JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويتجلى الحقل منخفضة (النطاق L، 1.2 جيجاهرتز) الإلكترون الرنين باراماجنيتيك استخدام المسابير نيتروكسيل وتريتيل للذوبان لتقييم البارامترات فسيولوجيا هاما في ورم المكروية في نماذج الماوس لسرطان الثدي.

Abstract

هذا البروتوكول يوضح قدرة إلكترون منخفضة-حقل باراماجنيتيك الرنين (EPR)-على أساس تقنيات في تركيبة مع تحقيقات باراماجنيتيك الوظيفية لتوفير معلومات كمية عن المواد الكيميائية وورم المكروية (TME)، بما في ذلك ف O2، الرقم الهيدروجيني، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات غير العضوية المتداخلة (Pi)، وداخل الخلايا الجلوتاثيون (المدفع جريازيف). على وجه الخصوص، يقدم طلبا للتحقيق مؤخرا نمواً ترتيل متعدد الوظائف القابلة للذوبان فرصة غير مسبوقة في فيفو قياسات متزامنة من فحو فس2 ففي ه إكستراسيلولار الفضائية (تحقيق الأمل). قياسات المعلمات الثلاث باستخدام مجس واحد تسمح بتحليلاتها العلاقة مستقلة عن توزيع المسبار والوقت للقياسات.

Introduction

دور رئيسي ل TME في تطور السرطان والعلاج هو تقدير متزايد1. بين المعلمات الفسيولوجية الهامة من TME في الأورام الصلبة، نقص الأنسجة2، الحماض3،4، عالية مما يقلل قدرة5، وتركيزات مرتفعة من داخل الخلايا المدفع جريازيف6،7، ومن خلالي Pi8 موثقة توثيقاً جيدا. تقييمات موسع المجراة في فس2ودرجة الحموضة وبي، والمدفع جريازيف والأكسدة والاختزال تقديم رؤى فريدة من نوعها في العمليات البيولوجية في TME، وتساعد أدوات مسبقة لفحص ما قبل السريرية للأدوية المضادة للسرطان، واستهدفت TME الاستراتيجيات العلاجية. عمق اختراق معقولة الترددات الراديوية في الأنسجة بالتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) والتقنيات المستندة إلى الجيش الشعبي الثوري منخفضة-ميدان يجعلها أنسب النهج لتقييم موسع لهذه المعلمات TME. التصوير بالرنين المغناطيسي تعتمد إلى حد كبير على تصوير المياه البروتونات ويستخدم على نطاق واسع في ظروف سريرية لتوفير دقة التشريحية لكنه يفتقر إلى قرار الفنية. يحتمل أن تكون جذابة لتوصيف TME قياسات الرنين المغناطيسي النووي الفوسفور-31 (31فالرنين المغناطيسي النووي) تركيز Pi خارج الخلية، ودرجة الحموضة استناداً إلى إشارة من الفوسفات الذاتية، ولكن يتم حجب عادة قبل عدة مرات أعلى داخل الخلايا Pi تركيزات9،10. على النقيض من هذا، الجيش الشعبي الثوري القياسات تعتمد على التحليل الطيفي والتصوير خصيصا لتصميم المجسات باراماجنيتيك لتوفير دقة الوظيفية. علما بأن تحقيقات الجيش الشعبي الثوري خارجية تتمتع بميزة خارجية يسبر الرنين المغناطيسي النووي نظراً لحساسية الجوهرية أعلى كثيرا من المنتجين وغياب إشارات الجيش الشعبي الثوري الخلفية الذاتية. وضع مؤخرا وظيفة مزدوجة الرقم الهيدروجيني والأكسدة والاختزال نيتروكسيل التحقيق11 وترتيل متعدد الوظائف مسبار12 يوفر فرصاً غير مسبوقة في فيفو القياسات المتزامنة من عدة TME المعلمات وبهم علاقة تحليلات مستقلة في توزيع المسبار والوقت لقياس. على حد علمنا، هناك لا أساليب أخرى متاحة لتقييم في فيفو الناحية الفسيولوجية الكيميائية TME المعالم الهامة في المواضيع المعيشية، مثل فس2، الرقم الهيدروجينيهوبي، والأكسدة والاختزال والمدفع جريازيف في نفس الوقت.

تحقيقات عن في فيفو القياسات الوظيفية:

ويبين الشكل 1 التركيبات الكيميائية لتحقيقات باراماجنيتيك المستخدمة للوصول المعلمات TME، التي تشمل تحقيقات الجسيمات وقابل للذوبان. حساسية فنية عالية، والاستقرار في الأنسجة الحية، والحد الأدنى من السمية هي بعض الفوائد التي تجعل الجسيمات المسابير المفضل عبر المسابير القابلة للذوبان في فيفو oximetry الجيش الشعبي الثوري. على سبيل المثال، زادت المسابير الجسيمات مرات الاحتفاظ في موقع زرع الأنسجة القابلة للذوبان المسابير السماح للقياس الطولي للنسيج فس2 على مدى عدة أسابيع بالمقارنة. من ناحية أخرى، يتفوق المسابير القابلة للذوبان المسابير الجسيمات بتوفير القياسات المكانية حلها باستخدام الجيش الشعبي الثوري على أساس تقنيات التصوير فضلا عن السماح بتحليل ما يصاحب ذلك من وظائف متعددة (فس2، ودرجة الحموضة، Pi، الأكسدة والاختزال، و المدفع جريازيف).

figure-introduction-3331
الشكل 1. التركيبات الكيميائية لتحقيقات باراماجنيتيك أن تجميع TME تقييم مقايسة. وهذا يشمل الجسيمات فس2 التحقيق اللغوي-المعلومات (R =-O (الفصل2)3CH3)، والمسابير القابلة للذوبان: وظيفة مزدوجة الرقم الهيدروجيني والأكسدة المسبار، المجلة؛ مسبار المراعية للمدفع جريازيف، رسر؛ ومتعددة الوظائف فس2ودرجة الحموضة والتحقيق Pi المكروية خارج الخلية، المسبار الأمل. قد وصفت توليف هذه المسابر في المراجع المتوفرة 11،12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Protocol

جميع الأعمال الحيوانية قد أنجزت وفقا لبروتوكول IACUC WVU المعتمدة.

1-التحقيق في التوليف والمعايرة

  1. جسيمات فس2-التحقيق اللغوي--المعلومات الحساسة
    ملاحظة: توليف ميكروكريستالس اللغوي-المعلومات وإعداد كما هو موضح في مرجع13. فهي مستقرة جداً ويمكن أن تحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة سنوات. لينيويدث الجيش الشعبي الثوري المسبار الجسيمات المعلومات اللغوي هو فس2-المعلمة حساسة. ميكروكريستالس اللغوي-المعلومات تثبت الاعتماد الخطي المثالي من لينيويدث على تركيز الأكسجين في النطاق من ظروف وصول ما يصل إلى 760 مم زئبق فس2 الضغط الجزئي13، مع قيم لينيويدث الذاتية في غياب الأكسجين والمنحدر من الاعتماد الأوكسجين (مقيسا بملغ/مم زئبق) قليلاً مختلفة لمجموعات مختلفة من إعداد ميكروكريستال. ولذلك، مطلوب المعايرة لكل دفعة معينة.
    1. تزن 60 ملغ ميكروكريستالس المعلومات اللغوي.
    2. لمعايرة حساسية الأكسجين، تعليق ميكروكريستالس في 3 مل من وسائل الإعلام النسر تعديل (دميم) المتوسطة دولبيكو (بتركيز 20 ملغ/مل) و sonicate لمدة 5 دقائق على الجليد مع سونيكاتور تحقيق في 20 كيلوهرتز استخدام 7 ث السلطة في أنبوب جولة-أسفل زجاج 5 مل.
    3. مكان 1 مل من ميكروكريستالس سونيكاتيد في زجاج الأنبوبة في جهاز رنان لفائف السطحية من مطياف النطاق L (1.2 جيجاهرتز) الجيش الشعبي الثوري والحصول على موجات مستمرة (CW) الجيش الشعبي الثوري الأطياف عند درجة حرارة 37 درجة مئوية والأكسجين تركيزات 0، 1، 2، 4، 8 الفسيولوجية ، و 20.9 في المائة. الحفاظ على تركيز الأكسجين بالسطح الحل مع الغاز خليط من وحدة تحكم غاز والحفاظ على درجة الحرارة باستخدام حمام مائي يعلق على الحرارة. استخدم الجيش الشعبي الثوري مطياف اكتساب المعلمات التالية: السعة التحوير، 100 ملغ؛ التردد التحوير، 100 كيلوهرتز؛ عرض الاجتياح، 5 ز؛ اكتساح الوقت، 60 ثانية.
    4. لتحقيق أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء (دائرة الاستخبارات الوطنية)، استخدم قيمة سعة تحوير من 60% لينيويدث (مثلاً، استخدام سعة تحوير غ 0.6 لينيويدث ز 1).
    5. البديل تبسيط إجراء المعايرة: تسجيل الأطياف الجيش الشعبي الثوري في حلول bubbled الهواء ووصول14. وفي الحالة الأخيرة، الحفاظ على أكسجين في العينات بإضافة الجلوكوز 10 ملم واوكسيديز الجلوكوز يو/مليلتر 100 إلى 1 مل مسبار الحلول وفقا لمرجعية14.
    6. تناسب الأطياف الجيش الشعبي الثوري مع الدالة لورينتزيان للعثور على عرض الخط، بوزن المادة الدهنية. تقييم حساسية ميكروكريستالس إلى فس2 كمنحدر من اعتماد بوزن المادة الدهنية على فس2، أي كقيمة (بوزن المادة الدهنيةالهواء−LWأكسجين)/فس2air، حيث بوزن المادة الدهنيةالهواء بوزن المادة الدهنيةأكسجين لينيويدث الأطياف في الأحوال الجوية واكسجين، على التوالي؛ ف O2air = 152 ملم زئبق.
  2. وظيفة مزدوجة الرقم الهيدروجيني والأكسدة المسبار، NR
    ملاحظة: يتم تصنيعه المسبار رقم كما هو موضح في مرجع11. أنها مستقرة في درجة حرارة الغرفة صلبة وفي المحاليل. يتم الاحتفاظ بالمسبار رقم التوليفية في 4 درجات مئوية. تقسيم هايبرفيني النيتروجين،ن، ومعدل تسوس مطال إشارة هي معلمات الطيفية المسبار NR حساسة لدرجة الحموضة (التحقيق pK = 6.6 في 37 درجة مئوية، مجموعة من حساسية درجة الحموضة من 5.6 إلى 7.6) وإلى تخفيض قدرة التحقيق المكروية، على التوالي.
    1. إزالة NR من الثلاجة وتسمح للحاوية الحارة إلى درجة حرارة الغرفة (10-15 دقيقة). تزن بملغ 6.34 من NR، حله في 1 مل المحلول الملحي، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع مختبرين الصغيرة من HCl أو هيدروكسيد الصوديوم باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. استخدام الحل NR استعداد (10 ملم) كحل أسهم.
    2. إجراء المعايرة pH المسبار NR كما يلي (انظر المرجع11). أولاً، إضافة 0.1 مل الحل NR الأسهم إلى 0.9 مل مم 2 غ-الفوسفات المخزن المؤقت، 150 مم كلوريد الصوديوم. تيتراتي الحل NR حصل على 1 مم مع مختبرين HCl أو هيدروكسيد الصوديوم إلى درجة الحموضة المطلوبة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. التحكم درجة الحرارة باستخدام حمام مائي يعلق على الحرارة.
    3. تسجيل الأطياف الجيش الشعبي الثوري من العينات في أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل استخدام مطياف النطاق L الجيش الشعبي الثوري. استخدم الجيش الشعبي الثوري مطياف اكتساب المعلمات التالية: السعة التحوير، 2.5 G؛ التردد التحوير، 100 كيلوهرتز؛ عرض الاجتياح، ز 60؛ اكتساح الوقت، 20 ثانية.
    4. قياس هايبرفيني تقسيم ثابت (ن) كنصف المسافة بين مكونات الحقل المنخفضة والعالية من أطياف الجيش الشعبي الثوري والأرض أنه مقابل الرقم الهيدروجيني، تقديم منحنى المعايرة لقياس الرقم الهيدروجيني النطاق L الجيش الشعبي الثوري.
  3. مسبار رسر المراعية للمدفع جريازيف
    ملاحظة: يتم تصنيعه المسبار رسر كما هو موضح في مرجع15. تخزين رقم التوليفية التحقيق في 4 درجات مئوية. مركب بيراديكال ثنائي كبريتيد رسر محبتين ينشر بسهولة عبر غشاء الخلية تتفاعل مع المدفع جريازيف داخل الخلايا، وتوفير نهج موثوق بها لتحديد المدفع جريازيف في فيفو استخدام الجيش الشعبي الثوري16،17. يستند هذا الأسلوب على معدلات عالية من رد فعل تجمع داخل الخلايا الغالبة للمدفع جريازيف ثيولس مع المسبار رسر. رد فعل بيراديكال رسر مع تقسيمات المدفع جريازيف ثنائي كبريتيد السندات (انظر المخطط 1) أسفر عن إلغاء التبادل تدور بين اثنين من شظايا الراديكالية ويظهر في انخفاض المكونات الطيفية بيراديكال والمقابلة زيادة مكونات مونوراديكال. للمسبار رسر بيراديكال، بمعدل زيادة السعة للمكون مونوراديكال يتناسب مع تركيز المدفع جريازيف ومعلمة طيفية حساسة للمدفع جريازيف الجيش الشعبي الثوري مريحة. لتقييم تركيز المدفع جريازيف من القياسات الجيش الشعبي الثوري في فيفو ، قد المعايرة السابقة المعدل لرد فعل رسر مع المدفع جريازيف في درجة الحرارة ودرجة الحموضة المقابلة النحو التالي.
    1. إزالة رسر من الثلاجة وتسمح للحاوية الحارة إلى درجة حرارة الغرفة (10-15 دقيقة). تزن بملغ 4.05 من NR وتذوب في 1 مل من محلول [دمس]. استخدم الحل رسر استعداد (10 ملم) كحل أسهم.
    2. تحديد قيمة معدل ثابت، كobs، من رد فعل رسر مع المدفع جريازيف المرغوب فيه درجة الحرارة ودرجة الحموضة كما يلي.
    3. أولاً، إضافة 20 ميليلتر من الحل رسر الأسهم (10 مم) إلى 0.98 مل من المخزن المؤقت 1 مم نا-الفوسفات، الرقم الهيدروجيني 7.2، 150 مم كلوريد الصوديوم، للحصول على 0.2 مم رسر التحقيق الحل.
    4. إعداد حلول لتركيزات المدفع جريازيف 1 و 2 و 5 مم في المخزن المؤقت للفوسفات نا م 0.1 في الرقم الهيدروجيني 7.2. وقد المعايرة في المختبر لتقييم دقة تركيز المدفع جريازيف في الخلايا الجهاز المستهدف من القياسات في فيفو ، يجب القيام بها في الرقم الهيدروجيني القريبة من قيمة pH داخل الخلايا.
    5. مزيج من كميات متساوية من 0.2 مم رسر الحل وواحد من الحلول المدفع جريازيف إعدادها في الخطوة 1.3.4. لنهائي تركيز التحقيق على 0.1 ملم والمدفع جريازيف في 0.5 أو 1 أو 2.5 ملم.
    6. فور حل رسر والمدفع جريازيف خلط، وضع العينة في جهاز رنان الجيش الشعبي الثوري وتسجيل الأطياف الجيش الشعبي الثوري كل 12 ثانية لمدة 10 دقائق. ثم حساب الحركية لزيادة السعة الطيفية مونوراديكال. استخدم الجيش الشعبي الثوري مطياف اكتساب المعلمات التالية: السعة التحوير، ز 1؛ التردد التحوير، 100 كيلوهرتز؛ عرض الاجتياح، ز 60؛ وقت الاجتياح، 10-60 ثانية.
    7. وتناسب حركية الجيش الشعبي الثوري المقاسة إلى مونوكسبونينتس حساب وقت ثابت لحركية الأسى، τ. الانحدار الخطي (1/τ = ك ×obs [المدفع جريازيف]) يوفر قيمة ثابتة لوحظ معدل رد الفعل بين المدفع جريازيف ورسر (مثلاً، في 34 درجة مئوية ودرجة الحموضة 7-2، كobs = 2.8 ± 0.2 M-1ق-1)11.
  4. متعدد الوظائف مسبار الأمل فس2ودرجة الحموضة، وتقييم Pi
    ملاحظة: ترتيل مونوفوسفوناتيد يتم تصنيعه مسبار الأمل كما هو موضح في مراجع12 ، ويحتفظ بها في 4 درجات مئوية. وتمثل دوبليتس بسبب هايبرفيني الفوسفور تقسيم،فالأطياف الجيش الشعبي الثوري CW من الأمل في الأس الهيدروجيني << pK (-شكل حمض) ودرجة الحموضة >> pK (ب-النموذج الأساسي). إعدادات أداة نموذجية كما يلي: السعة التحوير، 37.5 ملغ؛ التردد التحوير، 100 كيلوهرتز؛ عرض الاجتياح، 0.9 ز؛ وقت الاجتياح، 20-60 ثانية. في متوسط درجة الحموضة (5 < الأس الهيدروجيني < 8) تتميز الطيف الجيش الشعبي الثوري لتحقيق الأمل باللجنة الرباعية عند كلا A وب الدول موجودة. لينيويدث الجيش الشعبي الثوري الفردية من الأمل علامة2 فس (الدقة، ≈ 1 مم زئبق؛ ف س2 النطاق، 1-100 ملم زئبق). جزء صغير البروتونية الأمل (نموذج) علامة الرقم الهيدروجيني في النطاق من 6 إلى 8.0 (الدقة، ± 0.05). قيمة سعر الصرف بروتون (معبراً عنها بملغ) مع Pi المنتزعة عن طريق محاكاة الأطياف علامة Pi (الدقة، ± 0.1 ملم، النطاق، 0.1-20 ملم). يتم تنفيذ إجراءات المعايرة في درجة الحرارة الفسيولوجية (37 درجة مئوية) وحل القوة الأيونية (كلوريد الصوديوم، 150 مم) وتركيز التحقيق الأمل من 0.2 مم، كما هو موضح سابقا في مراجع12،18، والمفصلة أدناه.
    1. إزالة المسبار الأمل من الثلاجة وتسمح للحاوية الحارة إلى درجة حرارة الغرفة (10-15 دقيقة).
    2. تزن بملغ 10.7 المسبار الأمل، حله في 1 مل المحلول الملحي، وضبط ال pH إلى 7.4. إضافة 20 ميليلتر الحل الأسهم المعدة للأمل (10 مم) إلى 0.98 مل المحلول الملحي للحصول على 0.2 مم أمل التحقيق الحل.
    3. لمعايرة مسبار درجة الحموضة، تيتراتي 0.2 مم الحل مسبار الأمل بإضافة كمية صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم أو HCl، مع التخفيف النهائي للعينة أقل من 1%. قياس درجة الحموضة مع قطب الأس الهيدروجيني معايرة في 37 درجة مئوية باستخدام قيم الأس الهيدروجيني لحل المرجع وأوصى بالوطنية المكتب من المعايير (الولايات المتحدة). استخدم كوب رد فعل تغلف يعلق على مدوار للحفاظ على درجة الحرارة المرجعية وحلول معاير بعناية أثناء قياس درجة الحموضة. المحافظة على شروط وصول بإضافة الجلوكوز 10 ملم واوكسيديز الجلوكوز يو/مليلتر 100 من الحلول التحقيق.
    4. الحصول على الأطياف الجيش الشعبي الثوري من النماذج ألف وباء على درجة الحموضة ≤ 5 ودرجة الحموضة ≥ 8، على التوالي، في ظروف وصول في الغياب للفوسفات.
    5. استخدام الأطياف المقابلة للحصول على المعلمات الطيفية الجوهرية. إلا وهي محاكاة الخط الطيفية كالالتواء الدالة لورينتزيان مع وظيفة غاوسي يقارب هيكل المسبار الأمل هايبرفيني سوبر التي لم تحل بعد. تركيب الأطياف الجيش الشعبي الثوري المحسوب للاطياف تجريبي ينتج قيمف ولينيويدث لورينتزيان (ΔLpp)، تحدد معدل استرخاء عرضية، 1/T2 (حيث 1/T2 = pp (√3/2) ل المشتقة يقاس من خط امتصاص الترددات اللاسلكية في الجيش الشعبي الثوري الأسلحة الكيميائية)، ولينيويدث لتوزيع غاوسي، غ.
      ملاحظة: وفيما يلي المعلمات التي تم الحصول عليها من الأطياف مقاسة في الشروط المحددة في الخطوة 1.4.2:P(A) = 3.63 ز،ف(ب) = ز 3.37؛ 1/T2(أ) = 23.6 ملغ؛ 1/T2(ب) = 9 ملغ؛ G(A) = 40 ملغ؛ G(B) = 45 ملغ (انظر المرجع8).
    6. الحصول على الأطياف الجيش الشعبي الثوري أمل على درجة الحموضة الوسيطة (5 < الرقم الهيدروجيني < 8). محاكاة عنصر أطياف الجيش الشعبي الثوري المكتسبة باستخدام نظرية التبادل بين مواقع عدة في النظم غير مقترنة أو المتباعدة مقتبس من مرجع19 كما هو موضح سابقا18قدم عالية. استخدام المعلمات الجوهرية التي تم الحصول عليها ألف وب الدول (راجع الخطوة 1.4.5) إنقاص العدد من المتغيرات. تناسب الأطياف المحسوبة لتلك التجريبية البحث عن قيم كسر (pA)، وارسم اعتمادقيمة p على درجة الحموضة. استخدام الاعتماد فأ على درجة الحموضة في إجراء المزيد من الدراسات كمنحنى معايرة الأس الهيدروجيني.
      ملاحظة: من المناسب اعتماد درجة الحموضة pA مع منحنى معايرة قياسية توفر قيمة الانفصال المستمر، pK (الأمل) = 6.98. في دراسات في فيفو ، الحصول على كامل الأطياف الجيش الشعبي الثوري المسبار الأمل أمر غير عملي بسبب الوقت الإضافي اللازم للحصول على الفجوة القائمة بين مكونات الحقل المنخفضة والعالية من هايبرفيني الفوسفور تقسيم في الطيف الجيش الشعبي الثوري. ولذلك، في إجراء المزيد من الدراسات يتضح قدم عالية مكون فقط من الطيف الجيش الشعبي الثوري تم قياس وتحليل.
    7. لمعايرة مسبار فس2، الحصول على الأطياف الجيش الشعبي الثوري المسبار الأمل تركيزات الأكسجين مختلف.
    8. سلم قيم عنصر التحكم فس2 من الحلول بالسطح مع خليط الغاز من وحدة تحكم غاز. التحكم في درجة الحرارة الحل باستخدام حمام مائي يعلق على الحرارة (37 درجة مئوية).
    9. محاكاة الأطياف الجيش الشعبي الثوري وتلائم تلك التجريبية كما هو موضح في الخطوة 1.4.6 لتحديد قيم معدلات الأوكسجين المستحثة الاسترخاء.
      ملاحظة: قيم معدلات الأوكسجين المستحثة الاسترخاء 0.49 مغ/مم زئبق كلا ألف وب أشكال الأمل في التحقيق كما يقاس على 37 درجة مئوية8.
    10. لمعايرة مسبار [بي]، اكتساب الأطياف الجيش الشعبي الثوري المسبار الأمل تركيزات الفوسفات المختلفة. استخدام حل جذري الأمل بقيمة pH قرب pK (pK = 6.9 في 37 درجة مئوية)18 وتيتراتي أنه مع تركيزات الفوسفات المختلفة. الحفاظ على درجة الحرارة والغاز التكوين كما هو موضح في الخطوات أعلاه.
    11. محاكاة الأطياف الجيش الشعبي الثوري وتلائم تلك التجريبية كما هو موضح في الخطوة 1.4.6 لتحديد القيم التي يسببها بي سعر الصرف.
      ملاحظة: اعتماد سعر الصرف الناجمة عن Pi على [بي] المعايرة في إجراء المزيد من الدراسات.

2. الماوس نماذج لسرطان الثدي

  1. MMTV-الدفع الورم عفوية النموذجي
    1. استخدم الأسبوع 4-8-فيروس ب-نوع الحساسية/المعاهد الوطنية للصحة (ففب/N) الماوس الأورام الثديية الفيروس المروج (ممتف) polyoma الأوسط-تي صديق الإناث القديمة مستضد (الدفع +) الفئران مع الأورام الثديية شكلت عفويا في فيفو دراسات الجيش الشعبي الثوري.
    2. لمقارنة ميكرونفيرونمينتس أنسجة الغدد الثديية العادية والأورام، استخدام الإناث ليتيرماتي مطابقة سن القصور في الدفع السرطاني (PyMT−، "نوع البرية")20.
    3. إخضاع الفئران للتحليل الطيفي المنتجين النطاق L مرة واحدة في الأسبوع لمدة أربعة أسابيع خلال التخدير إيسوفلوراني (انظر مسبار التسليم أدناه).
    4. تخدير الماوس باستخدام خليط هواء-إيسوفلوراني مادة (إيسوفلوراني 3%)، وضع الماوس على جدول قابل لتعديل في موقف الحق، والأفقي مع الورم (الغدد الثديية) قريبة من جهاز رنان لفائف السطحية.
    5. بعد وضع الماوس، إدارة التحقيق بحقن إينتراتيسوال (تكنولوجيا المعلومات) ولحن مطياف الجيش الشعبي الثوري، والحصول على الأطياف التي تكفي لمدة 5-10 دقائق.
    6. قياس 2-3 الأورام الثديية (من ممتف-الدفع + الفئران) أو حمل غير ورم الغدد الثديية (من الفئران PyMT−) خلال نفس الدورة الجيش الشعبي الثوري.
  2. نموذج الورم MET أورثوتوبيك-1
    1. تنمو خلايا سرطان الثدي مورين الخلفية Met-1 ففب/N في 37 درجة مئوية و 5% CO2و 95% رطوبة نسبية في دميم التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 10 ميكروغرام/مل الأنسولين، رهيجف 5 نانوغرام/مل، و 1% PSA (البنسلين G الصوديوم وسلفات ستربتوميسين الامفوتريسين ب) إلى ~ التقاء 80% في قارورة T175.
    2. نضح وسائط الإعلام وشطف الخلايا ملتصقة مع 10 مل برنامج تلفزيوني (1.54 مم خ2ص4، 155 كلوريد الصوديوم، و 2.71 ملم نا2هبو4ح-72س دون كلوريد الكالسيوم أو كلوريد المغنيسيوم، الأس الهيدروجيني = 7.4).
    3. فصل الخلايا عن طريق إضافة 5 مل من محلول يدتا التربسين 0.25% وتعصف قارورة. عندما يتم فصل الخلايا، أضف 10 مل دميم التي تحتوي على 10% FBS لقارورة وجمع الخلايا.
    4. الطرد المركزي من تعليق خلية في 132 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وريسوسبيند إلى 1 × 106 خلايا للواحد 100 ميليلتر دميم ضئيل.
    5. استخدام حقنه الأنسولين (إبرة 29 1/2)، ببطء حقن 100 ميليلتر من تعليق خلية ورم في عدد 4 منصات الدهون الثديية من الفئران البرية نوع ففب/N أنثى عمرها 8 الأسبوع.
    6. رصد بدء الورم عن طريق الجس (يظهر بعد حوالي 2-3 أسابيع) والنمو (مرئي)، والماوس هيث (البصرية) كل يوم.
    7. قياس أبعاد الورم مرة واحدة في الأسبوع باستخدام الفرجار، وتحديد حجم الورم باستخدام المعادلة:
      figure-protocol-15439

3-التحقيق في التسليم للقياسات الوظيفية في فيفو

  1. استخدام مسبار المعلومات اللغوي الجسيمات (البروتوكول الأول) لقياسات2 بو في نماذج الورم أورثوتوبيك بزرع الخلايا السرطانية مع اللغوي-المعلومات المدخلة ميكروكريستالس كما سبق وصف14،21 والمفصلة أدناه.
    1. في حالة نموذج الورم MET-1، لاستيعاب المعلومات اللغوي ميكروكريستالس في خلايا MET-1، تعليق ميكروكريستالس المعلومات اللغوي في دميم بتركيز 20 ملغ/مل و sonicate مع سونيكاتور تحقيق في 20 كيلوهرتز استخدام 7 ث السلطة في أنبوب أسفل المائدة مستديرة 5 مل زجاج لمدة 5 دقائق على الجليد.
    2. إضافة 100 ميليلتر (2 مغ المعلومات اللغوي) من التعليق إلى قارورة T75 مع 10 مل ثقافة الوسائط التي تحتوي على خلايا MET-1 (حوالي 30% روافد). تتم جميع الإجراءات في خزانة السلامة الأحيائية ووسائط الإعلام يحتوي على البنسلين ووالستربتوميسين للتقليل من الإصابة المحتملة.
    3. الخلايا في 37 درجة مئوية ح 72، أو حتى تصل إلى احتضان ~ كونفلوينسي 80%.
    4. نضح وسائط الإعلام. تغسل الخلايا خمس مرات مع 10 مل برنامج تلفزيوني. فصل الخلايا مع 5 مل التربسين-يدتا. جمع الخلايا. أجهزة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.2.4. وصمة عار عينة خلايا ذات صبغة الاستبعاد لتحديد جدوى الخلية والكمية.
    5. تعليق الخلايا بتركيز 1 × 106 لكل 100 ميليلتر دميم ضئيل.
    6. باستخدام الحقن الأنسولين، ببطء حقن 100 ميليلتر من تعليق خلية تحتوي على ميكروكريستالس اللغوي-المعلومات المدخلة في منصات الدهون الثديية رقم 4 من عمرها 8 الأسبوع الإناث الفئران البرية نوع ففب/N كما هو موضح في الخطوة 2.2.5.
    7. رصد بدء الورم والنمو كما هو موضح في الخطوات 2.2.6 و 2.2.7.
  2. استخدام الجسيمات التحقيق اللغوي-المعلومات (البروتوكول الثاني) أما عفوية أو نماذج أورثوتوبيك. حقن ميكروكريستالس اللغوي-OBu في الموقع للفائدة، مثلاً، في الغدد الثديية العادية أو الأورام الثديية، استخدام الحقن الأنسولين.
  3. المسابر القابلة للذوبان
    1. تخدير الفئران بالاستنشاق لأن خليط الهواء-إيسوفلوراني (التسليم 1.0 لتر في الدقيقة و 2-3% من إيسوفلوراني) باستخدام تخدير الجهاز ووضعها في فجوة مطياف الجيش الشعبي الثوري.
    2. لحن الصك، ثم حقن NR (10-30 ميليلتر، 10 ملم)، مسبار الأمل (10−30 ميليلتر، 0.5-2 مم) في المحلول الملحي أو الرقم الهيدروجيني 7.2 رسر التحقيق بحلول [دمس] (10 ميليلتر، 10 ملم) (تكنولوجيا المعلومات).

4-القياسات الوظيفية في فيفو

  1. للجيش الشعبي الثوري القياسات الطيفية، تخدير الفئران باستنشاق خليط الهواء-إيسوفلوراني باستخدام جهاز تخدير كما هو موضح في الخطوة 3.3.1.
  2. إجراء القياسات الوظيفية باستخدام مطياف المنتجين النطاق L (1.2 جيجاهرتز) كما يلي.
    1. ضع مرنان لفائف السطحية على غدة الثديية عادية أو الأورام الثديية ولحن والمطياف.
    2. الحصول على الأطياف الجيش الشعبي الثوري من المسبار مزروع جسيمات دقيقة 5−10 على مدى عدة أسابيع بعد زرع. في حالة المسابير القابلة للذوبان، الحصول على الأطياف الجيش الشعبي الثوري فورا بعد الحقن المسبار لمدة 5-10 دقائق.
    3. تحليل الأطياف الجيش الشعبي الثوري المسبار NR للعثور على هايبرفيني تقسيم،N، وإشارة السعة، I(t). تحويل قيمةن إلى قيمة الرقم الهيدروجيني باستخدام منحنى المعايرة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.2.4. تحليل معدل انحلال السعة إشارة I(t) كالتغير النسبي من السعة الأولية، I(t = 0)، والمحسوبة في وحدات التعسفي في الثانية (s-1).
    4. احتواء الزيادة في عنصر مونوراديكال في طيف مسبار رسر المراعية للمدفع جريازيف إلى مونوكسبونينتس للحصول على وقت ثابت لحركية الأسية لحساب تركيز المدفع جريازيف الجيش الشعبي الثوري.
    5. تناسب الأطياف الجيش الشعبي الثوري عنصر الحقل السامي المسبار الأمل متعدد الوظائف لتلك التجريبية كما هو موضح في (الخطوة 1.4.5) تعطي قيم الأس الهيدروجيني، فس2 وبي.

5-إحصائية تحليل

  1. القيام بتجهيز البيانات والتحليلات الإحصائية. استخدام اختبار بيرسون الارتباط r (لمجموعات البيانات الموزعة عادة) و "مرتبة ترتيب الارتباط" في سبيرمان (لمجموعات البيانات بطبيعتها المرفوضة لتوزيع البيانات) لتحليل الارتباط.

النتائج

الأنسجة ف O 2 يسبر تقييم استخدام اللغوي-المعلومات:

باستخدام الإجراء الموضح في الخطوة 1، 1، نحن إجراء المعايرة لتعليق ميكروكريستالس اللغوي-المعلومات الطازجة. ويبين الشكل ...

Discussion

تسمح أساليب عرض موسع في فيفو التقييم للمعلمات حرجة من TME الكيميائية، أي فس2، ودرجة الحموضة، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات بي الخلالي والمدفع جريازيف داخل الخلايا. تقنيات الرنين المغناطيسي، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي ومنخفضة-ميدان الجيش الشعبي الثوري، هي أساليب ال...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل كان تدعمها جزئيا في المعاهد الوطنية للصحة منح CA194013 و CA192064 و U54GM104942. من المسلم به وفكتسي لبدء ففك، AB، و TDE. يشكر المؤلفون جينشيفا م. د. و. ك. شتاينبرجر للمساعدة مع تجارب توضيحية. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
L-band EPR spectrometerMagnettech, GermanyL-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules
 Temperature & Gas Controller Noxygen, GermanyTemperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition  
SonicatorFisher Scientific
GSH (L-Glutathione reduced)Sigma-AldrichG4251
MMTV-PyMT  miceIn house
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Met-1 murine breast cancer cellsIn house
C57Bl/6 wild type mice Jackson Laboratory
TrypsinThermo Fisher Scientific25200056
Trypan Blue Exclusion Dye Thermo Fisher ScientificT10282
Ohmeda Fluotec 3 
Isoflurane (IsoFlo)Abbott Laboratories
Sodium phosphate dibasicSigma-AldrichS9763
Sodium phosphate monobasicsigma-AldrichS07051
Sodium Chloridesigma-AldrichS7653
Hydrochloric acidsigma-Aldrich320331
Sodium Hydroxidesigma-AldrichS8045
Glucosesigma-Aldrich
Glucose oxydasesigma-Aldrich
Lauda Circulator E100Lauda-Brikmann
pH meter OrionThermo Scientific 
LiNc-BuO probeIn houseThe Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13
NR probeIn houseThe Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11
RSSR probeIn houseThe di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15
HOPE probeIn houseThe monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12

References

  1. Siemann, D. W. . Tumor Microenvironment. , (2011).
  2. Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
  3. Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
  4. Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
  5. Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
  6. Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
  7. Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
  8. Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233 (2017).
  9. Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
  10. Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
  11. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
  12. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
  13. Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
  14. Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
  15. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  16. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
  17. Khramtsov, V. V., Zweier, J. L., Hicks, R. . Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , 537-566 (2010).
  18. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
  19. Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. . Practical NMR spectroscopy. , (1980).
  20. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  21. Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
  22. Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
  23. Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
  24. Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
  25. Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
  26. Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
  27. Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved