JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وتعرض هذه الورقة طريقة تنطوي على التوليف وتوصيف لاستهداف الوحيدات المذيلات أمفيفيلي الببتيد والمقابلة لها فحوصات لاختبار توافق مع الحياة وقدرة مذيل لربط وحيدات.

Abstract

تصلب الشرايين هو مساهم رئيسي في أمراض القلب والشرايين، السبب الرئيسي للوفاة في العالم، الذي يدعى حياة 17.3 مليون سنوياً. تصلب الشرايين هو أيضا السبب الرئيسي للموت المفاجئ واحتشاء عضلة القلب، بتحريض من لويحات غير المستقرة التي تمزق وأوككلودي الأوعية الدموية دون سابق إنذار. التصوير الطرائق الحالية لا يمكن التفريق بين لويحات المستقرة وغير المستقرة التي تمزق. الببتيد أمفيفيليس المذيلات (PAMs) يمكن التغلب على هذا العيب كما أنها يمكن تعديلها مع مجموعة متنوعة من استهداف مويتيس التي تربط على وجه التحديد للأنسجة المريضة. أظهرت وحيدات لتكون علامات مبكرة لتصلّب الشرايين، بينما يرتبط تراكم كبير من وحيدات مع لويحات المعرضة للتمزق. ومن ثم، يمكن استخدام الجسيمات النانوية التي يمكن أن تستهدف وحيدات لتميز مراحل مختلفة من تصلب الشرايين. تحقيقا لهذه الغاية، هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإعداد الوحيدات-استهداف PAMs (الوحيدات chemoattractant البروتين-1 (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1) PAMs). PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 يتم تجميعها ذاتيا من خلال التوليف تحت ظروف معتدلة بشكل جسيمات نانوية من 15 نانومتر في قطر بالقرب من تهمة السطحية محايدة. في المختبر، PAMs تم العثور على أن يكون متوافق حيويا وكان تقارب ملزم عالية وحيدات. إظهار الأساليب الموصوفة هنا وعد لمجموعة واسعة من التطبيقات في تصلب الشرايين، فضلا عن الأمراض الالتهابية الأخرى.

Introduction

أمراض القلب والأوعية الدموية تبقى إلى أن الأسباب الرئيسية للوفاة على الصعيد العالمي مع حوالي1من 17.3 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم. أمراض القلب والأوعية الدموية هي أسهم بتصلب الشرايين، شرط فيها لويحات تتراكم في الشرايين، مما يمنع الدم وتدفق الأكسجين إلى خلايا الجسم2،3. ويشمل تطور تصلب الشرايين تصلب الشرايين وسماكة الاستجابة الالتهابية، والايض الدهني غير النظامية، وتراكم البلاك، مما يؤدي إلى اللوحة تمزق واحتشاء عضلة القلب4،5. خلايا بطانية التعبير عن جزيئات السيتوكينات والالتصاق، التي تشمل العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 التي تربط لمستقبلات تشيموكيني ج-C (CCR2) الموجودة على سطح وحيدات6،،من78. تحويل الكولسترول المؤكسد وحيدات إلى الضامة خلال المرحلة المبكرة من تشكيل اللوحة، مما يضاعف الاستجابة الالتهابية في المنطقة ويؤدي إلى إصابة الأنسجة وتشكيل لويحات غير مستقرة أو الضعيفة9، 10.

عادة، يتم تقييم تصلب الشرايين بتقييم لومينال تضيق التشريحية التصوير باستخدام الموجات فوق الصوتية أو تصوير الأوعية11،12. ومع ذلك، هذه الأساليب يمكن فقط تحديد تضييق شديد للجدار الشرياني وليس في مرحلة مبكرة من تصلب الشرايين، كما يؤدي النمو اللوحة الأولى يعيد البناء الشرياني الحفاظ على حجم الشريان والدم تدفق معدل12،13، 14. ولذلك، أونديريبريسينت أنجيوجرامس انتشار تصلب الشرايين. بالإضافة إلى ذلك، حسبت موسع تقنيات التصوير مثل انبعاث فوتون واحد التصوير المقطعي والتصوير المقطعي بالبوزيترون، والتصوير بالرنين المغناطيسي مؤخرا قد استخدمت لتوصيف مورفولوجيا اللوحة كما أنها يمكن أن توفر التفاصيل الأولية و توصيف لويحات. ومع ذلك، هذه الطرائق غالباً محدودة بسبب الافتقار إلى الحساسية، القرار المكانية، أو تتطلب استخدام الإشعاع المؤين، مما يجعل التصوير البلاك التقدم في مختلف مراحل أكثر تحديا1615،، 17. ويظل نظام تصوير للتسليم أن تحدد على وجه التحديد لويحات في مراحل مختلفة من تصلب الشرايين توضع.

جسيمات نانوية أظهرت أن تكون منصة ناشئة في فيفو البلاك الاستهداف والتشخيص18،19،،من2021. على وجه الخصوص، PAMs مفيدة نظراً لتنوع المواد الكيميائية والقدرة على استيعاب مجموعة متنوعة من مويتيس والتراكيب، والأحجام، والأشكال والسطحية الروغان22. أمفيفيليس الببتيد (PAs) تتكون من ماء، الببتيد "هيدجروب" يعلق على ذيل مسعور، التي عادة ما تكون الدهون؛ هذا الهيكل amphiphilic يضفي قدرات ذاتية التركيب ويسمح لعرض متعددي الببتيدات على سطح الجسيمات22،،من2324. هيادجروبس الببتيد يمكن أن تؤثر على شكل الجسيمات عن طريق الطي والربط بين الببتيدات25الهيدروجين. أظهرت الببتيدات أمثال من خلال التفاعل β-ورقة لتشكيل المذيلات ممدود، بينما يمكن أن تشكل تأكيد α-حلزونية كلا المذيلات كروية وطوله22،،من2324، 25،،من2627. يمكن وضع linkers البولي إثيلين غليكول (شماعة) أن الدرع بتهمة الببتيد السطحية بين الببتيد ماء وذيل مسعور PAMs، تعزيز توافر نانوحبيبات في الدوران الجهازي28، 29 , 30 , 31-PAMs أيضا مفيدة لأنها متوافق حيويا وقد ثبت أن لديها مجموعة واسعة من التطبيقات32،33. قابلية الذوبان في الماء من المذيلات يوفر ميزة على سائر الأنظمة المستندة إلى نانوحبيبات مثل بعض الجسيمات النانوية البوليمرية التي هي غير قابلة للذوبان في الماء، ويجب أن تكون قد علقت في سولوبيليزيرس لحقن34. بالإضافة إلى ذلك، يجعل القدرة على خلق PAMs أن تفكيك في الاستجابة لمحفزات محددة PAMs مرشح جذابة ل توصيل العقاقير الخاضعة للمراقبة داخل الخلايا35.

ملزمة لمستقبلات CCR2 وتتراكم في قوس الاورطي، وضعت PAMs سابقا الوحيدات تستهدف رصد المراحل المختلفة للآفات تصلب الشرايين في الشريان الاورطي9. في الفئران-/- الذين يزيد تراكم الوحيدات تناسبياً إلى اللوحة تقدم36. وعلاوة على ذلك، وجد أن المرضى الذين يعانون من لويحات المعرضة لتمزق، والمرحلة المتأخرة تحتوي على كميات أعلى من وحيدات37. ولذلك، بتعديل PAMs لإدماج العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 مفيد لأنه يسمح لقدر أكبر من الدقة الاستهداف والتفريق بين الآفات المبكرة والمتأخرة من مرحلة تصلب الشرايين. كما أن هذه الدراسات دليلاً على مفهوم التحقق من أن PAMs أمنا بما يكفي لاستخدامها بريكلينيكالي ويتم مسح رينالى38. وحيدات والتهاب مميزة للأمراض الأخرى، PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 يكون يمكن أن تستخدم للتطبيقات التشخيصية والعلاجية في أمراض أخرى وراء تصلب الشرايين8،،من3940 , 41.

هنا، نحن تقرير تلفيق PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 قابلة الغاية وتجميعها ذاتيا التي أظهرت الحجم الأمثل للجسيمات وتهمة السطحية، والاستهداف الانتقائي وحيدات لتطبيقات الصور المحسنة في تصلب الشرايين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: قراءة العظمية الكاشفات واتبع جميع تدابير السلامة الكيميائية كما هو مطلوب من المؤسسات المحلية.

1-الإعداد للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs

  1. الإعداد للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 الببتيد
    1. تزن من 0.25 mmol من معتدلاً-L-ليز (بنك)-وانغ في سفينة رد فعل (RV). شطف في الجانب من RV مع 5 مل ديميثيلفوراميدي (DMF) في غطاء الأبخرة كيميائية.
    2. تحميل RV على المزج الآلي benchtop ببتيد. التحميل المسبق وتعبئتها من الأحماض الأمينية القنينات، ن '--سينفتينركيسفقرلاسيريتس--ج'، من C إلى N-المحطة. وتشمل قنينة فارغة في نهاية الخطوة النهائية deprotection.
      ملاحظة: ببتيد سارعت بالتسلسل، ن '--كنسييرسكقفلرستريفرساتيك--ج'، يمكن أيضا توليفها باستخدام البروتوكول نفسه.
    3. بمجرد الانتهاء من تجميع نقل الببتيدات راتنج من RV إلى القنينة التﻷلؤ مع الميثانول مل 2-3 حتى يتم نقل كافة الراتنجات. بعد الراتنج غرقت إلى الأسفل، إزالة الميثانول طافية وتتبخر المتبقية حتى الجاف. الفراغ الجافة ح 2 إضافية، أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    4. جعل الحل انشقاق 12 مل تحتوي على حمض:ethanedithiol:water:triisopropylsilane (تفا) تريفلوراسيتيك في 94:2.5:2.5:1 المجلد % في غطاء الأبخرة كيميائية. دوامة الانقسام والحل للتأكد من أنها مختلطة بالتساوي.
      تنبيه: لأن ترييسوبروبيلسيلاني واثانيديثيول حساسة للهواء، الأرجون تطهير الأسهم قارورة ترييسوبروبيلسيلاني واثانيديثيول لمدة 1 دقيقة قبل وضعها مرة أخرى.
    5. وضع السفينة التوليف (SV) على شاكر ذراع واسطة لقط بالقرب من الأسفل نصف SV. نقل الراتنج الببتيد إلى SV مع 2 مل من محلول الانقسام حتى يتم نقل كافة الببتيد-الراتنجات.
    6. أغسل جانبي SV مع 3 مل حل الانقسام. قم بإغلاق غطاء SV وهزه في الدقيقة ذبذبات 300 ح 4.
    7. تزن بأنبوب الطرد مركزي فارغة 50 مل. السجل الشامل.
    8. بعد ح 4، استنزاف الحل الببتيد ملصوق من SV في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد المركزي. شطف SV عدة مرات مع حل الانقسام المتبقية.
    9. تتبخر الحل الببتيد ملصوق مع النيتروجين حتى يكون هناك أقل من 4 مل المتبقية في الأنبوب الطرد المركزي.
    10. إضافة مل 36 المثلج خماسي البروم ثنائي الفينيل في حل المشقوق الببتيد.
    11. دوامة الحل حتى أنه تماما اللون الأبيض أو الأصفر. الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وصب المادة طافية.
    12. إضافة 40 مل الاثير المثلج للأنبوب. دوامة و sonicate مرة أخرى. كرر عملية الطرد المركزي. صب المادة طافية.
    13. جاف بيليه السلطة الفلسطينية النفط الخام مع تطهير غاز النيتروجين حتى تبخرت الاثير هو واضح.
    14. إضافة 20 مل المقطر مزدوجة والمياه، ودوامه، و sonicate حتى يذوب الببتيد تماما في الحل.
    15. تجميد الحل وليوفيليزي حتى الجاف.
    16. بمجرد الببتيد هو المجففة، تزن خارج كتلة أنبوب الطرد المركزي التي تتضمن الببتيد الخام. حل الببتيد الخام في المياه 5 ملغ/مل.
    17. حل 25 ملغ من النفط الخام الببتيد العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 في 5 مل من الماء المقطر مزدوجة لجعل مجموع تركيز 5 ملغ/مل. تنقية الببتيد العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 النفط الخام من كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) باستخدام 0.1% تفا في الماء (المذيب A) و 0.1% تفا في الاسيتو الانيتريل (المذيب ب) كمراحل المتنقلة على عمود عكس مرحلة C8. حقن 5 مل الببتيد [هبلك].
      ملاحظة: المرحلة الأولى متنقلة تتألف من المذيبات 100% ألف بمعدل تدفق 9.0 مل/دقيقة إنقاص المذيبات ببطء إلى 30 في المائة في 27 دقيقة وعقد في هذا التكوين للحد الأدنى 3 عودة المتدرجة للمذيبات 100% 3 دقيقة وعقد في هذا التشكيل لمدة 1 دقيقة لإعطاء أكثر إجمالي وقت تشغيل من 34 دقيقة تبقى عمود درجة حرارة 55 درجة مئوية. استخدام وضع مصدر أيون إيجابية للتحليل. يمكن استخدام حمض الفورميك بدلاً من تفا، إذا تفا حمضية جداً للعمود [هبلك]. من المستحسن لا تتجاوز سرعة المنحدر تشكيل المذيبات العضوية 2%/min لفصل أفضل.
    18. تحليل كل جزء باستخدام الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين (استخدام) الكتلي للمنتج المتوقع m/z في 2,890.
      ملاحظة: حل حمض α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك في 1 ملغ/مل في المياه الاسيتو الانيتريل (المجلد 50: 50 ٪) كحل المصفوفة. بقعة 0.75 ميليلتر من محلول مصفوفة على استخدام لوحة، تليها ميليلتر 0.75 لكل جزء. القيام التحليل باستخدام طريقة أيون انعكاسا إيجابيا في نطاق شامل من 500-5,000 دا.
    19. الجمع بين أجزاء المنتج، ضربة قبالة الاسيتو الانيتريل، تجميد، وليوفيليزي المنقي الببتيدات حتى الجافة.
  2. إعداد السلطة الفلسطينية العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1
    1. إعداد من فائض مولى 1.1 من 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-ن-[amino(polyethylene glycol)-2000 [دسب-شماعة (2000)-ماليميدي إلى الببتيد في قنينات التﻷلؤ منفصلة. يحل كل من المركبات في الماء المقطر مزدوجة لجعل ~ 15 ملغ/مل. Sonicate لمدة 15 دقيقة، أو حتى كل الحلول واضحة تماما.
      ملاحظة: دسب-شماعة (2000)-Cy5 يتم تصنيعه باستخدام البروتوكول نفسه مع دسب-شماعة (2000)--أمين و Cy5 إستر فونكتيوناليزيد ن-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS)، باستثناء الخطوة 1.2.3، حيث يتم ضبط الأس الهيدروجيني للحل إلى 8.5.
    2. إضافة دسب-شماعة (2000)-ماليميدي الحل إلى الحل الببتيد. دوامة و sonicate.
    3. إضافة 1 "م هيدروكسيد الصوديوم" dropwise (1 ميليلتر) في وقت واحد حتى الرقم الهيدروجيني للحل هو 7.
    4. الحل إزالة النيتروجين للحد الأدنى 5 إثارة الحل بين عشية وضحاها.
    5. تجميد الحل وليوفيليزي حتى الجاف.
    6. مرة واحدة هو المنتج الخام المجففة، حل الصلبة في الماء 5 ملغ/مل.
    7. تنقية مع [هبلك] كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: الببتيد أونكونجوجاتيد و DSPE-PEG(2000) أن الوت بين 15 30 في المائة تركيز العضوية (المجلد %)، بينما دسب-شماعة المتقارن (2000)-العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 ينبغي أن الوت بين 40-50% تركيز العضوية.
    8. تحليل كل جزء باستخدام استخدام الطيف الكتلي للمقابلة م/ز. دسب-شماعة (2000)-العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 ينبغي أن يكون ذروة واسعة m/z في 5,760.
      ملاحظة: حمض 2، 5-ديهيدروكسيبينزويك أفضل المصفوفة لشماعة دسب (2000)-العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 باستخدام.
  3. الجمعية العامة للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs
    1. حل 1.75 mg PAs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 مع 3 مل الميثانول في قنينة 1-أرميني. Sonicate حتى يذوب العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 "السلطة الفلسطينية" تماما.
      ملاحظة: يمكن إدراج أمفيفيليس Cy5 بنسبة مولى 10:90 "السلطة الفلسطينية" العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 للتطبيقات التصوير.
    2. يتبخر الميثانول تحت النيتروجين في حركة دائرية أثناء الشطف الميثانول المتبقية قبالة الجانب القنينة حتى يتم تشكيل فيلم موحدة في أسفل القنينة. الفراغ الجافة الفيلم بين عشية وضحاها.
    3. هيدرات الفيلم مع 3 مل من المخزن المؤقت للمياه أو الفوسفات المالحة (PBS) جعل حل 100 ميكرون من العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs. بلطف من دوامة و sonicate الحل حتى واضحة. احتضان عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: درجة حرارة مرتفعة قد ثبت للتعجيل بعملية التجميع الذاتي ويسمح المكون الببتيد لتشكيل هيكل الثانوية الأكثر استقرارا، بينما خفض تركيز (CMC) مذيل الحرجة42،43.
    4. بارد التشتت الناتج إلى درجة حرارة الغرفة.

2-وصف العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs

  1. تشتت الضوء الحيوي (DLS) وزيتا المحتملة
    1. المكان 100 ميكرومتر بالعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 "أم" أو أم سارعت في ومبومو وفقا لتعليمات الصك المحتمل DLS أو زيتا.
      ملاحظة: دائرة الأراضي والمساحة وزيتا الترعة المحتملة يمكن أن تختلف استناداً إلى الإرشادات في الصك.
    2. حجته الصك إلى درجة حرارة الغرفة. قياس حجم وتهمة السطحية بام.
  2. مجهر إلكتروني (TEM)
    1. إضافة ميليلتر 7 من 50 ميكرومتر علقت بالعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 أم أو أم سارعت إلى شبكة ال داخل الملاقط إغلاق الذاتي للحد الأدنى 5 الفتيل بعيداً الحبرية مع مسح مهمة حساسة.
    2. إضافة 7 ميليلتر من الماء لغسل الشبكة. فتيلة بعيداً الحبرية.
    3. إضافة ميليلتر 7 1 wt % حمض فوسفوتونجستيك للحد الأدنى 2 الفتيل بعيداً الحبرية. كرر الخطوة 2.2.2.
    4. الجاف للشبكة تيم قبل تحليل ال.
  3. مطيافية تلوانيه دائرية (CD)
    1. قم بتشغيل النيتروجين لمدة 5-10 دقائق قبل استخدامها للصك.
    2. ضع 300 ميليلتر من فارغة (الماء أو برنامج تلفزيوني) في ومبومو.
    3. قياس الأطياف في شمال البحر الأبيض المتوسط 190-265، 0.2 مم طول المسار مع وقت تكامل s 1، وشمال البحر الأبيض المتوسط 1 عرض النطاق ترددي في درجة حرارة الغرفة. جمع 3 وإنشاء نسخ متماثلة.
    4. قياس 100 ميكرومتر العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 الببتيد، "أم" العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، سارعت الببتيد، وسارعت بام تحت نفس الظروف الموصوفة في الخطوة 2.3.3. استقطاع من الفراغ.
    5. تناسب البيانات باستخدام استيفاء خطي بوليليسيني أساس الأطياف.
    6. إيقاف تشغيل الأداة. انتظر 10 دقائق قبل إيقاف تشغيل النيتروجين.

3-تحليل في المختبر للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs

  1. توافق مع الحياة في المختبر
    1. الثقافة وتوسيع وحيدات موريني WEHI 274.1 في "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% البنسلين-ستربتوميسين، و 0.05 ملم 2-mercaptoethanol في 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 إلى الممر 5.
      ملاحظة: WEHI 274.1 هي تعليق الخلايا. الإعلام عند استزراع، ينبغي أن تعاد كل 2-3 أيام.
    2. بيبيت وحيدات في وسائل الإعلام في أنبوب الطرد مركزي عقيمة 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    3. نضح وسائط الإعلام القديمة وريسوسبيند في 10 مل وسائط جديدة في أنبوب الطرد المركزي. المزيج ببطء حتى الخلايا وتوزع بالتساوي في وسائل الإعلام. عد الخلايا باستخدام التلوين تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير.
    4. تمييع الخلايا مثل أن هناك وحيدات 4,000 كل ميليلتر 90 من وسائل الإعلام كل بئر. إضافة ميليلتر 90 من الخلايا في آبار صفيحة 96-جيدا. احتضانها ح 24.
      ملاحظة: تجنب استخدام الآبار على الحافة الخارجية اللوحة لتجنب الخلافات في التبخر والتغيرات الحرارية في اللوحة. سد الآبار الخارجي مع 100 ميليلتر PBS.
    5. حل µmol 0.15 الببتيد العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 أو بالعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 "أم"، سارعت الببتيد أو أم سارعت في 150 ميليلتر PBS في أنابيب ميكروسينتريفوجي منفصلة، والتعقيم. أداء تمييع المسلسل جعل ميليلتر 65 من 1 و 10 و 100 ميكرومتر لكل عينة.
    6. إضافة 10 ميليلتر PBS كل التركيز في الآبار التي تحتوي على WEHI 274.1 (الحجم الإجمالي: 100 ميليلتر الواحد جيدا، 6 خطوط الآبار الإجمالية 96). احتضانها ح 72.
    7. إضافة 10 ميليلتر (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) في كل بئر. احتضانها ح 1.
    8. تحليل امتصاص استخدام قارئ لوحة في 490 نيوتن متر أو استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة.
  2. في المختبر ملزمة مذيل
    1. البذور 500,000 وحيدات في كل بئر من لوحة 6-جيدا في 2 مل وسائط التي تحتوي على 100 ميكرومتر "أم" العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 المسمى Cy5 (نسبة 10:90 المولى دسب-شماعة (2000)-Cy5 و "السلطة الفلسطينية" العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1). احتضانها ح 1.
    2. جمع WEHI 274.1 بالطرد المركزي على 300 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح وسائط الإعلام.
    3. ريسوسبيند وغسل الخلايا في 2 مل برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح في برنامج تلفزيوني. كرر عملية الغسيل مع 2 مل برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني.
    4. إضافة 2 مل من البرد بارافورمالدهيد 4% إصلاح الخلايا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    5. بيبيت الخلايا الثابتة على ساترة زجاجية معقمة داخل آبار لوحة 6-جيدا. الطرد المركزي في 400 غرام x لمدة 5 دقائق.
    6. قم بإزالة بارافورمالدهيد. غسل وشطف مع 2 مل برنامج تلفزيوني مرة واحدة. ريسوسبيند مع 1 مل PB
      ملاحظة: عند الشطف، تجنب تعطيل الخلايا على ساترة.
    7. وضع 10 ميليلتر من والغليسيرول 90% في برنامج تلفزيوني على شريحة. استخدام إبرة وملقط لالتقاط ساترة. جاف على حافة ساترة. بلطف ضع ساترة إلى شريحة facedown.
    8. ختم بلطف على حافة ساترة مع طلاء الأظافر واضحة. ضع في الثلاجة حتى جاهزة للتصوير.
    9. استخدام ليزر [كنفوكل] المسح مجهر (كلسم) المثبتة مع أشعة الليزر ل Cy5 في λالإثارة = 650 نانومتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الإعداد للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 بام
عزر ملزمة CCR2 (بقايا 13-35) للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 البروتين [ينفتنركيسفقرلاسيريتسك] أو الببتيد المجمعة [ينسلففريرنستقركيراسيست] تعديل بإضافة بقايا سيستين على N-المحطة. الببتيد العملية التشاورية المت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 هي منصة تصوير جزيئي واعدة، تتألف من الببتيد استهداف ماء وذيل مسعور الذي يدفع بطبيعة نانوحبيبات تجميعها ذاتيا. يمكن إعداد هذا مذيل استهداف الوحيدات بتوليف بسيطة وخطوات تنقية العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 الببتيد ودسب-شماعة (2000)-العملية التشا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

الكتاب يود أن ينوه دعم مالي من جامعة كاليفورنيا الجنوبية وقلب الوطنية والرئة، والدم معهد (NHLBI)، R00HL124279، وايلي واديت جائزة الابتكار واسعة ومؤسسة ويتير عدم-السرطان جائزة البحوث متعدية الجنسيات الممنوحة للمجموعة. يشكر المؤلفون المركز الميكروسكوب الإلكتروني وسليكيه، ومركز التميز في نانوبيوفيسيكس، ومركز التميز "التوصيف الجزيئي" ويشغل مركز تصوير في جامعة كاليفورنيا الجنوبية للمساعدة في الأجهزة مفيدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-ethanedithiolVWRE0032for peptide synthesis
10 mL disposable serological pipetsVWR89130-898for cell culture
15 mL centrifuge tubes, polypropyleneVWR89401-566for various applications
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99%Fisher ScientificAC165200050for MALDI
25 mL disposable serological pipetsVWR89130-900for cell culture
2-Mercaptoethanol, 50 mMThermoFisher Scientific31350010for cell culture
5 mL disposable serological pipetsVWR89130-896for cell culture
50 mL centrifuge tubesVWR89039-658for various applications
75 cm2 culture flaskFisher Scientific13-680-65for cell culture
75 mL reaction vesselProtein Technologies3000005for peptide synthesis
96-wells cell culture plateVWR40101-346for MTS assay
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ScientificA998SK-4for HPLC purification
Borosilicate glass, 1 dramVWR66011-041for PAM synthesis
Borosillicate glass pipet, Long tipsVWR14673-043for various applications
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mmFisher Scientific12-542Bfor confocal microscopy
Cy5 amineAbcamab146463for peptide conjugation
Diethyl ether, ACS gradeFisher ScientificE138-1for peptide precipitation
Disposable syringes, 20 mLFisher Scientific14-817-54for HPLC purification
Double neubauer ruled hemocytometerVWR63510-13for cell counting
DSPE-PEG(2000) amineAvanti880128Pfor peptide conjugation
DSPE-PEG(2000) maleimideAvanti880126Pfor peptide conjugation
DSPE-PEG(2000)-NHS ester NanocsPG2-DSNS-10Kfor conjugation to Cy5
Dulbecco's modified eagle medium-high glucoseSigma AldrichD5796-500MLfor cell culture
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivatedThermoFisher Scientific10438026for cell culture
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Afor peptide synthesis
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBFfor peptide synthesis
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ifor peptide synthesis
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Lfor peptide synthesis
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBCfor peptide synthesis
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ffor peptide synthesis
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Vfor peptide synthesis
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 meshNovabiochem856013for peptide synthesis
Formic acid, optima LC/MS gradeFisher ScientificA117-50for HPLC purification
GlycerolVWRM152-1Lfor confocal microscopy
Hand tally counterFisher ScientificS90189for cell counting
Magnetic stir bars, egg-shapedVWR58949-006for peptide conjugation
Methanol, ACS certifiedFisher ScientificA412-4for PAM synthesis
MTS cell proliferation colorimetric assay kitVWR10191-104for MTS assay
N,N-Dimethylformamide, sequencing gradeFisher ScientificBP1160-4for peptide synthesis
N-MethylmorpholineProtein TechnologiesS-1L-NMMfor peptide synthesis
ParaformaldehydeFisher ScientificAC416780250for fixing cells
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010049for various applications
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mLThermoFisher Scientific15140122for cell culture
Peptide synthesis vessel, 25 mL Fisher ScientificCG186011for peptide synthesis
Phosphotungstic acid Fisher ScientificA248-25for TEM
PiperidineSpectrumP1146-2.5LTGLfor peptide synthesis
Plain glass microscope slide 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3for confocal microscopy
Reagent reservoirs, sterile VWR95128093for cell culture
Self-closing tweezerTedPella515for TEM
TEM support filmTedPella01814Ffor TEM
Trifluoroacetic acid Fisher ScientificBP618-500for peptide cleavage and HPLC purification
TriisopropylsilaneVWRTCT1533-5mlfor peptide cleavage
Trypan blue solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061for cell counting
Tweezer, general purpose-serratedVWR231-SA-SEfor confocal microscopy
WEHI-274.1ATCCATCC CRL-1679murine monocyte
automated benchtop peptide synthesizerProtein TechnologiesPS3 Benchtop Peptide Synthesizer
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99%Sigma Aldrich476870-2Gfor MALDI

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025(2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

129

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved