JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

التوزيع غير متجانسة من الخلايا إيجابية HER2 يمكن ملاحظتها في مجموعة فرعية سرطانات الثدي ويولد المعضلات السريرية. وهنا، نقدم بروتوكول موثوق بها وفعالة من حيث التكلفة لتحديد وقياس ومقارنة HER2 الورم داخل التغاير الوراثي في سلسلة كبيرة من سرطان الثدي بين المجهزة.

Abstract

العلاجات الموجهة ضد مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2 (HER2) قد تغيرت تغيرا جذريا النتيجة للمرضى الذين يعانون من سرطان الثدي إيجابية HER2. ومع ذلك، يعرض أقلية حالات توزيعاً غير متجانسة من الخلايا إيجابية HER2، الذي يولد التحديات السريرية الكبرى. وحتى الآن، وقد اقترحت لا بروتوكولات موحدة وموثوقة للتوصيف والتحديد الكمي ل HER2 التضخيم الجيني غير متجانسة في أفواج كبيرة. وهنا، نقدم منهجية الفائق لتقييم حالة HER2 في وقت واحد عبر مختلف المناطق الطبوغرافية من سرطانات الثدي متعددة. على وجه الخصوص، نحن لتوضيح الإجراءات المختبرية لبناء الأنسجة معزز [ميكروارس] (طرفية) تتضمن تعيين مستهدفة من الأورام. لقد تم تحسين كافة معلمات الجمعية التونسية للأمهات على وجه التحديد للفضة في الموقع التهجين (سيش) الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) أنسجة الثدي. يجب إجراء تحليل المناعي المؤشرات الحيوية التنبؤية وتنبؤاتها (أي، ER، العلاقات العامة، Ki67 و HER2) باستخدام إجراءات التشغيل الآلي. تم تنفيذ بروتوكول سايش مخصصة للسماح بتحليل الجزيئات عالية الجودة عبر الأنسجة المتعددة التي خضعت لإجراءات التثبيت وتجهيز وتخزين مختلفة. في هذه الدراسة، ونحن نقدم دليلاً لمبدأ أن تسلسل الحمض النووي معين يمكن أن يكون سرطان الثدي بين المجهزة ومترجمة في نفس الوقت في مناطق طبوغرافية متميزة متعددة باستخدام وسيلة كفؤة وفعالة من حيث التكلفة.

Introduction

HER2 هو بروتوونكوجيني أوفيريكسبريسيد وتضخيمه في 15-30 ٪ من سرطانات الثدي الغازية كل1،2. HER2 overexpression يتم الاستدلال بالوجود > الخلايا 10% بغشاء قوي المناعي (المدينة) تلوين (3 +)، بينما يمكن تقييم التضخيم الجيني عند نسبة HER2/السنترومير لا إيه تو أو عدد نسخ الجينات هو إيه سيكس، في فرز الأصوات في خلايا أقل 20 في الموقع التهجين (العش)3.

التغاير الوراثي داخل ورم وصفت على نطاق واسع في سرطان الثدي، كونه من مساهمين ضارة المحتملة لتقييم المؤشرات الحيوية وعلاجات الاستجابة4. وفقا لكلية الأطباء الأمريكية (CAP) تغاير HER2 موجود إذا كان يتم تضخيمه HER2 في > 5% و < % 50 من التسلل إلى ورم الخلايا5. ومن المؤسف أن الإصابة الفعلية بالتغاير HER2 المكانية في سرطان الثدي يبقى موضع جدل بين علماء ومع بعض المؤلفين الحفاظ على أن حدث نادر جداً والبعض الآخر مما يوحي بأن تصل إلى 40% من الحالات HER2 متغايرة1،5،،من67،،من89،10. وعلى الرغم من الآليات البيولوجية التي يرتكز عليها هذا الشرط لا بعد بالكامل تتضح، آثار الورم داخل HER2 التغايرية السريرية وتنبؤاتها حاسمة بالنسبة ل مرضى سرطان الثدي11.

في الآونة الأخيرة، ظهرت التقنيات الجزيئية مشرق الحقل، مثل ايش اللونية (CISH) والعش الفضي (سيش)، كوسائل موثوق بها للكشف عن تغاير HER2 في الأنسجة FFPE، مع بعض المزايا مقارنة الفلورية العش (الأسماك)12. وللأسف، لا يزال تحليل الجزء الأكبر من حالات فردية غير عملي في دراسات بحثية كبيرة الأتراب. وقد اقترح العديد من المجموعات أن مزيج هيستوتشيميستري، المدينة، والعش مع التكنولوجيات الجمعية التونسية للأمهات يمكن أن تمثل استراتيجية قيمة في دراسة سرطان علم الأحياء13،14،،من1516. مع هذا الأسلوب معتمداً على نطاق واسع، وعينات الأنسجة من مختلف المرضى يمكن تحليلها في الوقت ذاته، تقليل الأنسجة والكواشف المستخدمة، ومما يعزز تحليل موحد لمجموعة كبيرة من الحالات14. ومع ذلك، لا يوجد أية بروتوكولات متاحة متزامنة الفائق الجزيئية توصيف عينات الأنسجة المتعددة التي خضعت للتجهيز من حيث الكواشف وأوقات التثبيت، وأساليب الحفظ العاملون بهذه المحفوظات كما مختلفة كتل.

النظر إلى الآثار السريرية وتنبؤاتها للتباين المكاني HER2 في سرطان الثدي، قمنا بتطوير منصة جزيئية متكاملة لتقييم ذلك في سلسلة كبيرة من الحالات تقوم المجهزة. هنا، نحن تصور استراتيجيات معمل لتوليد وتحليل التباين داخل ورم التضخيم HER2 في طرفية عالية الغلة من سرطان الثدي عن طريق سايش. تم وضع بروتوكول التالية للأورام قياس > 5 ملم (> pT1b وفقا لعام 2017 تنم)17. لآفات أصغر، نوصي بإجراء التحليل على مقاطع المسلسل قلق. لدينا إجراء يسمح لتحليل المدينة وسيش المتزامن لسرطان الثدي يصل إلى 30، يشمل متوسط 6 مجالات متميزة (مجموعة 4-8) لكل حالة على حدة. بالإجمال، سيتم إنشاء 180 النوى الأنسجة من 1 مم في القطر، مع 500 ميكرومتر بين النوى، ومم 2 بين الشبكة والحواف لكل كتلة الجمعية التونسية للأمهات.

Protocol

وأقر هذه الدراسة "مجالس المراجعة المؤسسية" من "كاليفورنيا إيرككس" ' مؤسسة غراندا، مستشفى Policlinico، ميلانو، إيطاليا.

1-اختيار المرضى وعينات الأنسجة

  1. استرداد الشرائح المحفوظات لجميع الحالات تحليلها، بما في ذلك جميع الهيماتوكسيلين المتاحة وويوزين (H & E) والشرائح المدينة من التشخيص الأصلي، وإذا كان حاضرا، ح واحد & ه لمطابقة لانسجة الثدي غير الورمية (مثلاً، الهامش الجراحية) .
  2. إجراء عمليات استعراض الحالة.
    ملاحظة: للقيام بهذه المهمة، ينبغي مناقشة الشرائح التشخيص وحل الخلافات تضامنية الباثولوجيا اثنين على الأقل مع خبرة في أمراض الثدي. استخدام مجهر تقليدية أو أدوات هذا (لصالح هذا الأخير في الدراسات مولتيسينتريك). إذا كان هناك أي استبعاد جميع الحالات المتنافرة.
    1. إجراء إعادة التصنيف النسيجي لجميع الحالات وفقا لأحدث طبعة من تصنيف منظمة الصحة العالمية (WHO) لاورام الثدي18.
    2. ضمان أن أنسجة طبيعية لكل حالة، إذا كانت موجودة في العينات السريرية المحفوظات، تضم واحداً على الأقل وحدة الأقنية مفصص المحطة الطرفية غير الورمية.
    3. تحديد جميع المناطق الورمية التي تظهر غير متجانسة الخلوية، والهندسة المعمارية، أو ميزات المدينة باستخدام مجهر مشرق الميدان (التي ستؤديها معا أخصائي و technician(s) الذين سيتم بناء طرفية).
  3. تسليط الضوء على مجالات الطبوغرافية المنفصلة مع علامة على الشريحة الزجاجية أو مع الأداة المناسبة على برمجيات شريحة رقمية (الشكل 1A).
  4. وبناء على الشرائح المحددة، استرداد كتل FFPE المقابلة من المحفوظات.
    ملاحظة: لتحسين الجمعية التونسية للأمهات البناء، لتجنب نضوب الأنسجة، والحفاظ على الجمعية التونسية للأمهات لكمه السلامة الهيكلية، الحالات مع < 1 مم سميكة الأنسجة المتبقية ينبغي استبعادها.

2-تصميم وتشييد طرفية استناداً إلى تقنية كونونين

  1. إنشاء وفتح ملف جدول بيانات جديد إدراج سجلات مجالات متميزة لكل حالة على حدة. وتشمل البيانات التالية في أعمدة منفصلة، كما يتضح من الجدول 1: حالة معرف، كتلة معرف معرف المنطقة، نوع الأنسجة (مثلاً، أنسجة طبيعية، هيستوتيبي المكونات الغازية، في الموقع هيستوتيبي المكون)، والطوبوغرافيا(مثلاً الورم الأساسية، الجبهة الغازية)، مورفولوجيا (مثلاً، الصف النووية، الهندسة المعمارية، وميتوسيس، وميزات الخلوية)، ووضع المؤشرات الحيوية (أي، مستقبلات الإستروجين (ER)، مستقبلات البروجسترون (PR)، Ki67، و HER2)، وجميع ملامح المدينة الأخرى المتاحة.
    1. قم بحفظ المستند.
  2. إنشاء مشروع الجمعية التونسية للأمهات.
    1. تثبيت وفتح البرنامج مصمم الجمعية التونسية للأمهات.
    2. تحديد مستلم الجمعية التونسية للأمهات block(s): الوصول من خلال القائمة ملف > جديد > كتلة أو باستخدام CTRL + "باء"
    3. انقر في الحقل الأول لملء أو اضغط على المفتاح Tab، واكتب في أبعاد كتلة البارافين: العرض 35 (ملم)، وارتفاع 20 (مم). نوع "2" كقيمة "الهامش" (أي، المسافة من حافة البارافين في مم) (الشكل 1B). حفظ البيانات بالنقر فوق الزر المناسب. يتم الآن حفظ القالب الجديد من كتلة المتلقية وعلى استعداد لاستخدامها في قوالب الصفيف أنسجة جديدة.
    4. إنشاء مشروع مجموعة أنسجة: الوصول إلى القائمة ملف > جديد > "مجموعة الأنسجة" أو باستخدام CTRL + t.
    5. ملء اسم الصفيف الأنسجة وتعليقات مقدم البلاغ، ثم انقر فوق "التالي". انقر فوق رمز "استيراد" واختر ملف القالب من كتلة المتلقية التي تم إنشاؤها مسبقاً وانقر فوق "التالي".
    6. اختر 1 ملم كحجم البقعة بواسطة النقر فوق الزر جولة. اختر 500 ميكرومتر كبقعة التباعد الذي هو المسافة بين اثنين من مراكز البقع المجاورة. انقر على أيقونة آلة حاسبة لحساب العدد الإجمالي للنقاط التي تم إنشاؤها، التي ينبغي أن تكون 231. انقر فوق "التالي".
    7. تحديد وضع الترقيم الموضعي بالنقر فوقه مرة واحدة. انقر فوق الزر "تحديد" لإنشاء الشبكات والشبكات الفرعية. حذف الخط المركزي (السطر 6) والأعمدة 8 و 15. الحفاظ على البقع 3 سطر 1 للتوجيه. وينبغي أن يشمل الخريطة النهائية عدد إجمالي من البقع 183، كما هو ممثل في الشكل 2.
    8. تحديد قائمة بأنواع الأنسجة: الوصول من خلال القائمة ملف > جديد > قائمة أنواع الأنسجة، أو باستخدام المفاتيح CTRL + "l."
    9. قم بإدراج وصف الأنسجة تم تعريفها مسبقاً. اضغط على سهم لأسفل أو انقر فوق الزر لإضافة سطر +.
    10. تعريف المشروع: الوصول من خلال القائمة ملف > جديد > المشروع الداعم أو باستخدام CTRL + "ص"
    11. ملء اسم الصفيف الأنسجة، والتعليقات، والكاتب، ثم انقر فوق "التالي". استيراد ملف جدول البيانات، وقائمة بأنواع الأنسجة، ونموذج الصفيف الأنسجة سابقا التي تم إنشاؤها بواسطة النقر فوق الرموز المناسبة.
    12. انقر فوق "تحديد الكل"، وتحديد عدد النقاط لكل نوع من أنواع النسيج؛ انقر فوق الزر "مطابقة" لتطبيق الإعدادات. سوف تظهر قائمة بالعدد الإجمالي للنوى التي سيتم أخذ عينات منها وتحويلها إلى كتل المستفيدة في هذا المشروع. قم بحفظ المشروع، وأغلق البرنامج.
  3. إعداد block(s) يقبلون (الشكل 1B).
    1. ملء قوالب معدنية المطهرة مع البارافين الجزء عند 65 درجة مئوية.
    2. ترك كتل البارافين لتبرد في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها داخل قوالب معدنية.
    3. استخراج كتل البارافين من قوالب معدنية. في حالة حدوث الشقوق، تجاهل الكتلة وكرر الخطوات 2.3.1-2.3.3.
  4. بناء الجمعية التونسية للأمهات باستخدام أررايير الآلي أو شبه الآلية19.
    1. تحديد استرداد كافة كتل فب والأقسام المناظرة ح & ه مع شروح.
    2. قم بتشغيل في أررايير وإدراج block(s) يقبلون على دائري أررايير.
    3. فتح برنامج محطة السيطرة أررايير وانقر على "مجموعة أنسجة جديدة"، وتحميل المشروع التي تم إنشاؤها مسبقاً (الشكل 1).
    4. انقر فوق "متابعة"، وحدد موضع block(s) المانحة من القائمة.
    5. تحديد موضع البداية على كل كتلة المستفيدة: استخدام مفاتيح الأسهم للتحرك على ضوء الليزر ومواءمته مع الحافة العلوية على البارافين كتلة المتلقية.
    6. انقر فوق "التالي"، وكرر للمحاذاة العمودية.
    7. انقر فوق "التالي" لخلق ثقب تلقائياً في تنسيق محدد مسبقاً من كتلة المستلم (acceptor).
    8. إفراغ لكمه.
    9. ضع كتلة المانحة لأخذ العينات وإزالة أنسجة أساسية من منطقة المشروح سابقا للفائدة.
    10. إدراج الأساسية الأنسجة المانحين في الحفرة في كتلة المستلم (acceptor).
    11. إزالة كتلة المانحة من أرايير.
    12. كرر الخطوات 2.4.5-2.4.11 حتى يتم إكمال الجمعية التونسية للأمهات.
  5. وضع الجانب الأنسجة كتلة الجمعية التونسية للأمهات الذي تم إنشاؤه حديثا على شريحة فارغة عقيمة ووضعها في فرن المختبر في 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. اضغط برفق في الكتلة على الشريحة 5 s تسطيح النوى الأنسجة. كرر هذه العملية مرة واحدة (لما مجموعة 2 مرات).
  7. إزالة كتلة الجمعية التونسية للأمهات إلى جانب الشريحة من الفرن وانعكاسها، وفصل الكتلة من الشريحة بلطف.
  8. تغطية سطح الأنسجة الشفافة مع طبقة رقيقة من البارافين الجزء عند 65 درجة مئوية.
  9. ترك كتلة الجمعية التونسية للأمهات في درجة حرارة الغرفة ح 2.
  10. نقل كتلة الجمعية التونسية للأمهات في 4 درجات مئوية عن 24 ساعة.
    ملاحظة: يمكن تخزين كتلة الجمعية التونسية للأمهات في 4 درجات مئوية حتى استنفاد.

3-histochemical وتحليلات المناعي

  1. قص الأجزاء الشفافة.
    1. Block(s) مكان يقبلون الجمعية التونسية للأمهات مع البارافين-الجانب الأسفل على سطح-10 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لالبرد في البارافين.
    2. ملء حمام التعويم مع الماء عالي النقاوة وضبط الحرارة إلى 38 درجة مئوية.
    3. شفرة جديدة على مبضع روتاري وإدراج الكتلة تشاك مبضع حيث يواجه بليد كتلة الشمع وهو الانحياز في الطائرة العمودية.
    4. نهج الكتلة بعناية مع بليد وقطع المقاطع رقيقة قليلة لضمان تحديد المواقع بشكل صحيح؛ تعديل إذا لزم الأمر.
    5. قص 3 ميكرومتر سميكة المقاطع.
    6. التقاط المقاطع باستخدام الملقط وتعويم لهم على السطح حمام الماء.
    7. اختيار المقاطع من حمام الماء على الشرائح الزجاجية العادية والمدينة/العش.
    8. ضع الشرائح على رف وتخزينها في الفرن عند 45 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: بمجرد إعدادها، ينبغي الملون فروع الجمعية التونسية للأمهات خلال 24 ساعة.
  2. القيام بتلوين histochemical (H & E) باستخدام أوتوستاينير.
    1. إدراج الشرائح في الرف أوتوستاينير ووضعها في 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. فتح درج تحميل أوتوستاينير وإدراج الشرائح على الرف مع الجمعية التونسية للأمهات في أحد مراكز التحميل مع قصاصة ح & ه قياسية التي تواجه الخارج.
    3. بمجرد الدرج مغلق وسيتم الاعتراف القصاصة تلقائياً بالنظام وسوف تبدأ بروتوكول التالية: محطة فرن في 37 درجة مئوية (6 دقيقة)، زيلين نفط (2 دقيقة)، زيلين نفط (2 دقيقة)، الإيثانول 100% (2 دقيقة)، الإيثانول 100% (2 دقيقة)، الإيثانول 95% (2 دقيقة)، الإيثانول 95% (2 دقيقة) ، المقطر المياه (4 دقيقة)، توضع في كرزي (9 دقيقة)، المياه الجارية الضغط المنخفض (2 دقيقة)، ثم 1% (1 دقيقة)، المياه الجارية الضغط المنخفض (2 دقيقة)، الإيثانول 95% (20 s)، الإيثانول 95% (20 s)، الإيثانول 95% (20 s)، الإيثانول 95% (20 s)، الإيثانول 100% (15 ق)، الإيثانول 100% (15 ق) ، زيلين نفط (30 ثانية)، زيلين نفط (30 ثانية).
    4. إلغاء تحميل الرفوف من الدرج وجبل الشريحة مع زلة الغطاء.
      1. جمع قطره جبل مع ماصة ووضعه على حافة الشريحة الغطاء خارجي.
      2. ضع الجانب الرطب من كشف الغطاء عن الشريحة واسمحوا جبل الجاف لمدة 30 دقيقة.
  3. أداء المدينة تلطيخ ER PR، Ki67 و HER2 باستخدام إيمونوستاينير الآلي.
    ملاحظة: قبل بدء تشغيل المصبوغة، بدء تشغيل النظام، والتحقق من الزجاجات كاشف المواد الاستهلاكية (جدول المواد)، وحاويات النفايات.
    1. ضع الشرائح الشفافة لتحليل عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. بدء تشغيل أداة إيمونوستاينير والبرمجيات.
    3. في "عرض الصفحة الرئيسية"، انقر فوق الزر البروتوكولات، ومن ثم انقر فوق "بروتوكولات" إنشاء/تحرير.
    4. حدد الدأب القياسية (3، 3 '-ديامينوبينزيديني) المدينة إجراءات لتعديل القالب الأساسي.
    5. وضع علامة "ديبارافينيزيشن" في مربع القائمة وضبط "درجة حرارة متوسطة" في 72 درجة مئوية.
    6. العلم الحل تعرية cc1، تعيين "درجة الحرارة المتوسطة" في 95 درجة مئوية، وفترة الحضانة في 36 دقيقة.
    7. وضع علامة على المربع "جسم الأولية"، وإدراج معرف موزع مضمنة ER (البرامج الصك سوف تعترف الموزع على دائري كاشف) وتعيين وقت الحضانة في 16 دقيقة.
    8. وضع علامة على مربع كونتيرستينينج، حدد الهيماتوكسيلين الأول، وتعيين وقت الحضانة في 12 دقيقة.
    9. انقر فوق الزر "حفظ باسم" واسم البروتوكول.
    10. كرر 3.3.3-3.3.9 خطوات للأجسام المضادة تبقى استخدام أوقات الاحتضان الأجسام الأولية التالية: العلاقات العامة 16 دقيقة ودقيقة Ki67 16 HER2 12 دقيقة استخدام الأجسام المضادة قبل المخفف جاهزة للاستخدام (RTU).
    11. في "عرض الصفحة الرئيسية"، انقر فوق الزر "إنشاء تسمية".
    12. انقر فوق الزر البروتوكولات وإضافة بروتوكولات HER2 و Ki67، ER والعلاقات العامة لكل من نقابة الأطباء التركية لتحليل.
    13. انقر فوق الزر إغلاق/Print.
    14. يظهر كالتسمية القالب، قم بإدخال "معرفات الجمعية التونسية للأمهات" للتسمية.
    15. انقر فوق الزر "طباعة" طباعة التسميات ومن ثم تطبيقها على الشرائح الشفافة.
    16. انقر فوق رمز أداة وتعيين وضع بدء تشغيل أداة "جاهزة".
    17. افتح غطاء يغطي دائري الكواشف ووضع نظام الكشف عن الأجسام المضادة الأولية، ثم أغلق غطاء محرك السيارة.
    18. انقر فوق الزر الجبهة على درج شريحة فتحه وتحميل الشرائح الشفافة، وقم بإغلاق الدرج بالنقر فوق الزر نفسه.
    19. قم بتعيين وضع بدء التشغيل الصك كما "تشغيل" واتبع التعليمات.
    20. في نهاية تفريغ التشغيل، الجمعية التونسية للأمهات الشرائح عن طريق الضغط على "جميع الإدراج مفتوحة" مع زر "أكملت الشرائح" على أداة "التحكم الشريحة" وشطف الحارة لهم في الماء والصابون لإزالة أي الكواشف المتبقية.
    21. يغسل الشرائح تحت الضغط المنخفض الباردة المياه الجارية ويذوي الشرائح الشفافة، وتطبق زجاج ساترة لكل شريحة.
  4. إجراء تحليل المدينة ER، والعلاقات العامة، و HER2 عقب أمريكا المجتمع من سريرية علم الأورام (اسك)/كاب المبادئ التوجيهية، ومن Ki67 وفقا لتوصيات Ki67 الدولية في الفريق العامل "سرطان الثدي" (الجدول 2).
    ملاحظة: هذا يجب إجراء التحليل كل على حدة في البقع الأنسجة المنفصلة بأخصائي مع خبرة في أمراض الثدي.
    1. تقييم التعبير ER إيجابيا إذا كان ≥ 1% من نواة خلية الورم إيمونوريكتيفي20،21،،من2223.
    2. تقييم تعبير العلاقات العامة إيجابية إذا كان ≥ 1% من نواة خلية الورم إيمونوريكتيفي20،21،،من2223.
    3. تقييم التعبير HER2 ك: أ) نقاط 3 + إذا الغشاء كفافى تلطيخ صورة كاملة ومكثفة، ب) نقاط 2 + إذا الغشاء كفافى تلطيخ غير مكتملة و/أو ضعف/معتدلة وضمن > 10% من خلايا السرطان الغازية أو كاملة و غشاء كفافى تلطيخ مكثفة وداخل ≤ 10% من خلايا الورم الغازية، ج) نقاط 1 + إذا كان غشاء غير مكتمل تلطيخ خافت يكاد يلمس وضمن > 10% من خلايا الورم الغازية، د) سلبية إذا لم تلطيخ غير موجود أو الغشاء تلوين غير كاملة وخافت يكاد يلمس وداخل ≤ 10% الورم الغازية الخلايا3،24.
    4. تقييم مؤشر Ki67 حسب النسبة المئوية للخلايا مع تلطيخ النووية في خلايا الورم على الأقل 1,000 عشوائياً تحديد ما يزيد على 10 حقول عالية القدرة (التكبير، 400 X)25.

4. تحليل سايش HER2

  1. قص فروع الجمعية التونسية للأمهات (كرر الخطوة 3.1).
  2. أداء سايش HER2 لاستخدام إيمونوستينير الآلي.
    1. ضع الشرائح الشفافة لتحليل عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. بدء تشغيل أداة إيمونوستاينير والبرمجيات.
    3. في "عرض الصفحة الرئيسية"، انقر فوق الزر البروتوكولات، ومن ثم انقر فوق "بروتوكولات" إنشاء/تحرير.
    4. حدد الإجراء "ش ككت ايش المزدوج" لتعديل القالب الأساسي.
    5. وضع علامة "التجفيف" في مربع القائمة وضبط درجة الحرارة عند 63 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    6. وضع علامة "تكييف الخلية" في مربع القائمة، ثم "خلية تكييف CC2"، وتعيين درجة الحرارة في وقت 86 درجة مئوية والحضانة في دقيقة 4.
    7. العلم CC2 خفيفة (الدورة 1) ومعيار (2 دورة)، والموسعة (دورة 3) دقيقة 8 و 12 دقيقة بدقيقة 8، على التوالي.
    8. وضع علامة "العش-حوزتي 3" في قائمة مربع وتعيين وقت الحضانة في 16 دقيقة.
    9. حدد المسابير HER2DNP و CHR17DIG وتعيين وقت الحضانة في ح 6.
    10. تعيين الغسيل في 76 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
    11. تعيين وقت الحضانة سايش مولتيمير (HRP التثقيف العش سيل) في 32 دقيقة.
    12. تعيين وقت الحضانة chromogen الفضة (SIL العش DNP CHRC) في 4 دقيقة.
    13. تعيين وقت حضانة مولتيمير أحمر (AP حفر العش الأحمر) في 24 دقيقة.
    14. تعيين وقت الحضانة chromogen أحمر (FR حفر العش الأحمر) في 8 دقيقة.
    15. علم "كونتيرستاينينج" في مربع القائمة، حدد "الهيماتوكسيلين الثانية"، وتعيين وقت الحضانة في 8 دقيقة.
    16. علم "ما بعد كونتيرستاينينج" في مربع القائمة، حدد "كاشف لالتشطيب"، وتعيين وقت الحضانة في 4 دقيقة.
    17. كرر الخطوات من 3.3.11-3.3.15 (حدد تعديل البروتوكول ش ككت ايش المزدوج).
    18. فتح غطاء يغطي دائري الكواشف، مكان الغسيل ونظم الكشف عن العش، ثم أغلق غطاء محرك السيارة.
    19. كرر الخطوات من 3.3.18-3.3.21.
  3. إجراء تحليل سايش ل HER2: تقييم التضخيم الجين HER2 إيجابية إذا كانت نسبة/CEP17 HER2≥2.0 متوسط HER2 نسخة رقم ≥4.0 إشارات كل خلية، وسلبية إذا كانت نسبة/CEP17 HER2< 2.0 مع متوسط HER2 نسخ رقم < 4.0 إشارات/الخلية3،24.
    ملاحظة: مشابهة للمدينة، هذا التحليل ينبغي أن يؤديها كل على حدة في البقع الأنسجة المنفصلة أخصائي خبرة في أمراض الثدي.

النتائج

وعموما، 444 الثدي الغازية السرطان قد أدرجت في طرفية 15 على وجه التحديد الأمثل لتحليلات العش. بين البقع 2,664 عينات، 2,651 (99.5%) ممثلة للمناطق المحددة سابقا ولذلك تعتبر قابلة للتحاليل اللاحقة. تقرر عدم التجانس داخل الورم عن طريق المدينة وسيح، مع تركيز بوجه خاص على التوزيعات غير مت...

Discussion

هنا، نحن تفصيلية استراتيجيات مختبر لإجراء تحليلات سايش الجين HER2 والسنترومير المقابلة لها في طرفية عالية الغلة من سرطان الثدي بين المجهزة. هذا الأسلوب هو فعالة من حيث التكلفة، ويمكن أن تنفذ في معظم المختبرات لدراسة التغاير التضخيم الجين HER2 في أفواج كبيرة من الثدي السرطان استردا?...

Disclosures

الكتاب قد لا تعارض المصالح.

Acknowledgements

لا شيء.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Surgipath ParaplastLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU39601006Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solutionBio Optica, Milan, Italy, EU510002Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylinBio Optica, Milan, Italy, EU506012Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond qualityLaboindustria, Arzergrande, Italy, EU3353326x76 mm microscope slides
Leica CV MountLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU14046430011Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slidesAgilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USAK8020Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRAVentana medical system, Tucson, AZ, USAN750-BMKU-FSSlide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4324Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2223Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4286Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4493Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-500Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe CocktailVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4422INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA800-098
ultraView Red ISH DIG Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA800-505
ISH Protease 3Ventana medical system, Tucson, AZ, USA780-4149Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
HematoxylinVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-2021Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II CounterstainingVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2208Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagentVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-2037Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReadyVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4409Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-102Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-110Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCSVentana medical system, Tucson, AZ, USA650-210Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-300Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-223Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-224
ultraView Silver Wash IIVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-003Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
MicrotomeLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EURM 2255Automated rotary microtome
MultistainerLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EUST 5020Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1Alphelys, Plaisir, France, EU00-MICO-1Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EUK080254Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-CassetteSakura Finetek Europe B.V4135Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base MoldSakura Finetek Europe B.V7055Stainless-Steel base metal mold

References

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now?. Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923 (2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. , (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. . WHO Classification of Tumours of the Breast. , (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93 (2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

130 2 HER2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved