JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذه المخطوطة بروتوكول موحد مفصلة لتسلسل الرنا الريباسي amplicon الفائق 16S. ويدخل البروتوكول بروتوكولا المتكاملة ويرتدون الزي العسكري ومجدية وغير مكلفة بدءاً من جمع عينات البراز من خلال تحليل البيانات. ويتيح هذا البروتوكول تحليل عدد كبير من العينات مع المعايير الصارمة والعديد من عناصر التحكم.

Abstract

ميكروبيومي المعوية البشرية تلعب دوراً مركزياً في حماية الخلايا من الضرر، وفي تجهيز الطاقة والمواد الغذائية، وفي تعزيز الحصانة. خروج ما يعتبر تكوين صحي الحجمية (ديسبيوسيس) قد تنال من الوظائف الحيوية مما يؤدي إلى ظروف مرضية. تم توجيه جهود البحوث الحديثة والجارية نحو توصيف الرابطات بين تكوين الجراثيم وصحة الإنسان والمرض.

التقدم في تكنولوجيا التسلسل الفائق تمكين خصائص تكوين القناة الهضمية الجرثومية. وتشمل هذه الأساليب تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S وتسلسل بندقية. يستخدم تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S التشكيل الجانبي التكوين تصنيفية، بينما التسلسل بندقية يوفر معلومات إضافية حول التنبؤات الجينات والشرح الوظيفي. هو ميزة في استخدام أسلوب تسلسل مستهدفة من منطقة متغير مورثة الرنا الريباسي 16S تكلفة أقل بكثير مقارنة بتسلسل بندقية. اختلاف تسلسل الجين الرنا الريباسي 16S تستخدم كبصمات الأصابع الميكروبية لتعريف وتحديد كمية الأصناف المختلفة داخل نموذج فردية.

جندت الجهود الدولية الرئيسية المعايير لتسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S. ومع ذلك، العديد من الدراسات تقرير مصدر مشترك للتباينات الناجمة عن تأثير دفعة. لتقليل هذا التأثير، يرتدون الزي العسكري بروتوكولات لجمع العينات، المعالجة، وتسلسل يجب أن تنفذ. ويقترح هذا البروتوكول دمج البروتوكولات المستخدمة على نطاق واسع بدءاً من جمع عينات البراز لتحليل البيانات. ويشمل هذا البروتوكول نهج مباشر-بكر خالية من الأعمدة، التي تمكن من معالجة متزامنة واستخراج الحمض النووي لعدد كبير من عينات البراز، جنبا إلى جنب مع [بكر] تضخيم المنطقة V4. وبالإضافة إلى ذلك، يصف خط الأنابيب تحليل البروتوكول ويوفر برنامج نصي باستخدام أحدث إصدار من قييمي (قييمي 2 النسخة 2017.7.0 و DADA2). ويهدف هذا البروتوكول خطوة بخطوة لتوجيه الراغبين في بدء استخدام تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S بطريقة قوية، والإنجاب، وسهلة الاستخدام، ومفصلة.

Introduction

كما بذلت جهود مركزة لتحسين فهم التنوع ميكروبيومي والوفرة، كجانب آخر من التقاط الاختلاف والتشابه بين الأفراد في ظروف صحية ومرضية. 2،سن3والجغرافيا4، نمط الحياة5،6، والمرض5 عرضت أن تكون مقترنة بتكوين ميكروبيومي القناة الهضمية، ولكن العديد من الشروط والسكان لم تماما وتتميز. مؤخرا قد أفيد أنه يمكن تعديل ميكروبيومي للتطبيقات العلاجية7،،من89. ولذلك، أفكاراً إضافية في العلاقة بين مختلف الظروف الفسيولوجية وتكوين الجراثيم هو الخطوة الأولى نحو الاستغلال الأمثل للتعديلات المستقبلية المحتملة.

الأساليب التقليدية الثقافة الميكروبية محدودة بسبب انخفاض حجم الغلة10،11، وتصور كدولة ثنائية فيها بكتيريا أما الموجودة في القناة الهضمية أو لا. تسلسل الحمض النووي القائم الفائق ثورة الإيكولوجيا الميكروبية، تمكن القبض على جميع أعضاء المجتمع الميكروبية. ومع ذلك، قراءة تسلسل طول ونوعية ما زالت حواجز كبيرة أمام تصنيف دقيق التعيين12. وعلاوة على ذلك، قد تعاني الفائق استناداً إلى تجارب من آثار دفعة، حيث تتأثر القياسات بالمتغيرات غير البيولوجية أو غير العلمية13. في السنوات الأخيرة، وضعت عدة برامج لدراسة ميكروبيومي البشري، بما في ذلك المشروع "الأمريكي القناة الهضمية"، وهذا المشروع ميكروبيومي البشرية في "الولايات المتحدة" (الولايات المتحدة)، ومشروع ميتاهيت "المملكة المتحدة" (المملكة المتحدة). وقد ولدت هذه المبادرات كميات هائلة من البيانات التي لا يمكن مقارنتها بسهولة بسبب الافتقار إلى الاتساق في النهج التي تتبعها. حاولت مجموعة متنوعة من مشاريع دولية مثل الاتحاد الدولي ميكروبيومي البشرية، والمشروع "المعايير الدولية ميكروبيومي البشرية"، والمعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) لمعالجة بعض هذه القضايا14 ، ووضعت معايير لقياسات ميكروبيومي التي ينبغي أن تمكن من تحقيق النتائج الإنجابية يمكن الاعتماد عليها. الموصوفة هنا بروتوكول متكامل عن الأساليب المستخدمة على نطاق واسع عدة15،16 ل 16S الرنا الريباسي الفائق التسلسل (16-seq) بدءاً من جمع عينات البراز من خلال تحليل البيانات. البروتوكول يصف نهج بكر خالية من الأعمدة، صممت في الأصل لاستخراج مباشرة من النبات الحمض الخلوي الصبغي16، تمكين المعالجة متزامنة من إعداد كبيرة من البراز العينات في فترة زمنية قصيرة نسبيا ذات جودة عالية تضخيم الحمض النووي لاستهداف ترتيب المنطقة V4 المتغير الميكروبية على منصة تسلسل مشتركة. ويهدف هذا البروتوكول إلى توجيه العلماء المهتمين في بدء استخدام تسلسل الرنا الريباسي amplicon 16S بطريقة قوية، والإنجاب، وسهلة الاستخدام، ومفصلة، باستخدام عناصر هامة. وجود بروتوكول المصحوبة بمرشدين ومفصلة خطوة بخطوة يمكن تقليل تأثير دفعة وهكذا سوف تسمح نتائج التسلسل أكثر قابلية للمقارنة بين مختبرات.

Protocol

منحت الموافقة الأخلاقية للدراسة من "اللجنة المحلية لأخلاقيات البحوث شيبا" وأجريت جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والأنظمة. الواردة البروتوكول باستثناء موافقة مريض من "مجلس المراجعة الأخلاقية" المحلية، منذ المواد البرازية التي استخدمت كانت قدمت بالفعل إلى قلب الأحياء الدقيقة كجزء من workup السريرية ودون معلومات المريض شخصية عدا العمر، بين الجنسين، والنتائج الميكروبية. كتب، كان الحصول على الموافقة المستنيرة من المتطوعين صحية ووافق "المجلس الاستعراض المؤسسي" الدراسة. بعض من تلك العينات قد أدرجت بالفعل في تحليل سابق1.

1-نموذج معالجة

  1. جمع حوالي 5 مم2 لطاخة (حجم ممحاة قلم الرصاص تقريبا) من عينة البراز الطازج مع مسحه معقمة في اختبار أنبوب (انظر الجدول للمواد). تخزين جميع مسحات تحتوي على عينات البراز في-80 درجة مئوية خلال 24 ساعة. مسحات البراز يمكن أن يبقى هناك حتى مزيد من المعالجة.

2. استخراج الحمض النووي

  1. ذوبان الجليد استخراج وتمييع الحلول في درجة حرارة الغرفة (انظر الجدول للمواد).
  2. نقل أنبوب مسحه البراز إلى مجموعة فارغة 2 مل (انظر الجدول للمواد). ضبط حجم عصا مسحه بقطع من استخدام مقصات نظيفة لتمكين إغلاق أنبوب مع التلوث عبر الحد الأدنى. إضافة 250 ميكروليتر من استخراج الحل لكل أنبوبة جمع تتضمن مسحه البراز ودوامه لمزيج.
  3. الحرارة العينات لمدة 10 دقائق في حمام الماء مغلي (95 – 100درجة مئوية). إضافة 250 ميكروليتر من تمييع الحل لكل عينة ودوامه المزيج.
  4. تخزين أنابيب 2 مل تحتوي على الحمض النووي المستخرج والمسحة في 4 درجات مئوية.

3-بكر وإعداد المكتبة

لخطوات 3.1 و 3.2، العمل في محطة عمل PCR نظيفة، ويوفر بيئة خالية من قالب وأمبليكون.

  1. قم بتسمية كبسولة تفجير (الجدول 1) وفقا لما الباركود. تمييع كل التمهيدي في المياه المقطرة مزدوجة (دو) إلى 50 ميكرومتر تركيز ومخزن في-20 درجة مئوية.
  2. استخدام لوح 96-جيدا لردود الفعل PCR. يمكن أن تحتوي كل لوحة على عينات مختلفة 32، التي هي معلم من 32 فهرس مختلف الإشعال. ذوبان الجليد التمهيدي إلى الأمام والإشعال عكس 32 في درجة حرارة الغرفة وتمييع لهم إلى 5 ميكرومترات.
  3. إعداد يمزج تفاعل PCR لردود الفعل 100 (ستكون وحدة التخزين النهائي في كل بئر 20 ميكروليتر) عن طريق خلط 100 ميكروليتر من 5 ميكرومترات التمهيدي إلى الأمام ومزيج سيد بكر X 1 مل 2 ميكروليتر 400 دو. وضع 15 ميكروليتر من هذا المزيج بكر في كل بئر (مجموع الآبار 96). إضافة ميكروليتر 1 من كل 5 ميكرومترات عكس التمهيدي المفهرسة إلى 3 آبار مختلفة (32 كبسولة تفجير مختلفة في تريبليكاتيس يعطي مجموعة آبار 96).
  4. في منطقة مخصصة قبل-بكر، مقعد نظيفة هو القالب و amplicon مجاناً، بمعنى إضافة ميكروليتر 4 لكل عينة الحمض النووي المستخرج للخلائط رد فعل (كل عينة الحمض النووي المستخرج يتم تضخيمه في ثلاث نسخ – 32 عينات كل لوح 96-جيدا).
  5. تشغيل PCR مع الإعدادات التالية: تمسخ الأولى 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ تليها دورات 35 من تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة دقيقة 1، الصلب في 55 درجة مئوية، 1 دقيقة، والتمديد في 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ وتمديد نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. على مقاعد البدلاء مختلفة، التي سيتم تعريفها بأنها منطقة بكر وظيفة مخصصة، تجمع بين كل تفاعل PCR ثلاث في أنبوب حجم واحد (ميكروليتر 60 كل عينة).
  7. لتقييم نوعية أمبليكونس بكر، قم بتشغيل ميكروليتر 4 لكل تفاعل PCR جنبا إلى جنب على اثيديوم بروميد الملون 1% [اغروس] هلام. تحت الأشعة فوق البنفسجية للطول الموجي من 260 nm، أمبليكونس الإيجابية ستظهر في على حجم فرقة المتوقعة من شركة بريتيش بتروليوم 375 – 425. وستدرج هذه أمبليكونس فقط في الخطوات اللاحقة.
    ملاحظة: يتم تضخيمه كل عينة في ثلاث، معنى أن كل عينة يتم تضخيمه في 3 ردود PCR مختلفة. عدم رفع مستوى.

4-مكتبة القياس الكمي والتنظيف

  1. من أجل الحصول على بركة اكويمولار تركيز جميع العينات بكر، التحديد الكمي لكل أمبليكون من الحمض النووي مزدوج الذين تقطعت بهم السبل (دسدنا كمياً الكاشف) وصمة الفلورسنت الحمض النووي (انظر الجدول للمواد)، مناسبة للقياس الكمي المتزامنة كبيرة كمية من العينات.
    ملاحظة: نظراً لحجم مجموعة من أمبليكون لبس، يتم استخدام المبلغ الفعلي في نانوجرام لتحميل بتركيز اكويمولار.
  2. ضم 500 نانوغرام لكل عينة في أنبوب واحد، عقيمة. دوامة المزيج.
  3. تشغيل 200 ميكروليتر من المكتبة مجمعة على اثيديوم بروميد الملون 1% [اغروس] هلام. استخراج العصابات bp 375 – 425 من الجل باستخدام مجموعة أدوات استخراج جل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد) والوت المكتبة مجمعة في 80 ميكروليتر دو.
    ملاحظة: يجب أن يكون مكتبة المجمعة الحجم المحدد للحد من منتجات التضخيم غير محددة من المضيف الحمض النووي.
  4. قياس تركيز مكتبة النهائي دسدنا حساسة للغاية الكشف عن مجموعة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة باستخدام (انظر الجدول للمواد). قياس حجم مكتبة دقيقة باستخدام مجموعة أدوات الفصل والتحليل حساسة للغاية لمكتبات الحمض النووي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).

5-التسلسل

  1. تمييع مكتبة المجمعة إلى 07:00 م مع إضافة مكتبة التحكم 20% (انظر الجدول للمواد)، ووفقا لبروتوكول جهاز التسلسل.
  2. للتسلسل، اقرأ استخدام مخصص تصميم الإشعال التي مجانية للإشعال التضخيم V4 (انظر الجدول 1).
  3. دورة (انظر الجدول 1) التمهيدي تسلسل مخصصة مصممة باستخدام ثالث أن يقرأ الباركود في إضافية ويولد يقرأ إقران نهاية القواعد 175 في الطول في كل اتجاه، وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
  4. تشغيل جهاز التسلسل، والحصول على ملفات فستق وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.

6-معالجة البيانات

  1. غرزة معا، ومعالجة الملفات فستق نهاية إقران المتداخلة في خط أنابيب curation بيانات التي نفذت في الإصدار 2017.7.0 كيم 217. ديمولتيبليكس على ما يلي وفقا لنموذج محدد الرموز الشريطية.
  2. استخدام DADA218 لمراقبة الجودة والتسلسل في الكشف عن البديل (SVs). اقتطاع ما يلي في القواعد 13 من النهاية 3 'وقواعد 15 من 5' نهاية، تجاهل يقرأ مع الأخطاء المتوقعة أكثر من 2. تحديد وإزالة التركيبات استخدام أسلوب توافق الآراء – الكشف عن التركيبات في عينات فردية، ويتم إزالة تسلسل العثور على تشيميريك في جزء كاف من العينات.
  3. إجراء تصنيف تصنيفية SVs استخدام مصنف "بايز ساذج" مزودة، تدريب على 2013 أغسطس الهوية 99% جرينجينيس قواعد البيانات،6ل 175 طويلة يقرأ والإمام/عكس التمهيدي تعيين.
  4. راريفي جميع العينات إلى عمق تسلسل 2,146.
  5. استخدام "أونيفراك غير مرجحة" لقياس التنوع β (بين العينة التنوع19،20) على عينات مخلخل، لتجنب تأثير حجم عينة.
  6. استخدام مصفوفة المسافة الناتجة لإجراء تحليل إحداثيات رئيسية (بكوا).
    ملاحظة: يتم توفير ملفات البرنامج النصي ورسم الخرائط ذات الصلة معالجة البيانات كمواد تكميلية (التكميلي المواد 1 و 2).

النتائج

ويرد في الشكل 1مثالاً تخطيطي للبروتوكول.

قد جمعنا مقدما عينات البراز من المرضى في المستشفيات مع الإسهال المعدية المشتبه فيهم. وقدمت هذه العينات إلى "مختبر الميكروبيولوجيا السريرية" في مركز شيبا الطبي بين شباط/فبراير وأيا?...

Discussion

16S الرنا الريباسي-أمبليكون وتسلسل بندقية metagenomics اكتسبت شعبية في الميكروبيولوجيا السريرية التطبيقات21،22,23. هذه التقنيات مفيدة في زيادة القدرة على التقاط الأصناف كولتورابل وغير كولتورابل، توفير بيانات عن الوفرة النسبية للعدوى المسببة للمرض، وقدرتهم على تح?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

بتأييد هذا العمل جزئيا بالبرنامج الأساسية (المنح رقم 41/11)، ومؤسسة العلوم إسرائيل (منحة رقم 908/15)، وكرون الأوروبية والمنظمة التهاب القولون (إيكو).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PrimersIntegrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solutionSigma-AldrichE7526
Dilution solutionSigma-AldrichD5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kitInvitrogenP7589dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kitQiagen28606
AgaroseAmresco0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase FreeBiological Industries01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kitMolecular probesQ32854dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000Agilent TechnologiesScreen Tape 5067-5582separation and analysis
Screen Tape AssayAgilent TechnologiesReagents 5067-5583for DNA libraries
PhiX Control v3Illumina15017666control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003
Ethidium BromideAmrescoE406-10mL-TAM
2 mL collection tubesSARSTEDT72.695.400Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tubeSTERILE INTERIOR23117
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR MachineApplied Biosystems2720 Thermal Cycler
Sequncing MachineIlluminaMiseq
PCR workstationBiosanUV-cleaner
scissors
vortexerScientific IndustriesVortex-Genie 2

References

  1. Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088 (2017).
  2. De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
  3. Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
  4. Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050 (2015).
  5. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  6. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
  7. Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
  8. Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
  9. Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
  10. Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
  11. Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
  12. Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
  13. Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
  14. Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
  15. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
  16. Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
  17. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  18. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  19. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
  20. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
  21. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617 (2015).
  22. Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
  23. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
  24. Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226 (2013).
  25. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133 16S V4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved