JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تحرير الجينات المستهدفة باستخدام كريسبر/Cas9 وسهلت إلى حد كبير فهم الوظائف البيولوجية للجينات. هنا، فنحن نستخدم المنهجية كريسبر/Cas9 إلى نموذج calreticulin الطفرات في الخلايا المكونة للدم تعتمد على سيتوكين بغية دراسة نشاطها النمطان.

Abstract

مجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) هو نظام مناعة تكيفية في بدائيات النوى التي قد تم إعادة توجيه الغرض منه بالعلماء لتوليد nucleases الموجهة بالجيش الملكي النيبالي، مثل المرتبطة كريسبر (Cas) 9 للجينوم التوكسينات الخاصة بالموقع تحرير. ويستخدم هندسة الجينوم ب Cas9 بكفاءة وسهولة وقوة تعديل الجينات الذاتية في العديد من خطوط الخلايا الثديية الوسائل ذات الصلة والكائنات الحية. هنا نعرض مثالاً لكيفية الاستفادة من المنهجية كريسبر/Cas9 لفهم الوظيفة البيولوجية للطفرات الوراثية المحددة. نحن نموذج كالريتيكولين (كالر) الطفرات في مورين انترلوكين-3 (mIL-3) برو-ب (بكالوريوس/F3) الخلايا التابعة بتقديم دليل واحد الكشف (سجرناس) تستهدف محور كالر الذاتية في منطقة محددة حيث الإدراج أو الحذف (إينديل ) تحدث الطفرات كالر في المرضى الذين يعانون من الأورام ميلوبروليفيراتيفي (MPN)، هو نوع من سرطان الدم. سجرناس إنشاء فواصل حبلا مزدوجة (دسبس) في المنطقة المستهدفة التي يتم إصلاحها قبل نهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل (نج) لإعطاء إينديلس من مختلف الأحجام. ثم نتبعها مقايسة التحول الخلوي با/F3 القياسية فهم تأثير التعبير مستوى الفسيولوجية للطفرات كالر على تحول الخلايا المكونة للدم. ويمكن تطبيق هذا النهج على جينات أخرى لدراسة وظيفتها البيولوجية في مختلف خطوط خلايا الثدييات.

Introduction

وثورة التكنولوجيا كريسبر/Cas9 مؤخرا تحرير الجينوم المستهدفة في الخلايا الحية والكائنات الحية. فقد أصبحت أداة قوية للغاية للبحوث الطبية الحيوية، ويستخدم حاليا كأحد السبل الممكنة للعلاج من الأمراض الوراثية1. أساسا لجميع أدوات التحرير الجينوم تعتمد على إنشاء المستحثة نوكلاس الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فاصل (جهاز تسوية المنازعات) في موضع الجينوم إلى تعديل. يمكن إصلاحه في دسبس غير المتجانسة نهاية-الالتحاق بالعمل (نج) أو إصلاح موجه التماثل (HDR)2،3. وميزة نوكلاس Cas9 على الجينوم أخرى الهندسة نوكليسيس، مثل نوكليسيس إصبع الزنك (زفنس) والنسخ المستجيب المنشط--مثل نوكليسيس (تالينس) هو اعتمادها على الحمض النووي الريبي لاستهداف نوكلاس لتسلسل الحمض النووي المطلوب، مقارنة لتفاعلات البروتين-الحمض النووي وجدت في2،زفنس وتالينس3.

بعد اكتشاف المسار نوكلاس كريسبر/Cas9 كنظام المناعة تكيفية في خلايا بدائية4،5، وقد بذلت جهود كبيرة في تكييف مسار لاستخدامها في خطوط خلايا الثدييات ونموذج الكائنات الحية2، 3-يستخدم مسار كريسبر/Cas9 كأداة لتحرير الجينات، عنصرين رئيسيين هما: العقدية المقيّحة (Sp) تستمد نوكلاس Cas9 واستهداف الجين للفائدة2،3سجرناس. سجرنا يتكون من 20 النيوكليوتيدات أن Cas9 مباشرة إلى موقع معين على الجينوم عن طريق الحمض النووي الريبي زوج قاعدة التكامل2،3. يجب أن تقع موقع الهدف سجرنا المتاخمة لموقع بروتوسباسير عزر المتاخمة (بام) في شكل 5 ' نج، الذي يعترف به نوكلاس SpCas9. مع هذه الأدوات، يمكن توجيه Cas9 إلى أي تسلسل الحمض النووي بتصميم سجرناس التي تستهدف منطقة الفائدة. وبالإضافة إلى ذلك هناك Sp تستمد Cas9، المتغيرات الإضافية ل Cas9 مع ميزات مختلفة تبعاً لتطبيق معين. على سبيل المثال، هناك متغيرات Cas9 مع خصوصية أعلى للتحرير على الهدف أو قدرة الانقسام حبلا واحد للحمض النووي نيكينج6،7. وعلاوة على ذلك، وضعت مؤخرا لتنظيم النسخي8Cas9 حفازة نشطة. استخدم العلماء الآن النظام كريسبر/Cas9 لمجموعة متنوعة من التطبيقات، مثل knockin الجينات وخروج المغلوب لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات9وفقدان لوظيفة ومكسب للدالة مكتبة شاشات10 والوراثية هندسة نموذج الكائنات11.

في هذا البروتوكول، قمنا بضم المنهجية كريسبر/Cas9 مع المقايسة الخلوية التحول با/F3 لفهم الوظيفة البيولوجية للطفرات كالر . با/F3 الخلايا هي مورين خط خلية المكونة للدم تابعة إيل-3 الذي يمكن أن يصبح إيل-3 مستقلة عند التعبير عن بعض المسرطنة مثل المركز قبل12. من أجل فهم سواء calreticulin المسخ يمكن تحويل الخلايا با/F3 للنمو المستقل سيتوكين، استهدفت إكسون 9 من محور كالر الذاتية باستخدام كريسبر/Cas9 إلى استحداث الطفرات إينديل وثم انسحب إيل-3 من الخلايا لتطبيق اختيار إيجابي الضغط، مع هدف أتصدى الطفرات كالر مكسب للدالة الموجودة في المرضى MPN. البروتوكول يشمل التصميم، والاستنساخ وتسليم سجرناس، تنمية مستقرة Cas9 الخلايا وإذ تعرب عن والكشف عن كريسبر على المستهدفة تحرير الجينات. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على جينات مختلفة ومختلف خطوط الخلية سيتوكين-تعتمد على الفائدة وهي ذات قيمة خاصة في وضع النماذج ودراسة الوظيفة البيولوجية من الجينات المعنية بسرطان.

Protocol

1-سجرنا التصميم "باستخدام أدوات الإنترنت"13

  1. تصميم سجرناس استهداف الجين للاهتمام باستخدام أدوات متاحة مجاناً على الإنترنت.
    1. نسخ ولصق نكبي مرجع تسلسل الجينات لمصلحة في أداة مصمم ويب سجرنا المعهد قاعدة عريضة: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      ملاحظة: هذه الأداة تحدد تسلسل سجرنا مع مواقع الانقسام داخل exons وتلك التي تمتد عبر حدود إنترون/إكسون، لكنها ما زالت تنشق داخل إكسون.
    2. تحميل وفتح الملف النصي الناتج في excel.
    3. التركيز على الأعمدة المأهولة بالسكان مع تسلسل سجرنا وسياق سجرنا تسلسل. ملاحظة لا تحتوي على تسلسلات سجرنا عزر بروتوسباسير المتاخمة (بام) ولكن القيام به سياق تسلسل.
    4. لاحظ أن درجة فعالية على الهدف تسرد نقاط الكفاءة الانقسام وتوقع على مقياس من 0 إلى 1 حيث تشير نقاط 1 إلى مستوى أعلى من كفاءة انقسام.
    5. استخدام الدالة 'فرز' من excel إلى أما ترتيب الأهداف بدرجة كفاءة أو بواسطة موقع داخل الجينات المستهدفة من خلال العمود '% قص الهدف'.
      ملاحظة: الفرز حسب الموقع داخل الجين مفيدة في تحديد سجرناس التي تستهدف مجال محدد أو إكسون للفائدة.
    6. حدد 3-6 سجرناس التي تستهدف مجال يحظى باهتمام عالية (> 0.6) درجات الفعالية على الهدف. يمكن أن يكون من المفيد أن نعرف ما هي أنواع الطفرات قد تكون مسؤولة عن النمط الظاهري هو المطلوب (انظر من فضلك الرقم 1 شرح استراتيجية الاستهداف المستخدمة كالريتيكولين).
      ملاحظة: ينبغي النظر سجرناس عن عتبة درجة فعالية 0.6 المقترح عندما يكون هناك نقص المرشحين الآخرين جيدة.
    7. استخدام أداة ويب تحليل جرنة معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا على الشاشة للآثار المحتملة خارج الهدف (http://crispr.mit.edu/). لكل سجرنا مختارة، تشغيل التسلسل المستهدفة (بما في ذلك في بام).
      ملاحظة: أداة مصمم ويب سجرنا المعهد قاعدة عريضة يمكن أن تستخدم أيضا للشاشة للآثار خارج الهدف (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      1. لاحظ أن أداة التحليل سجرنا معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا عشرات كل سجرنا على مقياس من 1-100 حيث تدل على درجة 100 خصوصية أعلى. درجة أكبر من 70 مثالية ويمثل سجرنا بالحد الأدنى من آثار خارج الهدف. هذا الموقع أيضا بإنشاء قائمة من الزيارات خارج الهدف مع موقعها داخل الجينوم ويتطابق عدد كل منها مع دليل المرشح.
        ملاحظة: تعتبر يضرب خارج الهدف مع أربع حالات عدم التطابق أو زيادة أمن14. يضرب خارج الهدف بأقل من أربع حالات عدم التطابق قد يكون صعباً إذا اندرجت في إطار exons14.
    8. اختر سجرناس 2-3 التي تستهدف مواقع متميزة داخل المنطقة من الفائدة للجينات المستهدفة، والتي لديها أعلى الدرجات الكفاءة وخارج الهدف الانقسام المزدوجة (انظر الجدول 1 لمتواليات سجرنا استهداف إكسون 9 من كالر).
      ملاحظة: اعتماداً على أهداف تجريبية، أكبر قد يكون التشديد على القيم المختلفة التي تم الحصول عليها من الأدوات المذكورة.

2-استنساخ سجرنا أوليجوس13

  1. توليد اليغو إلى الأمام
    1. قم بإنشاء قائمة تسلسلات سجرنا دون الموقع بام.
    2. إضافة a G إلى 5 'نهاية التسلسل إذا لم تكن 5' نهاية تسلسل سجرنا غ.
      ملاحظة: هذا ز ضروري لتعظيم مستوى النسخ سجرنا يحركها U6. إضافة ز الضروري سجرنا m1 (الجدول 1).
    3. إضافة التسلسل "كاكك" إلى 5 ' نهاية التسلسل الأمثل ز دليل (أم لا) (الجدول 2) بغية توليد يتدلى المطلوبة لربط ملدن أوليجوس في بسمبي يهضم متجه لينتيجويدي (راجع الخطوة 3)-
  2. توليد اليغو عكس
    1. وتكمل عكس التسلسل الأمثل ز دليل (أم لا).
    2. إضافة التسلسل "آآك" إلى 5 ' نهاية تسلسل عكس استكمال دليل الأمثل ز (الجدول 2).
    3. ترتيب أوليجوس المصممة من شركة توليف التمهيدي.
  3. يصلب وفوسفوريلاتي أوليجوس
    1. إضافة 1 ميليلتر من اليغو إلى الأمام (100 ميكرومتر)، 1 ميليلتر من اليغو العكسية (100 ميكرومتر)، 1 ميليلتر من 10 × ربط T4 المخزن المؤقت، 0.5 ميليلتر من T4 بولينوكليوتيدي كيناز (بنك) و 6.5 ميليلتر من ح2س إلى أنبوب بكر (المجموع = 10 ميليلتر).
    2. تشغيل البرنامج التالي في ثيرموسيكلير: ˚C 37 30 دقيقة, 95 ˚C لمدة 5 دقائق, المنحدر من 95 إلى 25 في 0.1 ° C/s.
    3. تمييع المنتج رد فعل على 1: 250 ح2o.

3-الهضم لينتيجويدي-بورو متجه13

  1. ملخص لينتيجويدي-بورو المتجهات
    1. تجميع فعل هضم 50 ميليلتر مع المكونات التالية: 5 ميكروغرام بلازميد دائري، 2 ميليلتر (30 وحدة) إنزيم التقييد بسمبي، 5 ميليلتر من المخزن المؤقت لأنزيم التقييد وما يصل إلى 50 ميليلتر من H2o.
    2. تشغيل رد فعل ح 2 في 55 درجة مئوية. وبعد ساعة الأولى، إضافة 1 ميليلتر أكثر من إنزيم التقييد بسمبي.
  2. ديفوسفوريلاتي العمود الفقري قطع
    1. إضافة 7 ميليلتر من المخزن المؤقت لرد فعل الفوسفاتيز وميليلتر 2 إنزيم الفوسفاتيز إلى الموجه هضمها.
    2. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. بكر تنقية القص والعمود الفقري ديفوسفوريلاتيد باستخدام مجموعة أدوات تجارية.
    ملاحظة: بديل الأعمدة الملونة الوردي المقدمة مع عدة مينيبريب الأزرق الأعمدة الملونة منذ هذه أفضل يمكن أن تستوعب أحجام كبيرة بلازميد. يمكن زيادة الغلة بتدفئة المخزن المؤقت في كتلة حرارة 90 ˚C قبل شطف شطف والتينج الحمض النووي من العمود مرتين في النهاية (تشغيل التيد الحمض النووي من شطف أول مرة أخرى عن طريق مرة ثانية).

4-ربط أوفانيليد أوليجوس في "العمود الفقري يهضم"13

  1. إضافة 50 نانوغرام من هضم العمود الفقري، 1 ميليلتر من تعتيق تمييع اليغو، 1 ميليلتر من 10 × ربط T4 المخزن المؤقت، 1 ميليلتر ليجاسى T4 وما يصل إلى 10 ميليلتر من ح2س إلى أنبوب PCR. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة
  2. تحويل الخلايا Stbl3 مع 2 ميليلتر من رد فعل عملية ربط. لوحة على صفيحة ليسوجيني أجار مرق (رطل) مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  3. اختيار 3 مستعمرات وتطعيم إلى ثقافة الإعدادية المصغر.
  4. التحقق من صحة الإدخال الصحيح اليغو
    1. أداء مينيبريب لكل ثقافة وتسلسل من خلال موقع الإدراج اليغو بدءاً من تمهيدي في المروج U6 باستخدام مجموعة أدوات تجارية.
    2. أداء الإعدادية ميدي أو ماكسي الإعدادية ثقافة التحقق من التسلسل.

5-جيل من الخلية lLines ستابلي SpCas9 معربا عن

ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول إيصال بلازميد pLX_TRC311-Cas9 بالعدوى لينتيفيرال. هذا البروتوكول هو وصف بالتفصيل مورين انترلوكين-3 (mIL-3) برو-ب (بكالوريوس/F3) الخلايا التابعة، خط خلية تعليق ويمكن تكييفه لأنواع الخلايا الأخرى استخدام شروط الثقافة المفضل لكل نوع من الخلايا. مستنبت للخلايا با/F3 يتكون من ربمي تكملة مع 10% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين/ستربتوميسين/L-الجلوتامين و 10 نانوغرام/مل من مورين انترلوكين 3.

  1. ترانسفيكت HEK-293T الخلايا
    1. البذور 3 × 106 HEK 293T الخلايا الواحدة 10 سم طبق استنبات الأنسجة. تبقى خلايا المصنف قبل تعداء بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: الخلايا HEK 293T خط خلية ملتصقة وتستخدم بشكل روتيني لإنتاج الفيروس. تتم المحافظة على الخلايا في دميم وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين/ستربتوميسين/L-الجلوتامين. يجب أن تكون الخلايا روافد 80% في الوقت الذي تعداء.
    2. الاحماء قبل خفض المصل وسائل الإعلام (غروب-الفنزويلية) والمتوسطة النمو.
    3. إضافة 500 ميليلتر من المصل انخفاض وسائل الإعلام، 7 ميكروغرام بناء pLX_TRC311-Cas9، 4 ميكروغرام للتغليف لينتيفيرال بكمف-منظمة-ز بلازميد وميكروغرام 4 من بلازميد التغليف لينتيفيرال psPAX2 في أنبوب
      ملاحظة: مجموع الحمض الخلوي الصبغي الواحد طبق 10 سم من الخلايا 293T هو 15 ميكروغرام.
    4. مزيج الحمض النووي جيد وإضافة 45 ميليلتر من تعداء كاشف. المزيج بلطف والسماح لها الوقوف لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: من المهم استخدام الوسائط المصل انخفاض بسبب المصل سوف تحول دون تشكيل معقدة بين كاشف تعداء وبلازميد الحمض النووي.
    5. نضح المتوسطة القديمة في لوحة 293T وإضافة 5 مل متوسط نمو جديدة.
    6. إضافة كاشف مزيج الحمض النووي وتعداء بطريقة حكيمة قطره إلى لوحة 293T. دوامة بلطف واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة.
    7. حصاد supernatants الفيروسية في تعداء بوست ح 24 و 48. تمرير من خلال تصفية ميكرومتر وقاسمه 0.22 في أنبوب كريوفيال (1.6 مل/أنبوب وإرادة 1.5 مل تستخدم للعدوى).
    8. تخزين المادة الفيروسية طافية في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن استخدام المادة طافية لينتيفيرال في غضون 6 أشهر. إذا كان ذلك ممكناً، ينبغي إجراء ترانسدوكشنز سبينفيكشن مع الفيروس الطازجة).
  2. لينتيفيرال العدوى من الخلايا با/F3
    1. ذوبان المادة الفيروسية طافية على الجليد، وإذا كانت مجمدة.
    2. الطرد المركزي خلايا في 300 غ س لمدة 4 دقائق.
    3. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا بتركيز 3 × 106 خلايا/مل.
    4. إضافة 500 ميليلتر الخلايا حراكه، 1.5 مل من المادة طافية الفيروسية، 4 ميليلتر من بوليبريني (الأسهم: 2 مغ/مل) و 10 نانوغرام/مل من م-IL3 في صفيحة زراعة الأنسجة 6-جيدا. تأكد من تضمين غير مصاب جيدا مع 1.5 مل من وسائل الإعلام بدلاً من المادة الفيروسية طافية كعنصر تحكم.
      ملاحظة: ينبغي أن تتوافق مع كمية المادة طافية الفيروسية إضافة إلى تعدد العدوى (وزارة الداخلية) < 1.
    5. الطرد المركزي اللوحة في 440 x ز لمدة 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    6. تأخذ اللوحة من أجهزة الطرد المركزي ووضع في حاضنة2 CO 37 درجة مئوية و 5% والسماح لتنمو بين عشية وضحاها.
    7. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا بعد 24 ساعة، وريسوسبيند مع 5 مل الإعلام الحارة الطازجة في لوحة 6-جيدا.
  3. تحديد الخلايا المصابة Cas9
    1. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا وريسوسبيند مع وسائل الإعلام الحارة الطازجة وتستكمل مع 5 ميكروغرام/مل من بلاستيسيدين، سبينفيكشن بوست ح 48.
    2. حدد الخلايا لمدة 9 أيام مع بلاستيسيدين أو حتى مات بالخلايا مصابة التحكم (السلبية).
    3. بمجرد اكتمال التحديد، نقل خلايا مقاومة إلى المتوسطة مع تركيز أقل من بلاستيسيدين.

6-مراسل المقايسة ل Cas9 نشاط15

  1. ترانسدوسي الأبوية الخلايا والخلايا ستابلي معربا عن Cas9 مع بكسبر-011 بالإصابة لينتيفيرال (انظر الخطوات 5، 1-5، 2).
    ملاحظة: يتضمن هذا ناقل بروتينات فلورية خضراء ودليل استهداف بروتينات فلورية خضراء. الخلايا التي تحتوي على Cas9 النشطة سوف يسفر عن خفض للتجارة والنقل (الشكل 2).
  2. حدد الخلايا لمدة 3 أيام مع 2 ميكروغرام/مل من بوروميسين، سبينفيكشن بوست ح 48.
  3. تحليل العينات للتعبير التجارة والنقل من خلال التدفق الخلوي.
    ملاحظة: تمثل التجارة والنقل تخفيض 50% أو أكثر الأمثل Cas9 النشاط. أعلى تركيز لاختيار بلاستيسيدين يمكن أن تستخدم لزيادة نشاط Cas9 إذا كان أقل من لوحظ انخفاض بنسبة 50%. ليس كل من خطوط الخلايا يمكن أن يتسامح مع التحديد بلاستيسيدين. وفي هذه الحالة، قد يلزم استخدام ناقلات Cas9 مع أشرطة مختارة أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتسامح مع خطوط الخلايا ليس كل تعبير مستقر من Cas9. وفي هذه الحالة، قد يستخدم تعداء عابرة من Cas9.

7-سبينفيكشن سجرناس في Cas9 التعبير عن خلايا

  1. اتبع الخطوات 5.1 5.2 للإصابة لينتيفيرال من سجرناس إلى خلايا ذات الاهتمام.
    ملاحظة: في الخطوة 5.1.3، يستعاض عن بناء pLX_TRC311-Cas9 ببناء لينتيجويدي-بورو التحقق من صحة من الباب 4.
  2. ح 48 وظيفة سبينفيكشن، قم بتحديد الخلايا لمدة 3 أيام مع 2 ميكروغرام/مل من بوروميسين.
  3. نقل الخلايا مقاومة للمتوسطة مع تركيز أقل من المضادات الحيوية ومتابعة التحديد لآخر 4 أيام للسماح بتحرير كافية.

8-با/F3 التحول الخلوي والتحديد الإيجابي باستخدام سحب م-IL3

ملاحظة: هذا التحليل هو وصف لشركة مالونغوشي-3 الخلايا با/F3 التابعة ولكن يمكن تطبيقه على أي خط الخلية التابعة سيتوكين.

  1. تدور أسفل أضعافاً مضاعفة زراعة الخلايا با/F3 معربا عن اكتوبيكالي Cas9 وسجرنا للفائدة.
  2. نضح المادة طافية وغسل الخلايا مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  3. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا وكرر الخطوة يغسل في 8.2 أربع مرات (هذه الخطوة يضمن أن وسائل الإعلام الحرة لايل--3).
  4. نضح في برنامج تلفزيوني وريسوسبيند الخلايا في 5 مل وسائط جديدة بدون إيل-3.
  5. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو هو محلل بقاء خلية.
  6. بذور الخلايا في ثلاث نسخ في صفيحة زراعة الأنسجة 6-جيدا بتركيز 1 × 105 خلايا/مل في إجمالي حجم 2 مل وسائط جديدة بدون إيل-3.
  7. رصد وحساب الخلايا كل يومين لمدة 8 أيام.
    ملاحظة: يموت با/F3 الخلايا التي تفتقر إلى إيل-3 عادة بعد 2 أيام المجاعة إيل-3. من المهم تضمين عنصر تحكم سلبية في مقايسة (عادة ما يتم استخدام دليل عدم استهداف كعنصر تحكم).

9-الكشف عن كريسبر على هدف التحرير

  1. تصميم كريسبر فحص كبسولة تفجير المنبع والمصب في موقع الانقسام سجرنا
    ملاحظة: استخدم bp الإشعال على الأقل 100 من موقع الانقسام والمتنبأ بها لضمان الكشف عن أن لا يتأثر بالإدراج الكبيرة و/أو الحذف (إينديل) في موقع الهدف سجرنا.
  2. عزل الحمض النووي (جدنا) من الخلايا المحولة (في نهاية منحنى النمو) ومن الخلايا سيتوكين قبل الانسحاب.
    ملاحظة: تشمل دائماً الخلايا overexpressing دليل عدم استهداف كعنصر تحكم التحرير الجينات. عزل جدنا من الخلايا قبل وبعد سيتم تحديد النسخ التي تم تحديدها في صورة إيجابية للتحول وتتمتع بميزة التكاثري.
  3. تجميع من 50 ميليلتر بكر مع المكونات التالية: 25 ميليلتر من مزيج x PCR 2، 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر)، 1 ميليلتر لعكس التمهيدي (10 ميكرومتر)، 50-100 نانوغرام من جدنا، وح2س ما يصل إلى 50 ميليلتر.
    ملاحظة: يمكن استخدام عديدة عالية الدقة [بولمرس] في الخطوة 9، 3.
  4. تشغيل عينات في ثيرموسيكلير استخدام المعلمات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 30 دورات (94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 52 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 s)، و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بكر هذا هو الأمثل للإشعال كالر المدرجة في الجدول 3. تحسين ظروف PCR لزوج التمهيدي المصممة في خطوة 9.1 استناداً إلى اختباره على جدنا.
  5. تشغيل 5 ميليلتر من العينات 2% [اغروس] هلام في 10 V/سم x 1 تريس-خلات-يدتا (تاي) المخزن المؤقت باستخدام. فحص عينات للوجود/عدم وجود عصابة تضخيم المقابلة في الحجم للجينات للفائدة.
  6. استخدام باقي رد بكر (45 ميليلتر) لإجراء تنقية PCR.
  7. استنساخ أمبليكونس مع بكر استنساخ عدة إلى ناقل بلازميد. على سبيل المثال، تستخدم عادة ناقلات بجيم تي-سهلة.
  8. تحويل بلازميد Stbl3 الخلايا أو الخلايا متوافقة ولوحة على لوحات أجار رطل مع المضادات الحيوية ذات الصلة الأخرى. حدد 10-20 المستعمرات، الإعدادية مصغرة كل منها، وإخضاع كل استنساخ سانغر التسلسل لتوصيف إينديلس التي تم إنشاؤها من تحرير كريسبر/Cas9.
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، تحرير خلية واحدة fluorescence تنشيط خلية يمكن إجراء الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) في معظم السكان عزل استنساخ مع إينديل محددة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الجيل التالي التسلسل (خ ع) أساليب كمياً أكثر قوة على هدف التحرير باستخدام تسلسل عميق من بكر أمبليكونس التي تغطي المنطقة المستهدفة سجرنا. على سبيل المثال، يمكن استخدام "تعقب إينديلس" بالتحلل أو المد بدلاً من سوبكلونينغ لدقة تحديد الطيف وتواتر حدوث طفرات المستهدفة التي تم إنشاؤها في مجموعة من الخلايا (https://tide.nki.nl/#about)16.

النتائج

باستخدام الطريقة المبينة هنا، والهدف من هذه التجربة دراسة الآثار الفنية لاستحداث الطفرات إينديل على محور كالر الذاتية على تحول الخلايا المكونة للدم. يستخدم النظام كريسبر/Cas9 كأداة لخلق الذاتية كالر الطفرات في الخلايا با/F3. سجرناس اثنين تم اختيارها لاستهداف إكس...

Discussion

هنا نظهر استخدام تحرير الجينات كريسبر/Cas9 لدراسة الوظيفة البيولوجية كالر الطفرات في الخلايا المكونة للدم. أن نجاح هذا البروتوكول يعتمد اعتماداً كبيرا على عوامل متعددة. أولاً، من المهم أن نعرف ما هي أنواع الطفرات قد تكون مسؤولة عن النمط الظاهري الذي هو المطلوب. في هذا البروتوكول، قراء?...

Disclosures

لدينا لا تضارب في المصالح المتصلة بهذا التقرير.

Acknowledgements

كان يدعمها هذا العمل في المعاهد الوطنية للصحة (R01HL131835)، وعلى جائزة رونيون ديمون محقق السريري واتحاد السرطان ستار.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BsmBINew England BiolabsR0580L
BlasticidinSigma Aldrich15025
PuromycinLife TechnologiesA1113803
Stbl3 cellsLife TechnologiesC737303
TransIT-LT1Thermo Fisher ScientificMIR2300
Opti-MEMLife Technologies51985034
RPMIThermo Fisher ScientificMT10040CV
DMEMThermo Fisher Scientific10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Omega ScientificFB-11
Penicillin/streptomycin/L-glutamineLife Technologies10378016
mIL-3Peprotech213-13
psPAX2AddgeneN/A
pCMV-VSV-GAddgeneN/A
pLX_TRC311-Cas9AddgeneN/A
polybreneSigma AldrichH9268
pXPR-011AddgeneN/A
Phosphate Buffered Saline (PBS)Genessee Scientific25-507
TAE bufferThermo Fisher ScientificFERB49
LentiGuide-PuroAddgenePlasmid #52963
PNKNew England BiolabsM0201S
T4 ligaseNew England BiolabsM0202S
PCR purification kitQiagen28104
Miniprep kitQiagen27104

References

  1. DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
  2. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
  3. Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
  4. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  6. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
  7. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  8. Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
  9. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  10. Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
  11. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
  12. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
  13. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  14. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
  15. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
  16. Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
  17. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
  18. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
  19. Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
  20. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
  21. Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
  22. Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131 Cas9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved