JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هو وصف بروتوكول للتوليف اليدوي من اليغو-بيبتويدس يتبعه تحليل تسلسل الكتلي.

Abstract

بيبتويدس يتم التحكم في تسلسل ليغومرات محاكاة الببتيد تتكون من وحدات جليكاين N-يؤلكل. بين العديد من التطبيقات المحتملة، وقد فكرت بيبتويدس كنوع من تخزين المعلومات الجزيئية. واعتبر تحليل الطيف الكتلي الأسلوب المفضل للتسلسل بيبتويدس. يمكن توليفها بيبتويدس عن طريق الكيمياء المرحلة الصلبة استخدام دورة رد فعل خطوتين مكرر. هنا نقدم طريقة لتجميع يدوياً اليغو-بيبتويدس وتحليل تسلسل بيبتويدس استخدام تقنيات الطيف الكتلي (MS/MS) جنبا إلى جنب. بيبتويد عينة من نونامير تتكون من N-(2-ميثيلوكسيثيل) جليكاين (Nme) و N-(2-فينيليثيل) جليكاين (Npe)، فضلا عن N-(2-أمينو إيثايل) جليكاين (دار الوثائق) في ن-المحطة بالتناوب. صيغة تسلسل بيبتويد Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2، حيث التيار المتردد مجموعة أسيتيل. التوليف يأخذ مكان في سفينة رد فعل المرحلة الصلبة متاحة تجارياً. الراتنج أميد حلبة كدعم قوي تسفر عن بيبتويد مع مجموعة أميد في ج-المحطة. وناتج بيبتويد يخضع لتحليل تسلسل استخدام مطياف شامل ثلاثي-الرباعي بالإضافة إلى مصدر تاين اليكتروسبراي. قياس MS/MS تنتج طائفة أيونات الشظايا الناجمة عن التفكك بيبتويد مشحونة. يتم فرز الأيونات يفتت استناداً إلى قيم نسبة الكتلة بتهمة (m/z). تتم مقارنة القيم m/z من الأيونات جزء ضد الجماهير الأسمى من أيونات يفتت المتوقع نظرياً، وفقا لمخطط تجزئة بيبتويد. التحليل يولد نمط تجزئة من بيبتويد التهمة الموجهة إليه. يرتبط نمط التجزؤ إلى تسلسل مونومر بيبتويد محايدة. وفي هذا الصدد، تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد يقرأ المعلومات التسلسل بيبتويدس.

Introduction

بيبتويدس فئة من التحكم في تسلسل البوليمرات مع هياكل العمود الفقري محاكاة هيكل الببتيدات. يمكن توليفها من الأمينات المتنوعة، التي تمكن بيبتويدس يحمل خصائص الانضباطي الغاية1،2بيبتويدس. استخدمت بيبتويدس كنماذج جزيئية للبحوث الفيزيائية، تعتبر العوامل العلاجية، وصممت يغاندس للبروتينات3،4،،من56. وقد وضعت بيبتويدس في مجموعة متنوعة من المركبات النشيطة بيولوجيا، مثل المواد القاذورات وجسم ميميتيك ومضادات الجراثيم، وإنزيم مثبطات7،،من89. مع طابع مرتبة عالية والانضباطي، بيبتويدس أيضا قد فكرت كنوع من تخزين المعلومات الجزيئية10. اكتشاف هذه تطبيقات متنوعة تدعو إلى تطوير كفاءة أساليب تحليلية لتميز في تسلسل وهيكل بيبتويدس. وقد أظهرت تقنيات tandem الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي الوعد الأسلوب المفضل لتحليل خصائص تسلسل التحكم في تسلسل البوليمرات، بما في ذلك، بيبتويدس11،،من1213 ،من 1415. ومع ذلك، دراسات منهجية ربط أنماط التجزئة أيون بيبتويد الناتجة عن الجماعي دراسات قياس الطيف الكتلي والمعلومات الهيكلية من بيبتويدس محدودة للغاية.

يمكن توليفها بيبتويدس سهولة استخدام أسلوب مرحلة صلبة. طريقة متطورة تنطوي على تكرار الخطوتين مونومر إضافة دورة16،17. في كل دورة، وإضافة هو أسيتيلاتيد أمين راتنج زمنياً واسطة حمض هالواسيتيك (عادة برومو حمض، مؤسسة نقد البحرين)، ويعقب ذلك رد فعل تشرد مع أمين الابتدائي. على الرغم من أن البروتوكولات توليف الآلي قد طبقت بشكل روتيني لتوليف بيبتويد، بيبتويدس يمكن تجميعها يدوياً مع المحاصيل ممتازة في كيمياء قياسية مختبر16،،من1819، 20.

لدينا مختبر قد اعتمدت أسلوب التوليف اليدوي بيبتويد وتبسيط الأجهزة المستخدمة في الأساليب الحالية. وقد درسنا سابقا أنماط التجزئة من سلسلة من بيبتويدس باستخدام MS/MS تقنيات21،،من2223. النتائج التي توصلنا إليها تظهر أن بيبتويدس تنتج التشظيات مميزة عندما تتعرض للتفكك الناجمة عن تصادم (CID)21،23 أو أسر الإلكترون تجارب الانفصال (النماء)22 . في هذه المقالة، نحن تثبت كيف يمكن توليفها اليغو-بيبتويدس في مختبر كيمياء قياسية وكيفية القيام بتجارب CID استخدام مطياف كتلة من ثلاثي-الرباعي، وكيفية تحليل البيانات الطيفية. بيبتويد يتم تصنيعه وتتميز نونامير مع أسيتيليشن الطرفي ن والمحطة الطرفية ج أميديشن، Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. هيكل بيبتويد يرد في الشكل 1.

Protocol

1-تجميع بيبتويد

ملاحظة: يبدأ التوليف مع تفعيل الراتنج بتورم الراتنج وإزالة مجموعة حماية. ويعقب هذا المتنامية في سلسلة بيبتويد على الراتنج من خلال تكرار دورات إضافة مونومر. مونومر الأولى بالإضافة إلى الراتنج هو بقايا ج--المحطة الطرفية. بيبتويد هو ممدود من ج-المحطة إلى N-المحطة. متى تحقق التسلسل بيبتويد المرجوة، الراتنج هو المشقوق قبالة وهو تنقية المنتج بيبتويد.

  1. إعداد الكواشف
    ملاحظة: تقاس السوائل والمواد الكيميائية باستخدام ميكروبيبيتي ويتم قياس المواد الكيميائية الصلبة باستخدام توازن تحليلية.
    1. مزيج 6.2 مل ن، ن '--دييسوبروبيلكاربودييميدي (DIC) ومل 43.8 من N، N-dimethylformamide (DMF) لإعداد م 0.8 للحل DIC/DMF.
    2. حل ز 5.56 مؤسسة نقد البحرين إلى 50.0 مل DMF لإعداد حل م مؤسسة نقد البحرين/DMF 0.8.
    3. خلط 2 مل من بيبيريديني (Pip) و 8 مل من DMF تحقيق الحل Pip/DMF 20%.
    4. حل مل 1.9 من Npe إلى 13.1 مل DMF تحقيق 1.0 م Npe/DMF.
    5. حل مل 1.3 من يتخصص في 13.7 مل DMF تحقيق 1.0 م Nme/DMF.
    6. حل مل 0.32 من دار الوثائق إلى 2 مل DMF تحقيق 1.0 م دار الوثائق/DMF.
      تنبيه: معظم المواد الكيميائية التي تستخدم في التوليف الخطرة. حمض تريفلورواسيتيك (تفا)، DIC، برنامج تطبيق السلام، ومؤسسة نقد البحرين خطرة على الجلد، والعينين والجهاز التنفسي. DMF والميثان (DCM) يشتبه في المواد المسببة للسرطان. يجب أن يتم تنفيذ جميع ردود الفعل في غطاء دخان، وينبغي أن تستخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة. الرجاء التحقق من صحيفة بيانات سلامة المواد (MSDS) لجميع المواد الكيميائية المستخدمة في التجميع.
  2. راتنج التنشيط
    1. قياس بملغ 84 من حلبة أميد الراتنج (راتنج، ملمول 0.047، تحميل 0.56 mmol/g) وإضافته إلى سفينة البوليبروبيلين المرحلة الصلبة رد 10 مل. إدراج المكبس في السفينة.
    2. إضافة 2 مل DMF إلى وعاء التفاعل وكاب السفينة مع غطاء ضغط. مكان السفينة على شاكر، وتحرض السفينة في درجة حرارة الغرفة في زاوية تنقل حوالي 12 درجة وذبذبات 385/دقيقة للحد الأدنى 30 استنزاف الحل إلى حاوية نفايات عن طريق إزالة الغطاء ودفع المكبس وعاء التفاعل.
    3. إضافة 2 مل محلول Pip/DMF 20% للسفينة وكاب السفينة. تحرض عليه على شاكر لمدة 2 دقيقة، واستنزاف الحل إلى حاوية النفايات.
    4. إضافة 2 مل محلول Pip/DMF 20% للسفينة وكاب السفينة، وتحرض عليه في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 12 إزالة الغطاء واستنزاف الحل إلى حاوية النفايات.
    5. أغسل الراتنج بإضافة 1 مل DMF، وضع سقف للسفينة، والتحريض السفينة للحد الأدنى 1 إزالة الغطاء واستنزاف الحل عن طريق دفع المكبس. غسل الراتنج مع DMF لمدة 4 مرات إضافية.
  3. إضافة مونومر و acetylation الطرفي ن
    ملاحظة: كل دورة إضافة مركب ينطوي على خطوات رد فعل اثنين وبرومواسيتيليشن والتشريد.
    1. الاضطلاع بدوره إضافة مونومر الأولى لنموذج الراتنج Nme.
    2. القيام برد فعل برومواسيتيليشن. مزيج من 1 مل من 0.8 م مؤسسة نقد البحرين/DMF الحل و 1 مل من 0.8 م DIC/DMF الحل في كوب. نقل الخليط إلى رد فعل وعاء يحتوي على الراتنج وكاب السفينة. مكان السفينة على شاكر وتحرض عليه في درجة حرارة الغرفة ل 20 دقيقة إزالة الغطاء واستنزاف الحل إلى حاوية النفايات.
    3. أغسل الراتنج بإضافة 1 مل DMF ووضع سقف للسفينة، والتحريض عليه لمدة 1 دقيقة وتجفيف الحل عن طريق دفع المكبس. أغسل الراتنج بإضافة 1 مل DCM والتحريض السفينة لمدة 1 دقيقة وتجفيف الحل. أغسل الراتنج مع DCM مرة أخرى، ومن ثم يغسل مع DMF مرتين.
    4. القيام برد فعل تشرد. أضف 1 مل من 1.0 م Nme/DMF الحل وكاب السفينة، وتحرض السفينة في درجة حرارة الغرفة ل 60 دقيقة إزالة الغطاء واستنزاف الحل عن طريق دفع المكبس.
    5. أغسل الراتنج بإضافة 1 مل DMF والتحريض السفينة لمدة 1 دقيقة وتجفيف الحل عن طريق دفع المكبس. أغسل الراتنج بالرسم في 1 مل DCM، الثائرين لمدة 1 دقيقة، واستنزاف الحل. أغسل DCM مرة أخرى، متبوعاً بالغسيل مع DMF مرتين.
    6. كرر مونومر إضافة دورات من الخطوات 1.3.2 إلى 1.3.5 لتشكيل Nae-(Npe-Nme)4-الراتنج. عند تكرار هذه الخطوة لرد فعل التشرد (1.3.4)، استخدام حل أمين محددة وفقا للتسلسل بيبتويد.
      ملاحظة: سلسلة بيبتويد هو ممدود من ج-المحطة إلى N-المحطة مع بقايا ج-الطرفية منضمة إلى الراتنج.
    7. أداء acetylation الطرفي ن شكل Ac-Nae-(Npe-Nme)4-الراتنج.
    8. ميكس 92 ميليلتر من أنهيدريد الخل، ميليلتر 43.5 N، N-دييسوبروبيليثيلاميني (ديبا) ومل 2 من DMF في كوب جعل حوالي 2 مل أسيتيليشن كوكتيل.
    9. إضافة 2 مل أسيتيليشن كوكتيل بالسفينة التي تتضمن الراتنج وكاب السفينة، وتحرض عليه في درجة حرارة الغرفة لإزالة الحد الأقصى 60 دقيقة واستنزاف الحل عن طريق دفع المكبس.
    10. أغسل الراتنج بإضافة 1 مل DMF والتحريض السفينة لمدة 1 دقيقة وتجفيف الحل عن طريق دفع المكبس. أغسل الراتنج بإضافة 1 مل DCM والتحريض السفينة لمدة 1 دقيقة وتجفيف الحل. تكرار الغسيل الراتنج مع DCM مرة أخرى، ثم يغسل مع DMF أكثر مرتين.
    11. أغسل الراتنج بإضافة 1 مل DCM والتحريض السفينة لمدة 1 دقيقة وتجفيف الحل عن طريق دفع المكبس. تكرار الغسيل مع DCM مرتين. إزالة الغطاء وترك الراتنج أيردري في وعاء التفاعل لمدة 10 دقائق.
  4. الانقسام وتنقية
    1. مزيج 3.8 مل تفا 100 ميليلتر من ترييسوبروبيلسيلاني (نصائح) و 100 ميليلتر من الصف [هبلك] ح2س في كوب جعل 4 مل انقسام وكوكتيل.
    2. إضافة 4 مل من طازجة الانقسام وكوكتيل بالسفينة التي تتضمن الراتنج وكاب السفينة، وتحرض عليه في درجة حرارة الغرفة ح 2.
    3. إزالة الغطاء وجمع الحل فيلتراتي في أنبوب 50 مل البوليبروبيلين أجهزة الطرد مركزي. أضف 1 مل تفا للسفينة وكاب تحرض للحد الأدنى 1 جمع الحل فيلتراتي في أنبوب الطرد المركزي نفسه.
    4. تتبخر تفا التي تهب في تيار غاز النيتروجين بلطف حتى يتم ترك حوالي 1 مل الحل لزج.
    5. إضافة 15 مل أثير ثنائي إثيل حل المتبقية وكاب أنبوب الطرد المركزي، واحتضان أنه في ثلاجة-20 درجة مئوية ل 2 (ح) بين عشية وضحاها. بيبتويد الخام رواسب كبيضاء صلبة.
    6. بيليه الصلبة باستخدام أجهزة الطرد مركزي في 4,427 س ز لأدنى 10 إزالة غطاء أنبوب الطرد المركزي وصب إثيل الاثير في كوب بعناية دون أن تفقد الصلبة.
      تنبيه: إثيل الاثير هو المذيبات عضوية سريعة الاشتعال. الرجاء استخدام أجهزة الطرد مركزي آمنة إثيل أثير.
    7. أغسل أنبوب الصلبة بإضافة 10 مل من المثلج إثيل الاثير إلى أجهزة الطرد المركزي التي تحتوي على الصلبة، وضع سقف للأنبوب، ووضعه في أجهزة الطرد المركزي. تنفيذ الطرد المركزي في 4,427 س ز ل 10 دقيقة إزالة أجهزة الطرد المركزي أنبوب من أجهزة الطرد المركزي وصب إثيل الاثير في كوب بعناية دون أن تفقد الصلبة.
    8. الجافة الصلبة التي تهب بلطف في تيار غاز النيتروجين.
    9. إضافة 10 مل ح [هبلك]-الصف2س إلى حل الصلبة المجففة. تمرير الحل من خلال عامل تصفية حقنه نايلون مع حجم المسام من 0.45 ميكرومتر، وجمع في فيلتراتي في أنبوب الطرد مركزي البوليبروبيلين مرجح قبل 50 مل.
    10. تجميد شل الحل عن طريق وضع أنبوب الطرد المركزي التي تتضمن الحل بيبتويد في 12-أوقية (الاونصة)، مزدوجة مكدسة موسعة البوليستيرين كوب 1/3 مليئة بسائل النيتروجين بالتناوب. ليوفيليزي الحل المجمدة بين عشية وضحاها تؤتي بيبتويد الصلبة.
    11. تكرار ليوفيليزيشن مرة أخرى بتذويب بيبتويد الصلبة إلى 10 مل ح [هبلك]-الصف2س، وشل التجميد في النيتروجين السائل، وليوفيليزينج بين عشية وضحاها. بيبتويد الناجمة عن ذلك محض بما فيه الكفاية لتحليل تسلسل من الطيف الكتلي.

2-مرض التصلب العصبي المتعدد القياسات وتحليل تسلسل

ملاحظة: تجري التجربة MS/MS في مطياف شامل ثلاثي-الرباعي بالإضافة إلى مصدر تاين (ESI) اليكتروسبراي. يتم التحكم في جمع البيانات باستخدام برنامج اقتناء البيانات مصحوبة بالصك. يتضمن الإجراء العام 1) إجراء مسح كامل الطيف الكتلي التجربة وتسجيل الطيف الشامل، 2) أداء سيد MS/MS التجربة وتسجيل الطيف MS/MS، و 3) مقارنة البيانات الطيفية MS/MS مع النظرية وتوقع مخطط تجزئة استناداً إلى سمة هيكلية بيبتويد.

  1. إعداد نموذج الحل
    1. وزن خارج بيبتويد الصلبة 1.0 2.0 ملغم في قنينة زجاج مل 3-5. إضافة المذيب 1 مل مختلطة الاسيتو الانيتريل والمياه (ACN/ح2س، 1:1، v/v) إلى حل في بيبتويد. وهذا يعطي الحل عينة الأسهم مع تركيز من حوالي 10-3 م.
    2. نقل 20 ميليلتر من حل الأسهم في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل وإضافة المذيب 1 مل مختلطة من تزاول/ح2س أن تسفر عن حل نموذج مخفف ل حوالي 10-5 م.
    3. إزالة أي جزيئات غير قابلة للذوبان ممكن في حل عينة مخففة عن طريق إجراء الطرد المركزي في 4,427 س ز لنقل الحد الأدنى 3 ميليلتر حوالي 700 من الجزء العلوي من الحل في آخر 1.5 مل الطرد أنبوب لجعل بيبتويد مرض التصلب العصبي المتعدد حل عملي مع تركيز من حوالي 10-5 م.
    4. ضبط تركيز حل مرض التصلب العصبي المتعدد العامل استناداً إلى كثافة الإشارات الملحوظة خلال قياسات الطيف الكتلي.
    5. هو طريقة بديلة لإزالة أي جزيئات غير قابلة للذوبان الممكنة في حل عينة المخفف لتمرير الحل عينة من خلال عامل تصفية حقنه ميكرومتر 0.20 وجمع في فيلتراتي في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل لجعل بيبتويد مرض التصلب العصبي المتعدد حل عملي لحوالي 10-5 م.
  2. تسجيل الأطياف الشامل
    1. تشغيل المذيبات المختلطة لتزاول/ح2س (1:1، v/v) من خلال مصدر التأين (ESI) اليكتروسبراي وإعداد الصك في أيون إيجابية قياسية، مسح كامل الطيف الكتلي الوضع مع مجموعة الكتلة إلى تهمة نسبة (m/z) من 100-1500.
      ملاحظة:
      معلمات التشغيل النموذجية:
      ESI إبرة الجهد، 5 كيلو فولت
      الشعرية الجهد، 40 ت
      تجفيف درجة حرارة الغاز (غاز النيتروجين)، 200 درجة مئوية.
    2. إضافة حوالي 300 ميليلتر لحل عملي بيبتويد مرض التصلب العصبي المتعدد (حوالي 10-5 م) إلى 500 ميليلتر أو حقنه 1 مل والاتصال حقنه إلى مدخل ESI استخدام إيثر الشعرية البروم ثنائي الفينيل كيتون (نظرة خاطفة) الأنابيب. وضع المحقن على مضخة الحقن وتعيين معدل التدفق في 10 ميليلتر/دقيقة لبث الحل عينة إلى مدخل ESI.
    3. تشغيل الجهد إبرة دليل الاستدامة الاقتصادية لتنشيط عملية دليل الاستدامة الاقتصادية، وقم بتشغيل الجهاز. تعيين العرض في وضع الشخصية ونطاق m/z من 100-1500. عرض ملف تعريف طيف شامل سيظهر في نافذة الشخصية. الذروة في m/z 1,265 (عرض ك m/z 1,264.6) يناظر بيبتويد أيون أو البروتونية بيبتويد.
    4. سجل MS الطيف لمدة 2 دقيقة. في "إطار الأسلوب"، استخدم 2 دقيقة ك "وقت التشغيل". فتح نافذة التسجيل وتعبئة في اسم ملف الصحيح، والبدء في تسجيل الطيف.
      ملاحظة: يظهر الطيف الشامل الناتج عن ذلك في الشكل 3.
    5. تحسين كثافة الذروة في m/z 1,265. تعيين نطاق m/z إلى 1,150-1,350 وضبط الجهد الشعرية أثناء عرض كثافة الذروة في mV سيظهر في نافذة الشخصية. على سبيل المثال، زيادة الجهد الشعرية إلى 50 الخامس أو أعلى وعرض تغيير كثافة الذروة. كثافة الذروة الأمثل حوالي 150-200 أم.
      ملاحظة: ضبط الجهد الشعرية يمكن أن تغير بشكل كبير وفرة أيونات معينة. زيادة الجهد الشعرية قد تعزز كثافة أيون بيبتويد. غير أن جهد العالي شعرية قد أيضا الحث على الانفصال أيون بيبتويد في مصدر أيون وإنقاص كثافة المشاهدة. ضبط درجة حرارة تجفيف الغاز قد تعزز كثافة الذروة في m/z 1,265، إلا أنها أقل فعالية من ضبط الجهد الشعرية. إذا كان لا يصل إلى الذروة في m/z 1,265 كثافة الأمثل، ضبط تركيز العينة (أو المثال، ضعف تركيز الحل العامل MS).
    6. التبديل الأداة لوضع MS/MS. تعيين أيون السلائف في m/z 1,265 وكتلة MS/MS النطاق في m/z 100-1400. في "إطار الأسلوب"، استخدام m/z 1,265 ككتلة Q1 "الأولى" وترك "كتلة الأخير Q1" فارغة. استخدام m/z 100 "Q3 أول قداس" و m/z 1,400 ك Q3 "ماساشوستس آخر"
      ملاحظة: في وضع MS/MS، ومهام وحدة (Q1) الرباعي الأول كعامل تصفية جماعية لعزل أيون بيبتويد كأيون السلائف، وحدة الرباعي الثانية (Q2) هو خلية اصطدام، ومهام وحدة (Q3) الرباعي الثالث كما هو محلل شامل.
    7. مجموعة الضغط الطاقة الاصطدام في 40 eV والغاز الاصطدام (الأرجون، في هذه الحالة) في متورر 1.5.
    8. عرض ملف تعريف طيف جماعية المعروض في نافذة الشخصية. الذروة في m/z 1,265 يتوافق مع أيون بيبتويد، وعلى قمم مع انخفاض قيم m/z تمثل الأجزاء من أيون بيبتويد.
    9. ضبط الطاقة الاصطدام لتحسين عرض الطيف التجزؤ. على سبيل المثال، زيادة طاقة الاصطدام إلى 45 eV وعرض تغيير التشكيل الجانبي الطيف.
      ملاحظة: زيادة طاقة الاصطدام سيعزز وفرة الأيونات جزء بشكل عام، والحد من وفرة أيون بيبتويد. زيادة ضغط الغاز الاصطدام ستعزز أيضا وفرة الأيونات جزء.
      تنبيه: عدم زيادة ضغط الغاز الاصطدام خارج متور 2.
    10. سجل الطيف MS/MS لمدة 2 دقيقة. في "إطار الأسلوب"، استخدم 2 دقيقة ك "وقت التشغيل". فتح نافذة التسجيل وتعبئة في اسم ملف الصحيح، والبدء في تسجيل الطيف.
    11. تكرار تسجيل مرات 1-2.
  3. تحليل تسلسل بيبتويد
    ملاحظة: بشرط CID، أيون بيبتويد أن تجزئ في السندات أميد على طول العمود الفقري بيبتويد لإنتاج سلسلة من الشظايا الطرفي ن يسمى ب-الأيونات، وسلسلة من الشظايا ج-محطة تسمى أيونات Y
    1. رسم هيكل الكيميائية بيبتويد أسيتيلاتيد بوضع N-المحطة على الجانب الأيسر وج-المحطة على الجانب الأيمن، ورسم خط متقطع في كل السندات أميد لتوليد مخطط تجزئة كما هو مبين في الشكل 2 ألف. بروتون مع دائرة متقطع للإشارة إلى الناقل مقابل رسم. بدءاً من الجانب الأيسر من الهيكل، وضع التسميات على خطوط متقطعة للإشارة إلى الأجزاء الطرفية ن كب1، ب2، ب8. بدءاً من الجانب الأيمن، وضع التسميات على خطوط متقطعة للإشارة إلى الأجزاء الطرفية ج ص1، ص2، ص8.
      ملاحظة: يمكن أن تستخدم برامج رسم كيميائية رسم هيكل بيبتويد.
    2. تخيل التجزؤ في السند أميدال 4 من الجانب الأيسر، ورسم هياكل الجزء الطرفي ن والجزء جيم--المحطة الطرفية مع اتهامات رسمية السليم، كما هو مبين في الشكل 2. ضع تسمية ب4 في الجزء الطرفي ن، ووضع التسمية ص5 على الجزء جيم--المحطة الطرفية. حساب قيمة m/z ب4 بتلخيصه للجماهير الأسمى من العناصر في بنية تسفر عن قيمة 580، ووضع m/z 580 على الجزء الطرفي ن. حساب قيمة Y5 m/z ووضع m/z 685 على الجزء جيم--المحطة الطرفية.
    3. حساب القيم m/z لجميع الأيونات ب ثمانية وكل ثمانية أيونات Y، وتجميعها في جدول بيانات، كما هو مبين في الجدول 1.
      ملاحظة: يمكن حساب قيم m/z الأجزاء باستخدام مادة كيميائية الرسم البرمجيات.
    4. افتح مسجل طيف MS/MS بيبتويد استخدام برنامج استعراض البيانات مصحوبة بالصك. تعيين تفضيلات التسمية إلى "إظهار تسميات أيون" وتسمية عتبة 3 في المائة. يقوم هذا بإنشاء طائفة MS/MS مع قيم m/z المسمى على القمم.
    5. تصدير MS/MS البيانات الطيفية كملف نصي CSV في تنسيق وإعادة إعمار الطيف باستخدام برامج معالجة البيانات. ضع قيم m/z على القمم. ويرد في الشكل 4الطيف MS/MS الناتجة.
      ملاحظة: بعض مطيافات أسلحة مجهزة ببرامج معالجة البيانات قادرة على توليد الطيف MS/MS. وفي هذه الحالة، تصدير البيانات الطيفية MS/MS ليس ضروريا.
    6. قم بتعيين قيم m/z على الطيف MS/MS لتلك المبينة في الجدول 1 لتحديد المقابلة ب-و Y-الأيونات. على سبيل المثال، تعتبر الذروة في m/z 580 ب4-أيون و m/z 685 يتم تعريفه ك ذ5-أيون. قم بتسمية القمم مع رموز ب وص المناظرة في الطيف، كما هو مبين في الشكل 4.

النتائج

ويرد هيكل بيبتويد 9-مير مع acetylation الطرفي ن، Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2، في الشكل 1. بيبتويد تم تصنيعه يدوياً في سفينة فريتيد رد فعل البولي بروبلين عبر نهج المرحلة الصلبة. حلبة أميد الراتنج (0.047 ملمول, 84 ملغ مع تحميل 0.56 mmol/ز) كدعم متين تؤتي بيبتويد مع أميداتيد ج-ال...

Discussion

وقد تم تصنيعه بيبتويد نونامير، Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2، استخدام بروتوكول قدم. جهاز التوليف، ينطوي على سفينة مثل المحاقن البوليبروبيلين الصلبة-مرحلة رد فعل وشاكر ميكانيكية. أوعية التفاعل المتاحة تجارياً ومنخفضة التكلفة. شاكر ميكانيكية جهاز مشترك في مختبر الكيمياء. باستخدام سفينة رد فعل ?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

الكتاب أود أن أشكر السيد مايكل كونولي والدكتور رونالد تسوكرمان (مسبك الجزيئية، مختبر لورنس بيركلي الوطني) لدعم تقنية في توليف بيبتويد. ونعترف الدعم من "المؤسسة الوطنية للعلوم" (تشي-1301505). جميع الكتلي تجارب أجريت في "منشأة قياس الطيف الكتلي الجماهيري الكيمياء" في جامعة المحيط الهادئ.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320LAgilent Technologies Inc.The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.
Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review softwareVarian Inc.The software is a part of the Varian 320L package
Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DDFisher Scientific International Inc.14-400-126
Hermle Centrifuge, Model Z 206 AHermle Labortechnik GmbH
Solid phase reaction vessel, 10 mLTorviqSF-1000
Pressure caps for reaction vesselsTorviqPC-SF
Syringe filters, pore size 0.2 μmFisher Scientific Inc.03-391-3B
Syringe filters, pore size 0.45 μmFisher Scientific Inc.03-391-3A
Polypropylene centrifuge tuges, 50 mLVWR International, LLC.490001-626
Polypropylene centrifuge tuges, 15 mLVWR International, LLC.490001-620
ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0CambridgeSoft CorporationCambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.
Styrofoam cup, 12 OzCommon Supermarket
Rink amide resinChem-Impex International, Inc.10619
PiperidineChem-Impex International, Inc.02351Highly toxic
N, N’-diisopropylcarbodiimideChem-Impex International, Inc.00110Highly toxic
Bromoacetic acidChem-Impex International, Inc.26843Highly toxic
2-PhenylethylamineVWR International, LLC.EM8.07334.0250
2-MethyoxyethylamineSigma-Aldrich Co. LLC.241067
N-Boc-ethylenediamineVWR International, LLC.AAAL19947-06
Acetic anhydrideSigma-Aldrich Co. LLC.252845
N, N-dimethylformamideVWR International, LLC.BDH1117-4LGFurther distillation before use
N, N-diisopropylethylamineChem-Impex International, Inc.00141
TriisopropylsilaneChem-Impex International, Inc.01966
Trifluoroacetic acidChem-Impex International, Inc.00289Highly toxic
Millipore MILLI-Q Academic Water Purification SystemMillipore CorporationZMQP60001For generating HPLC grade water
HPLC-grade WaterProduced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System
MethanolPharmco-Aaper339USP/NFHPLC grade
AcetonitrileFisher Scientific International, Inc.A998-4HPLC grade
Diethyl etherVWR International, LLC.BDH1121-19LFurther distillation before use
DichloromethaneVWR International, LLC.BDH1113-19LFurther distillation before use
Nitrogen gasFresno Oxygen/Barnes SupplyNIT 50-C-FUltra high purity, 99.9995%
Argon gasFresno Oxygen/Barnes SupplyARG 50-C-FUltra high purity, 99.9995%

References

  1. Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
  2. Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
  3. Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  4. Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
  5. Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
  6. Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
  7. Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
  8. Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
  9. Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
  10. Lutz, J. -. F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), 628 (2013).
  11. Altuntas, E., Schubert, U. S. "Polymeromics": Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
  12. Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
  13. Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
  14. Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
  15. Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
  16. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
  17. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
  18. Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
  19. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
  20. Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
  21. Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
  22. Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
  23. Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132 Y

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved