامج النصي R. حفظ كتنسيق.xl. الإخراج تجمع العدد الخلايا لكل النمط الظاهري (أي، CD8 وحدها، CD8-PD-1, CD8-PD-1-تيم-3) لكل مريض.
      2. حساب متوسط عدد من الخلايا لكل مريض في كل حقل: تقسيم عدد الخلايا في العدد من الحقول (أي5) تطبيع عدد الخلايا لكل مريض في كل حقل.
      3. حساب النسبة المئوية للخلايا PD-1+ من بين مجموع CD8+ تي الخلايا، والخلايا PD-1+ تيم-3+ من بين مجموع CD8+ تي الخلايا. انظر الشكل 5 لموجز لهذه الخطوة.
        ملاحظة: لغة R (أو غيرها من البرامج البرمجة الاختيار) المطلوبة إنشاء وتنفيذ الأوامر بشكل صحيح، وحتى خبرة المستخدم أو عالم خبير إحصائي والبيانات أمر أساسي. برنامج البحث والتطوير يمكن حساب البيانات الخاصة بالمريض نفسه، ولكن يجب أن يكون اسم ملفات.txt 5 مريض واحد بداية متطابقة، المقابلة لمعرف فريد مريض.
  4. التحليل الإحصائي
    1. استخدام البرمجيات الإحصائية للتحليل الإحصائي للنتائج.
    2. إجراء التحليلات الإحصائية المناسبة بالمساعدة من خبير إحصائي.
      1. استخدام الرتبي غير حدودي وقع اختبارات رتبة للمقارنة "مؤسسة مونتانيار" PD-1 بين اثنين تعمل الخلية (الشكل 6). ربط كل وخصائص النسيجي مع اختبار مربع كاي بيرسون.
      2. استخدام طريقة كابلان-ماير لتقدير التقدم مجاناً البقاء على قيد الحياة، ونماذج انحدار كوكس لتقدير آثار كل على النتائج المرة للحدث، مثل البقاء على قيد الحياة عموما والبقاء خالية من الأمراض.
      3. النظر فقيم أقل من 0.05 ككبير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

أننا باستخدام بروتوكول العامة المذكورة أعلاه، تهدف إلى قياس intratumoral CD8+ تي الخلايا المشترك معربا عن المستقبلات المثبطة PD-1 و 3-تيم في الأنسجة المجمدة من المرضى مع مجلس قيادة الثورة، وربط النتائج بالنتائج السريرية25.

ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:

نوعية الأنسجة معلمة هامة؛ أنه يمكن التحقق بسهولة من تلوين الهيماتوكسيلين وويوزين.

ميزة واحدة من هذه التقنية هو إمكانية ستينينجس متعدد، ولكن لتجنب امتداد فلوروفوري، يوصي باختيار الأطوال الموجية الانبعاثات مع د...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

جميع المؤلفين قد لا يوجد تضارب في إعلان.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل المنح المقدمة من du المعهد الوطني للسرطان (الإنكا) (ET)، الدوري الفرنسي le مكافحة السرطان (ET)، جامعة السوربون باريس Cité (ET)، الوكالة الوطنية للمعلومات (سيليكتيمونكو) (ET)، والأورام المناعية لابيكس (ET)، كاربيم SIRIC (الفريق الاستشاري، وآخرون). ومولت مجموعة المناقشة الإلكترونية على زمالة من "مؤسسة قوس". EV ومؤتمر نزع السلاح كانت تمولها زمالة أفب (البورصة بحوث). وتمول ChB زمالة من جامعة السوربون باريس Cité (contrat الدكتوراه). يشكر المؤلفون بريستول مايرز سكويب لتمويلها في هذا المشروع. يشكر المؤلفون قسم علم الأمراض في مستشفى الأوروبي جورج بومبيدو ونيكر (لورين كامبل وميشيل الودي وليجال جيزيل). يشكر المؤلفون في منهاج علم الأنسجة باركك، "مستشفى الأوروبي جورج بومبيدو" (شركة Lesaffre كورين).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging Perkin ElmerCLS142338
inForm cell analysis 2.1.Perkin ElmerCLS135781
R softwarehttps://www.r-project.org
Dakopen delimiting penDakoS2002
Tris Buffer Salin TBS TabletsTakara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7.6 100 tablets
Biotin blocking systemDakoX0590Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serumJackson Immunoresearch017-000-0015% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPISigma-aldrichF60571.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslipKnittel Gläser,10003924x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-VnovusNBP1-79055use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NATabcamab52587use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3R&DAF2365use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142Roche7309457001use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11Cell Signalling4528use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9R&DAF2045use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbitJackson Immunoresearch711-175-152use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgGJackson Immunoresearch715-066-150use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgGabcamab150133use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidinAmershamPA43001use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1DakoX0931use at 2 µg/mL
IgG from goat serumSigma-aldrichI5256use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serumSigma-aldrichI5006use at 4µg/mL

References

  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437(2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501(2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221(2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10(2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47(2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120(2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132 3 PD 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved