JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذا التقرير وضع بروتوكول لقياس المستويات المطلقة لميرنا البلازما، استخدام النسخ العكسي في الوقت الحقيقي الكمي PCR مع أو بدون تضخيم ما قبل. هذا البروتوكول يتيح فهم أفضل لكمية ميرناس البلازما ويسمح التقييم النوعي للبيانات المناظرة من دراسات مختلفة أو المختبرات.

Abstract

RT-قبكر واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً لتقييم ميرناس الهدف الفردي. يتم قياس مستويات ميرناس عموما بالنسبة إلى عينة مرجعية. وهذا النهج مناسبة لدراسة التغيرات الفسيولوجية في مستويات التعبير الجيني المستهدف. ومع ذلك، الكمي المطلق أفضل من التحليل الإحصائي باستخدام الأفضل لإجراء تقييم شامل لمستويات التعبير الجيني. القياس الكمي المطلق هو ما زالت لا في الاستعمال الشائع. ويصف هذا التقرير وضع بروتوكول لقياس المستويات المطلقة لميرنا البلازما، استخدام الرايت قبكر مع أو بدون ما قبل التضخيم.

أعدت وحدة تخزين ثابتة (200 ميليلتر) يدتا-البلازما من الدم التي تم جمعها من هذا السياق فخذي قرود سينومولوغوس واعية (n = 50). تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع تستخدم نظام متاح تجارياً. تم قياس كمية ميرناس البلازما بفحوصات قبكر RT المستندة إلى التحقيق الذي يتضمن ميرنا على حدة إلى الأمام/عكس PCR التمهيدي والتحقيق. المنحنيات القياسية للقياس الكمي المطلق تم إنشاؤها باستخدام النوكليوتيد الحمض النووي الريبي الاصطناعية المتاحة تجارياً. اصطناعية cel-مير-238 كعنصر تحكم خارجي لتقييم جودة والتطبيع. ميرناس أن أظهر تقدير القيم دورة (Cq) أعلاه 35 تم تضخيم مسبقاً قبل الخطوة qPCR.

بين ميرناس 8 التي درست، مير-122 و 133a مير مير-192 كانت قابلة للكشف دون ما قبل التضخيم، حين مير-1، مير-206، ومير-499a المطلوبة قبل التضخيم بسبب مستويات منخفضة من التعبير. مير-208a ومير-208b لا يمكن كشفها حتى بعد ما قبل التضخيم. وجرى تقييم كفاءة تجهيز العينة بقيم Cq ارتفعت cel-مير-238. في هذا الأسلوب المقايسة، والتغير التقني قدرت بأقل من 3-fold والحد الأدنى للقياس الكمي (للوق) نسخة2 10/ميليلتر، بالنسبة لمعظم من ميرناس النظر.

هذا البروتوكول يوفر تقدير أفضل لكمية ميرناس البلازما، ويسمح لتقييم نوعية البيانات المناظرة من دراسات مختلفة. وأعرب عن النظر في انخفاض عدد ميرناس في سوائل الجسم، قبل التضخيم مفيد لتعزيز الكشف عن سوء ميرناس.

Introduction

تم استكشاف ميكرورناس (ميرناس) كالمؤشرات الحيوية للتشخيص والتشخيص لأمراض السرطان، عدد متزايد من الدراسات أو الرصد والكشف عن الأمراض الأخرى في الدراسات السريرية و nonclinical1،2،3 . الكمية في الوقت الحقيقي النسخ العكسي بكر (RT-qPCR) إحدى الطرق الأكثر شيوعاً المستخدمة لتقييم ميرناس الهدف الفردي، لأن هذا الأسلوب أكثر حساسية من ميكرواري4 وتسلسل الحمض النووي الريبي القائمة على منصات5. بشكل عام، يتم قياس التعبير ميرنا مقارنة بعينه مرجعية باستخدام أسلوب ΔCq6. وهذا النهج مناسبة للتحقيق في التغيرات الفسيولوجية في مستويات التعبير الجيني المستهدف. ومع ذلك، محدودة الكمي النسبي لتعميم ميرناس الأداة المساعدة بسبب تلك الكميات الصغيرة. وباﻹضافة إلى ذلك، الاختلاف التقني يجعل من الصعب مقارنة النتائج من الدراسات المختلفة، لأن تخصيص مختبرات مختلفة البروتوكولات التجريبية RT-قبكر بطريقة مختلفة، الأمر الذي يؤدي إلى غير متناسقة أو نتائج متناقضة حتى من 7من دراسات مختلفة.

وفي ضوء الشواغل المذكورة أعلاه، قد يكون القياس الكمي المطلق أكثر مناسبة لتقييم كميات صغيرة من ميرناس في سوائل الجسم. يستخدم الأسلوب الكمي المطلق منحنى المعياري المتولدة من تركيزات معروفة من النوكليوتيد الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية متطابقة في تسلسل إلى المقابلة ميرنا الهدف8. الصحة، ومعهد العلوم البيئية (هيسي) اللجنة التقنية المعنية بعلم الجينوم أجرت مؤخرا دراسات شاملة لمقارنة نتائج القياسات المطلقة للبلازما ميرناس، عبر مواقع اختبار متعددة. وأظهرت النتائج أن استخدام بروتوكول قياسي للمطلقة كوانتيتيشن من ميرناس إلى نتائج قابلة للمقارنة عبر مواقع اختبار متعددة9. RT-qPCR المقايسة الطريقة الموضحة في هذه الدراسة مطابق تقريبا لبروتوكول قياسي هيسي، الذي يتضمن تحليل متعدد لميرنا أهداف متعددة، والتضخيم السابقة للمساعدة في الكشف عن ميرناس التعبير منخفضة.

في هذه الدراسة، حجم ثابت (200 ميليلتر) يدتا-البلازما من الدم التي تم جمعها من المنطلق فخذي قرود سينومولوغوس واعية (n = 50) كانت تستخدم10. البروتوكول التالي يصف الإجراءات لإعداد عينات البلازما، واستخراج ميرنا، و RT-قبكر، بما في ذلك ما قبل التضخيم. الأهم من ذلك، معلومات تقنية إضافية حول البروتوكول قد أدرج، حيث أنه يمكن أن يتم التحقق من صحة كمية ميرناس المستهدفة في العينات في تركيبة مع عملية المؤهلين تأهيلاً جيدا. أولاً، تم التحقق من صحة المنحنى المعياري لكل ميرنا لنطاق الكشف الفردية، قبل القياس الكمي في العينات البيولوجية. ثانيا، تم تقييم جودة المنهجية الحالية صورة شاملة عن طريق الاستبيان المفاهيمي قيم عنصر تحكم خارجي (cel-مير-238). ولذلك، هذا المنبر غلة أكثر من بيانات موثوق بها ومفيدة لمقارنة النتائج من دراسات مختلفة أو المختبرات.

لمحات ميرناس 8 قد أدرجت في هذا التقرير كنتائج تمثيلية من أسلوب الفحص الموضحة هنا. وقد اقترحت هذه ميرناس كما المحتملة سلامة المؤشرات الحيوية المرتبطة بإصابة الأنسجة إلى الكبد (مير-122 ومير-192)، القلب (مير-1 ومير-208a، مير-208b ومير-499a)، والهيكل العظمى والعضلات (133a مير ومير-206) في القوارض والبشر3، 11،،من1213.

Protocol

وقد أقر جميع التجارب برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة دايتشي سانكيو المحدودة

1. إعداد نموذج

  1. جمع الدم (يقل عن 0.5 مل) من هذا السياق فخذي قرود سينومولوغوس في الأنابيب التي تحتوي على 2 ك يدتا.
    ملاحظة: سترات والهيبارين غير مقبولة لأن تكبح هذه التخثر اللاحقة بكر14،15.
  2. وضع العينات التي تم جمعها فورا على الجليد وعملية لعزل البلازما خلال ساعتين جمع.
  3. الطرد المركزي في عينات 10,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. نقل المادة طافية في microtube 2 مل، متبوعاً بالطرد المركزي في س 16,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام خلية والصفائح الدموية المتبقية.
    ملاحظة: القياس الكمي ميرناس يمكن أن تتأثر إلى حد كبير بالصفائح الدموية تلوث16.
  5. ضع 200 ميليلتر مختبرين للمادة طافية في مل 2 جديدة-microtubes، وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: يتم استخدام وحدة تخزين ثابتة لكل عينة لاستخراج الحمض النووي الريبي؛ ولذلك، يجب أن يكون حجم قاسمة الضبط.

2. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. ذوبان الجليد عينات مجمدة في الجليد (من الخطوة 1، 5).
    1. تبقى عينة الباردة على الجليد أثناء استخراج الحمض النووي الريبي. البرد الكاشف تحلل وكلوروفورم على الجليد قبل الاستخدام.
  2. إضافة 5 مجلدات (1000 ميليلتر) لكاشف تحلل، تتضمن حل أحادي الطور isothiocyanate الفينول وغوانيدين، للعينة (200 ميليلتر)، ومزيج بشدة من فورتيكسينج لمدة 1 دقيقة.
  3. إضافة 5 ميليلتر 5 نانومتر الاصطناعية ميرنا ايليجانس كاينورهابديتيس (Syn-سل-مير-238-3 ع).
  4. إضافة إلى حجم 1 (200 ميليلتر) كلوروفورم، ومزيج قوة من فورتيكسينج لمدة 1 دقيقة.
  5. الحفاظ على الجليد لمدة 2 إلى 3 دقائق ومن ثم الطرد المركزي هذه العينات في 12,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. نقل المرحلة المائية بعناية إلى microtube جديدة.
    ملاحظة: لا يتم تحويل أي من مرحلة العضوية (أحمر) أو الطور البيني (أبيض). ينبغي أن يكون حجم المرحلة المائية التي جمعت موحدة لتجنب التعامل مع التناقض، مما يؤدي إلى زيادة التباين التقني. وكان المبلغ المعتاد من المرحلة المائية المنقولة في هذا البروتوكول ميليلتر 650.
  7. إضافة مجلدات 1.5 (975 ميليلتر) من الإيثانول، ومزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  8. نقل العينة إلى العمود المطابق ومحول، متبوعاً بفراغ التجفيف لمدة 3 دقائق استخدام الفتحات فراغ. إذا كان حجم العينة أكثر من 700 ميليلتر، كرر هذه الخطوة لعملية الحل المتبقية.
    ملاحظة: عزل الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود متوافق مع الأسلوب الفراغ والطرد المركزي.
  9. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول إلى العمود الذي يليه فراغ التجفيف لمدة 1 دقيقة.
  10. إضافة 800 ميليلتر روت المخزن المؤقت إلى العمود الذي يليه فراغ التجفيف لمدة 2 دقيقة.
  11. إضافة 800 ميليلتر RPE المخزن المؤقت إلى العمود الذي يليه فراغ التجفيف لمدة 2 دقيقة.
  12. كرر الخطوة 2.11.
  13. إضافة 300 ميليلتر من الإيثانول إلى العمود الذي يليه فراغ التجفيف لمدة 1 دقيقة.
  14. مكان العمود على microtube جديدة، والطرد المركزي في 12,000 س ز في درجة حرارة الغرفة (15 إلى 25 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة.
  15. نقل العمود إلى microtube جديدة، وإضافة 50 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس.
  16. الوقوف في درجة حرارة الغرفة (15 إلى 25 درجة مئوية) 3 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في ز × 8,000 في درجة حرارة الغرفة (15 إلى 25 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة.
  17. إعادة تطبيق النذرة للعمود.
  18. كرر الخطوة 2، 16، وتخزين النذرة في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3-كدنا التوليف

  1. ذوبان الجليد العينات المجمدة (من الخطوة 2، 18).
  2. إعداد تركيز معلوم من النوكليوتيد الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية التي تتوافق مع الهدف ميرناس.
    1. استخدام الاصطناعية رنا اليغنوكليوتيد لتوليد منحنى قياسي في قبكر. حل الأسهم 1 × 108 نسخة/ميليلتر تركيز مستعدة لأغراض التخزين.
    2. تمييع الحل الأسهم 10 إضعاف للحصول على 1 × 107 نسخة/ميليلتر (عدم تضخيم قبل عينات) أو 1 × 105 نسخة/ميليلتر (عينات قبل تضخيم) العامل الحل كأعلى تركيز لإنشاء المنحنى المعياري. بشكل عام، هو مجموعة مقترحة لتركيزات المنحنى المعياري 1 × 107 إلى 1 × 102 نسخة/ميليلتر (عدم تضخيم قبل عينات) أو 1 × 105 إلى 1 × 100 نسخة/ميليلتر (عينات تضخيم مسبقاً).
  3. إعداد تجمع التمهيدي RT تعدد الإرسال عن طريق خلط كميات متساوية من 20 x RT الإشعال للهدف ميرناس.
    ملاحظة: كما هو مبين في الشكل 2، يمكن إجراء مجموعة تحتوي على 4 تصل إلى الهدف ميرناس بخلط الإشعال RT 20 x لكل من ميرناس في حمام السباحة. يجب تضمين كواحدة من ميرناس المستهدفة في كل أنبوبة cel-مير-238 (عنصر تحكم خارجي). في حالة أقل من 4 ميرناس المستهدفة، إضافة كميات متساوية من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات 1/10 بدلاً من 20 x RT التمهيدي.
  4. إعداد مزيج رد فعل RT: 3 ميليلتر من التمهيدي RT تجمع (من الخطوة 3، 3)، 0.15 ميليلتر من دنتبس 100 ملم مع دتتب، 1 ميليلتر المنتسخة العكسية (50 ش/ميليلتر)، ميليلتر 1.5 10 × RT المخزن المؤقت، 0.19 ميليلتر من رناسي المانع (يو 20/ميليلتر)، وميليلتر 4.16 الحرة نوكلياسي المياه.
  5. ميكس 10 ميليلتر من رد فعل RT مزيج مع 5 ميليلتر من عينات الحمض النووي الريبي (من الخطوة 3.1) أو النوكليوتيد (من الخطوة 3، 2) من بيبيتينج، واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
  6. تشغيل النسخ العكسي على جهاز cycler حرارية: 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، تليها خطوة نهائية عكس المنتسخة المنظمة في 85 درجة مئوية للحد الأدنى 5 عينات يدون عكس مخزن في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4-بريامبليفيكيشن (اختياري)

ملاحظة: ميرناس التي تظهر القيم Cq فوق 35 أو أكثر في قبكر اللاحقة تضخيم مسبقاً.

  1. ذوبان الجليد العينات المجمدة (من الخطوة 3، 6).
  2. جعل الوقت تخفيف المسلسل المنتج RT من النوكليوتيد الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية؛ 1 × 105 إلى 1 × 100 نسخة/ميليلتر لتوليد المنحنى المعياري.
  3. إعداد المقايسة متعدد التمهيدي تجمع عن طريق خلط كميات متساوية (5 ميليلتر) 20 x المقايسة كبسولة تفجير ميرناس المستهدفة مع تركيز كل التحليل التمهيدي يجري المخفف 200-fold النهائي من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات بحجم نهائي في 1,000 ميليلتر.
    ملاحظة: الإشعال الإنزيم ميرناس المستهدفة التي يمكن كشفها في قبكر اللاحقة دون التضخيم السابقة، وتلك الخاصة بالجوف-مير-238 (المراقبة الخارجية) غير مضمنة في تجمع التمهيدي.
  4. إعداد مزيج التضخيم قبل الرد: 12.5 ميليلتر من 2 × كاشف بريامبليفيكيشن جاهزة للاستخدام، 3.75 ميليلتر من التحليل التمهيدي بركة (من الخطوة 4، 3)، وميليلتر 6.25 المياه خالية من نوكلاس.
  5. ميليلتر 22.5 مزيج من التضخيم قبل رد فعل مزيج مع 2.5 ميكروليتر من عينة يدون عكس (من الخطوة 4، 1) أو النوكليوتيد (من الخطوة 4، 2) التي بيبيتينج، واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
  6. تشغيل رد فعل على جهاز cycler حرارية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ تليها دورات 12 من 95 درجة مئوية عن 15 ثانية و 60 درجة مئوية للحد الأدنى 4 تخزين العينات قبل تضخيم في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

5-الكمي PCR الوقت الحقيقي (قبكر)

  1. ذوبان الجليد العينات المجمدة (من الخطوة 3، 6 أو الخطوة 4، 6).
  2. تمييع العينات إضعاف مع الماء المعقم.
  3. إعداد الوقت تخفيف المسلسل المنتج RT المستمدة من النوكليوتيد الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية؛ 1 × 107 إلى 1 × 102 نسخة/ميليلتر (عدم تضخيم قبل عينات) أو 1 × 105 إلى 1 × 100 نسخة/ميليلتر (عينات تضخيم مسبقاً) لتوليد المنحنيات القياسية.
  4. إعداد qPCR رد فعل ميكس: 10 ميليلتر من 2 x كاشف التضخيم جاهزة للاستخدام، 1 ميليلتر من 20 x كاشف المقايسة، تحتوي على الأمام/عكس التمهيدي بكر ومسبار المقابلة لميرنا المستهدفة، و 7 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس.
  5. نقل 18 ميليلتر من مزيج رد فعل qPCR للوحات الضوئية سريعة 96، حسنا فعل، وإضافة 2 ميليلتر من العينات مخففة (من الخطوة 5.2 أو خطوة 5.3) في الآبار.
    ملاحظة: نماذج ومعايير ل qPCR تقام في التكرارات.
  6. ختم اللوحة مع الفيلم لاصقة، والطرد المركزي بإيجاز.
  7. تشغيل الرد على cycler حرارية في الوقت الحقيقي: 95 درجة مئوية 20 ثانية، تليها دورات 45 من 95 درجة مئوية ل 1 s و 60 درجة مئوية 20 s.

6-بيانات التحليل

  1. يتم حساب عدد نسخة أولية لكل عينة باستخدام برامج تحليل البيانات التي تعمل مع المقابلة cycler الحرارية في الوقت الحقيقي.
    ملاحظة: خط عتبة يتم تعيين يدوياً إلى "1.0" في كل الألواح في الدراسة، للتأكد من إمكانية تكرار نتائج المقارنة بهم vales Cq. يتم تعيين مستوى وقف إنتاج المواد الانشطارية في الاستبيان المفاهيمي > دورات 40.
  2. حساب متوسط عدد نسخة أولية لكل عينة من التكرارات.
  3. حساب معامل تصحيح بقسمة عدد نسخ من الجوف-مير-238 في كل عينة متوسط عدد النسخ من الجوف-مير-238 من جميع العينات في أنبوب مقابلة.
    ملاحظة: كما هو مبين في الشكل 2، كل أنبوبة تحتوي على ما يصل إلى 4 ميرناس المستهدفة بما في ذلك سل-مير-238 (عنصر تحكم خارجي). ولذلك، يتم احتساب عامل التصحيح لكل أنبوبة استخدام القيمة المطابقة في الجوف-مير-238.
  4. حساب عدد النسخ المعدلة بقسمة عدد متوسط نسخة أولية لكل عينة (من الخطوة 6، 2) بواسطة عامل التصحيح (من 6.3 خطوة) لكل عينة.
  5. حساب عدد النسخ المطلق بضرب عدد النسخ الخام المعدل لكل عينة (من 6.4 خطوة) بعامل إضعاف لكل عينة.
    ملاحظة: عامل إضعاف وهو "5" في هذا البروتوكول، الذي تم اشتقاقه من 5.2 خطوة.
  6. حساب كفاءات التضخيم بكر من المنحدر المؤامرة من قيم كل تمييع المسلسل ضد سجل كدنا تركيز الاستبيان المفاهيمي.
    ملاحظة: صيغة لحساب الكفاءة؛ E = (10(-1/المنحدر) -1) × 100%.
  7. حساب التباين التقنية باستخدام قيم Cq الجوف-مير-238 من جميع العينات باستخدام الصيغة الإلكترونية = (كفاءة التضخيم x 2)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
    ملاحظة: يتم استخدام الخطوات 6.5 و 6.7 لتقييم الجودة للإجراء.

النتائج

سير العمل للمقايسة ميرنا من الرايت قبكر والجودة أسيسمينر
ويبين الشكل 1 سير العمل للمقايسة ميرنا من عينات الدم باستخدام قبكر10. يمكن التحقق من جودة التجارب بالجوف-مير-238 كعنصر تحكم خارجي. هذا وسوف تكشف عن الاختلافات التقنية في ا?...

Discussion

لدينا تقييم شامل قدم تحليلاً إحصائيا أكثر صرامة على مدى النطاق الديناميكي، الذي يبين بوضوح أن حجم الاختلاف بين العينات الفردية كانت مختلفة للغاية بين ميرناس اختبار. على الرغم من أن هذه الاختلافات يمكن أن يعزى إلى تلك الكميات الصغيرة في سوائل الجسم، تجدر الإشارة إلى أن هذه البيانات تعكس ا?...

Disclosures

وقد صاحب البلاغ لا تضارب في الكشف عن.

Acknowledgements

هذا البحث لم يتلق أي منحة محددة من وكالات التمويل في القطاعات العامة، التجاري، أو عدم الربح.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Microtainer tube (K2EDTA)Becton, Dickinson and Company365974For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mLEppendorf0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mLEppendorf0030120094
Synthetic oligonucleotideHokkaido System Science-Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0)Nippon Gene314-90021TE buffer
Buffer RPEQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWTQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini KitQIAGEN217004
Nuclease-Free Water QIAGEN129114
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic QIAGEN219600ID:MSY0000293, 5 nmol
SC AdaptersTAIGEN Bioscience CorporationS0120For RNA extraction
VacEZor 36 Complete SystemTAIGEN Bioscience CorporationM3610For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific Inc.4351405Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700Thermo Fisher Scientific Inc.9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher Scientific Inc.4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific Inc.4311971
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific Inc.4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit		Thermo Fisher Scientific Inc.4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×)Thermo Fisher Scientific Inc.4391128
Chloroform Wako Pure Chemicals035-02616
Ethanol (99.5)Wako Pure Chemicals057-00456

References

  1. Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
  2. Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
  3. D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
  4. Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
  5. Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
  6. Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
  7. Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
  8. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
  9. Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
  10. Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
  11. Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
  12. Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
  13. Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
  14. Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
  15. Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
  16. Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
  17. Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
  18. Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
  19. Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
  20. Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
  21. Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
  22. Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
  23. Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
  24. Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
  25. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
  26. Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
  27. Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
  28. Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132 qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved