تحديد OTX1 و OTX2 كاثنين من المؤشرات الجزيئية المحتملة للأورام السرطانية سينوناسال و Neuroblastomas حاسة الشم

Summary

هي المورثات هوميوبوكس الجينات التنظيمية التي غالباً ما ترتبط مع الأورام السرطانية في الكائنات الحية الكبار. نحن التحقيق في التعبير عنها مقارنة بالمناعي وتحليل PCR في الوقت الحقيقي، في ماكس العادي والتهاب الآنف والأورام سينوناسال من أجل استخدامها كأهداف تشخيصية وعلاجية ممكنة.

Abstract

يتم التعبير عن المورثات هوميوبوكس (غبطة) أوتكس أثناء morphogenesis الجنينية وتنمية حاسة الشم ظهارة في الكائنات الحية الكبار. وكثيراً ما تتصل بالطفرات التي تحدث في هذه الجينات توموريجينيسيس في الإنسان. لا تتوفر بيانات اليوم فيما يتعلق بالعلاقة الممكنة بين الجينات أوتكس وأورام في تجويف الآنف. والهدف من هذا العمل أن نفهم إذا كان يمكن اعتبار OTX1 و OTX2 الواسمات الجزيئية في تطوير أورام الآنف. اخترنا أدينوكارسينوماس الآنف وسينوناسال للتحقيق في التعبير عن الجينات OTX1 و OTX2 من خلال المناعي وتحاليل PCR الوقت الحقيقي. وتغيب OTX1 و OTX2 في جميع عينات من سينوناسال المعوية من نوع "أدينوكارسينوماس" (إيتاكس). تم تحديد مرناً OTX1 فقط في عدم المعوية "نوع أدينوكارسينوماس" (نيتاكس) في حين أعرب مرناً OTX2 إلا في "نيوروبلاستوماس حاسة الشم" (الوظائف). لقد أظهرنا أن التعبير الجيني التفاضلي للجينات OTX1 و OTX2 قد تكون علامة جزيئية مفيدة للتمييز بين أنواع مختلفة من الأورام سينوناسال.

Introduction

أوتكس غبطة الجينات هي المناظرة الفقاريات الجينات المورفولوجية أورثودينتيكلي (أوتد) وهي ترميز لعوامل النسخ التي عادة ما يتم التعبير عنها أثناء morphogenesis الجنينية، ولكن يمكن أيضا أن أعربوا في الكائن الحي الكبار مع وظائف مختلفة . خلال التطور الجنيني يسيطرون على تحديد هوية الخلية وتمايز الخلية، وتحديد المواقع من axis¹ الجسم. وتشمل الأسرة أوتكس الجينات OTX1 و OTX2 التي تعرض وظائف مختلفة. وتشارك OTX1 في المخ ونمو الأعضاء الحسية. في الكائن الحي الكبار، ويتم التعبير عن في الحواس ويتم نسخها عند مستويات منخفضة في الفص الأمامي من الغدة النخامية²؛ كما أنها تلعب دوراً في هيماتوبويسيس، التي أعرب عنها في pluripotent المكونة للدم و الخلايا السلف³. وتشارك في تطوير الرأس روسترال OTX2 وأفعالها البروتين المترجمة مورفوجين لأنه يولد تدرج من خلال الجينات الأخرى التي هي تنشيط أو قمعت بطريقة الزمانية، مما يسهم في الخلية الانتشار والتفرقة. يوجد OTX2 في الكائن الحي الكبار، وحصرا في الضفيرة والغدة الصنوبرية شرويد⁴.

الطفرات في الجينات أوتكس غالباً ما ترتبط بظهور عيوب خلقية أو جسدية أو الأيض البشري. يمكن أن تعزز الطفرات المكسب أو الخسارة في جينات أوتكس توموريجينيسيس إذا لم تكن قادرة على التحكم بشكل صحيح في النمو و/أو التمايز الخلوي⁵. باللوكيميا والأورام الليمفاوية، وكذلك كما هو الحال في العديد من الأورام الصلبة (مثلاً، ميدولوبلاستوماس⁶، والعدوانية غير هودجكين الأورام الليمفاوية²و سرطانات الثدي⁷، سرطان القولون والمستقيم⁸والشبكيه⁹)، حررت التعبير عن الجينات غبطة أوتكس هي موثقة جيدا¹⁰. وبالإضافة إلى ذلك، أثبتت الطفرات OTX2 في حالات أنوفثالميا وميكروفتالميا¹¹ نظراً للدور الحاسم لهذا الجين في مراقبة التنمية العين.

في السياق الأورام الصلبة، يتم اكتشاف علامات جزيئية والمظهرية تحديا هاما للتصنيف والتشخيص والعلاج للعديد من أنواع الورم¹¹، بما في ذلك تلك التي تنشأ في تجويف الآنف والانفيه الجيوب الأنفية. في الواقع، على الرغم من أن احتلال هذه المناطق فقط مسافة تشريحية متواضعة، ظهارة مخاطية، الغدد، الأنسجة الرخوة، والعظام، والغضاريف أو العصبية/نيوروكتوديرمال، والخلايا هيماتوليمفويد يمكن أن يكون غالباً الموقع لأصل معقدة ومختلفة الأشيع مجموعات من الأورام. أنواع مختلفة من الأورام الخبيثة التي تنطوي على المسالك سينوناسال يقدم مجموعة متنوعة من الميزات التي التغلب على ما يعتبر عادة في المسالك أيروديجيستيفي العلوي أو حتى في جميع أنحاء معظم أجزاء الجسم¹². سينوناسال الأورام الخبيثة نادرة، وتعرض الإصابة سنوية 1: 100.000 نسمة في جميع أنحاء العالم، وحتى يمنع هذا دراسات تتعلق بسبل المشاركة في توموريجينيسيس واختبار استراتيجيات العلاج البديل. وعلى الرغم من ذلك، أوجه التقدم في تقنيات، التصوير النهج الجراحية، والعلاج بالأشعة قد تحسنت الإدارة السريرية لسرطان سينوناسال. وعلاوة على ذلك، وضع خطوط الخلايا، فضلا عن نماذج حيوانية والتنميط الجيني السرطان حاليا تشكل الأساس ل علاجات السرطان المستهدفة مستقبلا¹³. وحتى الآن، لا توجد تقارير بشأن التعبير OTX1 و/أو OTX2 في الأورام تجويف الآنف والجيوب الأنفية والبلعوم الأنفي. نظراً لأننا لاحظنا سابقا أن OTX1 و OTX2 متورطون في سرطان الثدي⁷، تساءلنا إذا هذه الجينات يمكن أن تكون موجودة ليس فقط في الغشاء المخاطي للأنف العادية ولكن أيضا أورام في تجويف الآنف. للوصول إلى هذا الهدف التي حصلنا عليها من قسم علم الأمراض من "سيركولو المستشفى دي" في فاريزي عينات من الغشاء المخاطي الطبيعي، والأنف وسينوناسال أدينوكارسينوماس التي تم جمعها من عام 1985 إلى عام 2012، وتصنف وفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO) تصنيف "أورام العنق" والرأس. أننا نختار لتحليلها من خلال تحليل PCR وإيمونوهيستوتشيميستري في الوقت الحقيقي ونحن تقييم التعبير OTX1 و OTX2 لتحديد إذا كان يمكن اعتبار المؤشرات الجزيئية لهذه الأنواع من الأورام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

جميع الدراسات التي أجريت وفقا لإعلان هلسنكي (1975) كتب الموافقة عن علم، ووافقت عليها "اللجنة الأخلاقية" جامعة إينسوبريا في فاريزي.

1-جمع العينات

1. جمع وتقسيم جميع العينات البشرية Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (فب) إلى مجموعات فرعية مختلفة وفقا لتصنيف منظمة الصحة العالمية ل الرأس والرقبة الأورام¹⁴.
   ملاحظة: هنا استخدمنا العينات التالية: الغشاء المخاطي سينوناسال الطبيعي كعنصر تحكم (10 عينات)؛ الورم الحليمي مقلوب (IP, رمز التصنيف الدولي للأمراض-O 8121/1)؛ سينوناسال إيتاك (رمز التصنيف الدولي للأمراض-O 8144/3، عينات 32)؛ نيتاك (رمز التصنيف الدولي للأمراض-O 8140/3، عينات 12)؛ سرطان غدانيه كيسية (لجنة التنسيق الإدارية، رمز التصنيف الدولي للأمراض-O 8200/3)؛ الورم الحميد بليومورفيك (السلطة الفلسطينية، رمز التصنيف الدولي للأمراض-O 8941/3)؛ على (رمز التصنيف الدولي للأمراض-O 9522/3، 13 عينة)؛ سيئة "سرطان الغدد الصم العصبية متباينة" (بدنيك، رمز التصنيف الدولي للأمراض-O 8041/3، عينات 19)؛ ورم الجهاز الهرموني (صافي، رمز التصنيف الدولي للأمراض-O 8041/3).

2-إيمونوتشيميستري

1. ديبارافينيزيشن والإماهة من أقسام
   1. حرارة شرائح العينة في فرن عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وترطيب 3 ميكرومتر سميكة FFPE الأقسام باستخدام سلسلة الكحول إلى الماء.
   2. بإيجاز، يغسل الشرائح في زيلين نفط لمدة 10 دقائق وكرر هذه الخطوة؛ يغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في الكحول 100% وكرر هذه الخطوة باستخدام الكحول 95%، 85%، و 75% متسلسل. شطف الشرائح لمدة 5 دقائق في الماء المقطر.
2. حظر نشاط الذاتية
   1. حظر نشاط الذاتية عن طريق وضع الشرائح في 3% فوق أكسيد الهيدروجين مائي لمدة 12 دقيقة.
3. استرجاع مستضد
   1. إجراء استرداد مستضد بالتعامل مع 10 ملم سترات المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني 6) لمدة 10 دقائق في علاج ميكروويف.
4. الحضانة مع جسم الأولية
   1. أغسل المقاطع في تبس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4)، ثم إضافة حل حظر لمدة 10 دقائق.
   2. أغسل المقاطع في تبس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4)، ثم إضافة 0.2% X تريتون.
   3. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الماعز الإنسان المضادة OTX2 جسم المخفف 1: 100.
5. الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي
   1. احتضان الفروع ح 1 في درجة حرارة الغرفة مع بيوتينيلاتيد أرنب جسم الماعز المضادة الثانوية المخفف 1: 200 متبوعاً بمجمع ABC-البيروكسيديز (انظر الجداول من المواد).
6. وضع في إيمونوريكشن
   1. وضع إيمونوريكشن استخدام 3، 3 '--ديامينوبينزيديني تيتراهيدروتشلوريدي وكونتيرستين الأنوية مع هاريس الهيماتوكسيلين.
7. التركيب والتصوير
   1. يذوي الأقسام استخدام مقياس الكحول هلال وتوضيح لهم باستخدام مادة إزالة المنشأ تربين (انظر الجدول للمواد). تضمين المقاطع في تصاعد المتوسطة ووضع المقاطع على شريحة مجهر ومراقبة الأقسام من خلال مجهر ضوئي.

3. رنا الاستخراج والنسخ العكسي

1. استخراج الحمض النووي الريبي
   1. استخراج الحمض النووي الريبي من الفروع بتنفيذ الخطوة الأولى من بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن (انظر الفرع 2-1)، وتبقى الشرائح في ماء مقطر. تداخل الأقسام أونستينيد مع المقابلة ثم توضع الملون الفروع بغية تحديد الأجزاء ذات الأهمية.
   2. القيام باستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي تجارية لعينات FFPE (انظر الجدول للمواد) وإرشادات الشركة المصنعة التالية.
2. الجيش الملكي النيبالي عكس-النسخ
   1. استخدام مجموعة أدوات تجارية للرجعية-نسخ الحمض النووي الريبي إلى كدنا (انظر الجدول للمواد) يتبع البروتوكول. الرجعية-نسخ على الأقل 1,000 نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي لإجراء تحليلات عدة.

4. بكر في الوقت الحقيقي وتحليل البيانات

1. بكر في الوقت الحقيقي
   1. إجراء تحاليل PCR الكمي في الوقت الحقيقي (قرة-PCR) مع التكنولوجيا القائمة على التحقيق (انظر الجدول للمواد) و cycler حرارية.
2. إعداد مزيج تفاعل PCR
   1. إعداد مزيج تفاعل PCR استخدام 12.5 ميليلتر من مزيج الرئيسي القائم على التحقيق، ويَسْبِر ميليلتر 1.25 كل من OTX1 و OTX2 وأكتب (انظر الجدول للمواد)، 50 نانوغرام من كدنا، وخالية من نوكلاس المياه تصل إلى 25 ميليلتر من الحجم الإجمالي.
   2. أداء جميع ردود الفعل في ثلاث نسخ باستخدام الجينات أكتب كالرقابة الذاتية لتطبيع مستويات التعبير الجيني.
   3. الطرد المركزي اللوحة في س 1,109 ز لمدة 3 دقائق وتخزين لوحة محمية من الضوء في 4 درجات مئوية حتى التجربة.
3. إعداد cycler الحرارية
   1. تعيين التشكيل الجانبي cycler الحرارية مع بداية ساخنة أولى دورة على 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها دورات 40 في 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ودورة نهائي في 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
4. تحليلات مستوى التعبير الجيني
   1. تطبيع مستويات التعبير الجيني من خلال طريقة العتبة (ΔCt) دورة مقارنة باستخدام الجينات أكتب كالرقابة الذاتية.
   2. تقييم مستويات التعبير الجيني باستخدام الأسلوب 2^-ΔCt والأرض النتائج.
5. التحليلات الإحصائية
   1. إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام الطالب تي--اختبار، والنظر في نتائج يعتد بها إحصائيا مع ف < 0.05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لقد لاحظنا في الغشاء المخاطي الطبيعي مفاعليه نووية قوية ومتجانسة للجينات أوتكس في ظهارة تنفسية من نوع بسيودوستراتيفيد عضو وفي الخلايا الغدية submucosal (الشكل 1A). وجدنا أن أبرز تعبير النووية ل OTX1 في جميع عينات نيتاكس (الشكل 1B)، بينما يذكر أو تغ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وتبين هذه الدراسة لأول مرة أنه، استناداً إلى مستويات مرناً، يتم التعبير عن الجينات غبطة OTX1 و OTX2 في الغشاء المخاطي سينوناسال العادي والغدد سوبموكوسال، التهابات الزوائد الحليمية شنيديريان سينوناسال، وفي مختلف الظهارية ونيوروكتوديرمال الأورام الخبيثة، بما في ذلك الأورام السرطانية صدفية?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation	Applied Biosystem	AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG	Applied Biosystem	4326614
ABI Prism 7000	Applied Biosystem	270001857
ACTB probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide	Merk	1072090250
Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	20276292
Triton	Sigma-Aldrich	101473728
Tris	Merk	108382
NaCl	Merk	106404
Goat Anti-OTX2 Antibody	Vector Laboratories		Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody	Vector Laboratories	BA5000
ABC-Peroxidase Complex	Vector Laboratories	PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)	Sigma-Aldrich	D5905
Harris Hematoxylin	Bioptica	0506004/L
Pertek	Kaltek SRL	1560
BioClear	Bioptica	W01030799