JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وأعربنا عن اكتوبيكالي NR1 وحدة فرعية من مستقبلات NMDA يوصف مستضد للكشف عن الأجسام المضادة ضد مستقبلات NMDA في الدم لدى المرضى الذين يشتبه بالتهاب الدماغ الذاتية مع البروتينات الفلورية الخضراء في الخلايا الجنينية البشرية (HEK293). قد يكون هذا الأسلوب بسيطة مناسبة لأغراض في إعدادات السريرية الفرز.

Abstract

يمكن أن يسبب وجود الأجسام المضادة-نمدا مستقبلات مختلفة من الأعراض النفسية العصبية في المرضى المتضررين، ويسمى نمدا المضادة مستقبلات الدماغ المناعة الذاتية. من الضروري الكشف عن الأجسام محددة ضد مستقبلات NMDA في الدم أو السائل الدماغي النخاعي (CSF) لتشخيص دقيق لهذا الشرط. مستقبلات NMDA هو أيون قناة بروتين معقد يحتوي على أربعة الوحدات الفرعية، بما في ذلك اثنان إلزامية نمدا مستقبلات فرعية 1 (NR1) وواحد أو اثنين من مستقبلات NMDA 2A وحدة فرعية (NR2A)، نمدا مستقبلات 2B وحدة فرعية (NR2B)، وحدة فرعية مستقبلات NMDA ج 2 (NR2C)، أو مستقبلات NMDA وحدة فرعية 2D (NR2D). وذكر حانمه الأجسام المضادة-نمدا مستقبلات يكون حاضرا في المجال الطرفي ن خارج الخلية فرعية NR1 من مستقبلات NMDA. والهدف من هذه الدراسة هو القيام مقايسة الفلورة بسيط يستند إلى الخلية التي يمكن استخدامها كاختبار فحص للكشف عن وجود الأجسام المضادة ضد NR1 وحدة فرعية من مستقبلات NMDA في الدم لتيسير البحوث السريرية والأساسية من مكافحة نمدا مستقبلات الذاتية التهاب الدماغ.

Introduction

نمدا المضادة مستقبلات الدماغ المناعة الذاتية هي كيان مرض حديثا المعترف بها التي يمكن أن تحدث في المرضى الذين يعانون من جميع الإعمار، ويؤثر على المرضى الذين يغلب عليها العنصر النسائي1،2. أنها واحدة من التهاب الدماغ تم تشخيصها على أنها الأكثر شيوعاً بين المرضى الذين يعانون من المسببات الأولية غير معروف لالتهاب الدماغ3. المرضى المصابين بالتهاب الدماغ مستقبلات NMDA مكافحة عادة ما يكون الأعراض الأولى من الصداع أو الحمى، متبوعاً بالتطور السريع لتغير مستوى الوعي ومجموعة متنوعة من الأعراض النفسية العصبية الحادة، بما في ذلك التحريض، التهيج ، القلق والأرق والهلوسة، والأوهام، العدوان، السلوكيات الغريبة، شذوذ الحركة، التقلبات اللاإرادي والاستيلاء على الهجمات4،5. الاعتراف المبكر بهذا الشرط والمعالجة في الوقت المناسب مع العلاج المناعي مهمان لنتائج أفضل والشفاء التام حتى في المرضى المتضررين6. ومن ثم، اقترح أنه ينبغي مكافحة نمدا مستقبلات الدماغ الذاتية كإجراء تشخيص تفاضلية هامة من المرضى تقديم مع سمات ذهانية حادة أو بداية جديدة7،8.

بالإضافة إلى السمات السريرية، الكشف عن الأجسام ضد مستقبلات NMDA في الدم أو السائل الدماغي النخاعي ضروري لتشخيص دقيق لمكافحة نمدا مستقبلات الدماغ الذاتية9. تتوفر معظم اختبارات مناعية للكشف عن الأجسام مستقبلات NMDA المضادة في مختبرات أبحاث قليلة10،11، وهناك المقايسة الفلورة المتاحة تجارياً على أساس خلية واحدة فقط للفحص مكافحة نمدا مستقبلات الأجسام المضادة12. والهدف من هذه الدراسة هو القيام مقايسة بسيطة الفلورة داخلية يستند إلى الخلية التي يمكن استخدامها مريح في المختبر لفحص وجود الأجسام المضادة مستقبلات نمدا المضادة لتيسير البحوث السريرية من مستقبلات NMDA مكافحة التهاب الدماغ المناعة الذاتية. مستقبلات NMDA هيتيروتيترامير أيون قناة بروتين معقدة وأعرب على وجه التحديد في الدماغ. أنه يتكون من وحدتين فرعيتين NR1 الإجباري، والمزيج من مفارز واحد أو اثنين من NR2A، NR2B، NR2C، أو NR2D13. دراسة سابقة أفادت أن حانمه الرئيسية المستهدفة بالأجسام المضادة في المجال الطرفي ن خارج الخلية ل وحدة فرعية NR15. ومن ثم، في هذا البروتوكول، نعرب عن البروتين NR1-وحدة فرعية الماشوب البشري من مستقبلات NMDA معلم مع البروتين الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في السطر الخلايا الظهارية الكلي الجنينية البشرية (HEK293)، ووضع مقايسة الفلورة يستند إلى الخلية للكشف عن الفئة مفتش من الأجسام المضادة مستقبلات NMDA المضادة في الدم.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة "المؤسسية استعراض المجلس تشانغ الأمنيون التذكاري مستشفى" لينكو، تاويوان، تايوان (102-2577A3).

1-إعداد بلازميد التعبير NR1-بروتينات فلورية خضراء

  1. إلى أسفل والطرد المركزي الأنبوبة، بيبيت الخليط برفق حتى نغ 10 مزيج من بلازميد NR1-التجارة والنقل مع 100 ميليلتر من سلالة الخلايا المختصة الإشريكيّة القولونية DH5α في معقم 1.5 مل 4-6 مرات، واحتضان الأنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  2. احتضان الأنبوب في 42 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة في حمام مائي وإزالة الأنبوب من حوض ماء وإضافة 1 مل ليسوجيني مرق (رطل) المتوسطة في الأنبوب واحتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع الهز ح 1.
  3. نشر 50 ميليلتر من الخليط على صفيحة أجار رطل تتضمن الأمبيسلّين (0.1 مغ/مل)، واحتضان لوحة أجار رطل في 37 درجة مئوية في حاضنة بين عشية وضحاها.
  4. اختيار مستعمرة واحدة من لوحة أجار رطل استخدام تلميح عقيمة بين عشية وضحاها، ودوامه التلميح في في أنبوب ثقافة بكتيرية التي تحتوي على 5 مل من المتوسطة رطل والامبيسلين (0.1 مغ/مل). احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية في حاضنة بالمصافحة بين عشية وضحاها.
  5. الكوة 3 مل من ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها إلى قارورة 500 مل تحتوي على 250 مل العقيمة رطل المتوسطة والامبيسلين (0.1 مغ/مل). احتضان قارورة على 37 درجة مئوية مع الهز. التحقق بشكل منتظم الكثافة البصرية (OD) ثقافة البكتيرية في الطول الموجي 600 نانومتر باستخدام مطياف حتى تصل OD600 إلى 0.6-1.0.
    ملاحظة: مزيج جيد 800 ميليلتر من ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها مع 200 ميليلتر والغليسيرول إلى إعداد المخزون والغليسيرول وتخزين المخزون والغليسيرول تحت-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  6. إعداد NR1-بروتينات فلورية خضراء التعبير بلازميد من ثقافة البكتيرية 250 مل
    1. جمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 6,000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    2. ريسوسبيند بيليه البكتيريا في 10 مل استثارة مخزن يحتوي على رناسي أ؛ دوامة دقيق حتى ينظر إلى لا أجمة.
    3. إضافة 10 مل تحلل المخزن المؤقت إلى تعليق البكتيرية ولطف عكس الخليط 4-6 مرات، واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
    4. إضافة 10 مل هطول الأمطار المثلجة قبل المخزن المؤقت إلى ليساتي، برفق عكس الخليط 4-6 مرات.
    5. صب في البرميل خرطوشة تصفية مع عملية النداءات الموحدة؛ انتظر لمدة 10 دقائق في الرايت
    6. انزع الغطاء من فوهة مأخذ خرطوشة والمكبس بإدراج الخرطوشة، واضغط برفق المكبس. جمع المصفاة في أنبوب 50 مل.
    7. إضافة 2.5 مل ملكية المخزن المؤقت من الشركة المصنعة للمصفاة ليستي ومزج الخليط بعكس الأنبوب حوالي 10 مرات، واحتضان المخلوط على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    8. تطبيق الخليط ليستي التي تمت تصفيتها إلى عمود عامل تصفية الذي كان قبل متوازن مع المخزن المؤقت للموازنة 10 مل. يسمح العمود إلى استنزاف بالجاذبية.
    9. أغسل العمود مع المخزن المؤقت للغسيل 30 مل مرتين، ثم الوت الحمض النووي من العمود باستخدام 15 مل شطف المخزن المؤقت.
    10. إضافة الايزوبروبانول مل 10.5 (0.7 وحدات التخزين) إلى المخزن المؤقت الحمض النووي التيد ومزيج جيد والطرد المركزي المخلوط في 20,000 ز س لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    11. صب المادة طافية بعناية، وتغسل بيليه الحمض النووي مع الإيثانول 70% خالية من الذيفان 5 مل مرة واحدة، والطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 10 دقائق.
    12. صب المادة طافية وجاف بيليه لمدة 5-10 دقيقة في غطاء كيميائية وحل بيليه في 300-500 ميليلتر من المخزن المؤقت خالية من الذيفان.
    13. تحديد تركيز بلازميد عن طريق قياس امتصاص الحل في "الأشعة فوق البنفسجية" 260/280 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: تعد التعبير بلازميد التجارة والنقل باستخدام البروتوكول نفسه.

2-تعداء الخلايا HEK293 مع NR1-بروتينات فلورية خضراء التعبير بلازميد

  1. ميليلتر 200 الكوة حل الجيلاتين 2% لكل من لوحة الثقافة 48-جيدا واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  2. نضح الحل الجيلاتين من الخلايا 5 × 104 HEK293 جيدا، والبذور في 200 ميليلتر من مستنبت الخلية التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد المتوفرة مع 5% CO2 بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: أحصى الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
  3. في اليوم التالي، استبدال المتوسطة ثقافة المستهلك مع 200 ميليلتر من مستنبت الطازجة التي تحتوي على 10% FBS كل بئر.
  4. لكل واحد الاستعداد جيدا، الحل بواسطة خلط 100 نانوغرام بلازميد NR1-تجفب مع 20 ميليلتر الثقافة المتوسطة، وحل ب بخلط الكاشف تعداء ميليلتر 0.8 مع 20 ميليلتر الثقافة المتوسطة. مضاعفة عدد الآبار اللازمة لإعداد الحجم الإجمالي لكل تجربة.
  5. إعداد الحل ج بخلط حل أ وحل ب، واحتضان المخلوط في RT لمدة 20-30 دقيقة.
  6. الكوة ميليلتر 40 حل ج لكل الخلايا HEK293، وتتضمن أيضا دوامة اللوحة بلطف، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد المتوفرة مع 5% CO2 بين عشية وضحاها.
  7. تحقق من التعبير عن البروتين المؤتلف NR1-التجارة والنقل في الخلايا المضيفة تحت مجهر فلوري مع 40 X-200 X التكبير (الإثارة/الانبعاثات: 482/502 شمال البحر الأبيض المتوسط)، والمضي قدما للمقايسة الفلورة يستند إلى الخلية.
    ملاحظة: ترانسفيكت التعبير بلازميد التجارة والنقل إلى الخلايا HEK293 باستخدام البروتوكول نفسه.

3-يستند إلى الخلية الفلورة الإنزيم

  1. نضح المتوسطة المستهلك من الآبار، ثم أغسل كل بئر مع 200 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثلاث مرات.
  2. إضافة 200 ميليلتر من محلول بارافورمالدهيد 4% لكل بئر؛ احتضان اللوحة على RT لمدة 15 دقيقة.
  3. نضح الحل بارافورمالدهيد من الآبار، وتغسل كل جيدا مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
  4. إضافة 200 ميليلتر من اللبن المقشود 10% في ببست (0.1% 20 توين في برنامج تلفزيوني) الحل لكل خير، واحتضان اللوحة على RT ح 1 مع الهز لطيف.
  5. نضح اللبن المقشود 10% في الحل ببست من البئر، ثم غسل الآبار مع 200 ميليلتر ببست مرة واحدة.
  6. احتضان الآبار مع البلازما المخفف (1: 100 في ببست) كجسم الأولية مع الهز لطيف على RT ح 1.
    ملاحظة: يتم الحصول على البلازما من الدم من المرضى الذين يشتبه في أن يكون التهاب الدماغ المناعة الذاتية.
  7. نضح البلازما المخفف من الآبار، وتغسل كل جيدا مع 200 ميليلتر من ببست ثلاث مرات.
  8. إضافة 200 ميليلتر من الماعز الإنسان المضادة مفتش مترافق مع أليكسا 594 فلور (1:1، 000 تمييع في ببست) لكل بئر، واحتضان لوحة الثقافة في الرايت مع الهز لطيف ح 1.
  9. نضح الإنسان المضادة الماعز مفتش مترافق مع الحل أليكسا فلور 594، وتغسل كل جيدا مع 200 ميليلتر من ببست ثلاث مرات.
  10. إضافة 100 ميليلتر والغليسيرول الحل (والغليسيرول 50% في برنامج تلفزيوني و 1: 100.000 من 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)) لكل بئر.
  11. مراقبة والصورة الخلايا تحت مجهر فلوري استخدام 10 × العدسة، و 4 X و 10 X 20 X أهداف.
    ملاحظة: استخدام عامل التصفية الصحيح لكل صبغ: للتجارة والنقل NR1 (الإثارة/الانبعاثات = 482/502 شمال البحر الأبيض المتوسط)، عن أليكسا فلور 594 (الإثارة/الانبعاثات = 561/594 nm)، ل DAPI (الإثارة/الانبعاثات = 358/461 nm). سلوك عنصر التحكم السلبي باستخدام الخلايا HEK معربا عن التجارة والنقل بنفس الطريقة.

النتائج

وفي المتوسط، يمكن أن نحصل على 200-300 ميكروغرام خالية من الذيفان التعبير بلازميد NR1-التجارة والنقل والتجارة والنقل من ثقافة البكتيرية 250 مل اتباع الإجراءات المذكورة في المادة 1 من البروتوكول. استخدمت مبلغ 100 نانوغرام/بئر بلازميد التعبير تعداء الخلايا HEK293 المستزرعة في لوحة 48-...

Discussion

وهناك عدة فحوصات مناعية يستند إلى الخلية لفحص وجود الأجسام المضادة ضد مستقبلات NMDA التي ذكرت في الأدب، بما في ذلك الفلورة يستند إلى الخلية الحية المقايسة11، ثابت يستند إلى الخلية الفلورة الإنزيم9 ، والتدفق الخلوي على أساس الاعتداء14. ينبغي إجراء المقا?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل "المؤسسة الطبية الأمنيون تشانغ" (رقم المنحة CMRPG3C1771، CMRPG3C1772، CMRPG3E0631، CMRPG3E0632، و CMRPG3E0633).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1Origene (Rockville, MD, USA)RG219368NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences
pCMV6-AC-GFPOrigene (Rockville, MD, USA)PS100010mammalian vector with C-terminal tGFP tag
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen (Hilden Germany)12362
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)11668-019
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher31985-070
DMEM, High Glucose, PyruvateThermo Fisher11995-065
Characterized Fetal Bovine Serum, US OriginGE Healthcare Life SciencesSH30071.01
Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugateThermo FisherA-11014
Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA)Euroimmun AG, Lübeck, GermanyCA 112d-0101
Euroimmun Assay Kit

References

  1. Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
  2. Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
  3. Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
  4. Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
  5. Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
  6. Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
  7. Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
  8. Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
  9. Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
  10. Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
  11. Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
  12. Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
  13. Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
  14. Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
  15. Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
  16. Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
  17. Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131 NR1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved