JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

العدوى للأنسجة البشرية مع فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز) السابقين فيفو يوفر نموذج ثلاثي الأبعاد قيماً من الفيروسات المرضية. هنا، يمكننا وصف بروتوكولا للعملية وتصيب عينات الأنسجة من اللوزتين البشرية وماكس تشويه الأعضاء التناسلية للإناث مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 والمحافظة عليها في الثقافة في واجهة الهواء السائل.

Abstract

هيستوكولتوريس السماح بدراسة التفاعلات بين الخلايا داخل الأنسجة البشرية، وأنها يمكن أن تستخدم لنموذج المضيف الممرض التفاعلات تحت ظروف المختبر التي تسيطر عليها. السابقين فيفو العدوى للأنسجة البشرية مع فيروس نقص المناعة البشرية (الفيروس)، وبين غيرها من الفيروسات، قد استخدمت بنجاح للتحقيق في أوائل المرض المرضية، فضلا عن منصة لاختبار مدى فعالية وسمية العقاقير المضادة للفيروسات. في هذا البروتوكول، نشرح كيفية معالجة وتصيب بفيروس نقص المناعة البشرية-1 الأنسجة explants من اللوزتين البشرية وعنق الرحم موكوساي، والحفاظ عليها في الثقافة على رأس الأسفنج الجيلاتين في واجهة الهواء السائل لمدة أسبوعين تقريبا. هذا الإعداد غير الاستقطاب الثقافة إلى أقصى حد الوصول إلى المواد المغذية في الثقافة المتوسطة والأكسجين، على الرغم من الفقدان التدريجي لسلامة الأنسجة والبنى الوظيفية ويظل قصره الرئيسي. يسمح هذا الأسلوب لرصد فيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها والمرضية باستخدام العديد من التقنيات، بما في ذلك تحديدكم، قبكر، والتدفق الخلوي. من الأهمية، أن التغير الفسيولوجي بين المانحين الأنسجة، وكذلك بين اكسبلانتس من مناطق مختلفة من نفس العينة، قد تؤثر تأثيراً كبيرا على النتائج التجريبية. للتأكد من إمكانية تكرار نتائج نتيجة، من الأهمية بمكان استخدام عدد كاف من اكسبلانتس، replicates التقنية وشروط مراقبة مطابقة الجهات المانحة لتطبيع نتائج العلاجات التجريبية عند جمع البيانات من تجارب متعددة (أي .، ويجري استخدام أنسجة من مختلف الجهات المانحة) للتحليل الإحصائي.

Introduction

لا تراعي الثقافات monotypic خلية ثنائية الأبعاد، يشار هنا إلى التقليدية، للاتصال المكانية والوظيفية بين مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا التي تؤلف الأنسجة والأجهزة. هذا الجانب من الأهمية بالنسبة لنماذج تجريبية للمرض، كما تدخل في التفاعلات بين الخلايا التماثل الساكن هو العوامل الدافعة لجميع الأمراض. الأنسجة explants تتيح المزايا الرئيسية للنمذجة الصحة والمرض في البشر نظراً لأنها تحتفظ سيتوارتشيتيكتوري والعديد من الجوانب الفنية الهامة من الأجهزة كما الحال في فيفو، على الرغم من أن لكمية محدودة من الوقت1. على سبيل المثال، عند السابقين فيفو التحدي مع المستضدات التذكير، مثل توكسيد الدفتيريا أو الكزاز، تستجيب الأنسجة تونسيلار بإنتاج أجسام مضادة محددة مستضد2قوية. مثل أي أخرى السابقين فيفو النموذجي، هيستوكولتوري لها حدودها الخاصة: تقلب بين الوكالات المانحة، والأنسجة الاستقطاب وبقاء الأنسجة محدودة، وصعوبة في رصد الخلايا يتجاوز عمق مجهرية [كنفوكل]1. ومع ذلك، تظل explants الأنسجة البشرية نموذجا لاختيار دراسة العمليات المناعية التماثل الساكن والمسببة للأمراض في البشر، بما في ذلك التفاعلات المضيف الممرض و التدخلات العلاجية المحتملة3.

الأحداث الحرجة لأمراض فيروس نقص المناعة البشرية-1 تجري في الأنسجة. عدوى الغشاء المخاطي للأعضاء التناسلية للإناث تمثل أغلبية جميع فيروس نقص المناعة البشرية-1 انتقال الأحداث في جميع أنحاء العالم4. الأنسجة اللمفاوية هو الموقع الرئيسي للنسخ المتماثل الفيروس أثناء الإصابة الحادة وتؤوي مجموعة كبيرة من الخلايا المصابة خفية5، وثباتها يمثل العقبة الرئيسية أمام تحقيق علاج6. تحدي الثقافة و السابقين فيفو الأنسجة اللمفاوية والأغشية المخاطية البشرية توفر بعض المزايا على النظم التقليدية القائمة على الخلايا المعزولة للدراسة لفيروس نقص المناعة البشرية-1. على سبيل المثال، يمكن أن تدعم خلايا الأنسجة-المقيم العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في غياب التنشيط الخارجية، بدلاً من الدم المحيطي الخلايا وحيدات النوى1. وقد يسمح باستخدام الأنسجة اللمفاوية explants فهم أفضل لبعض الآليات الرئيسية الكامنة وراء CD4 تي خلية استنزاف، أي، تأثير متفرجا7، وهي السمة المميزة للإصابة الحادة. الحفاظ على هياكل مثل المسام بالخليه في الأنسجة اللمفاوية8 والظهاره في الغشاء المخاطي الأعضاء التناسلية للإناث explants9 يوفر فرصة فريدة لدمج الميزات المكانية والوظيفية للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في هذه المواقع. وأخيراً، هيستوكولتوريس استخدمت بنجاح للنموذج ودراسة فيروس نقص المناعة البشرية-1 وهربس الإصابة المشتركة10،11، وكذلك للتجارب الإكلينيكية من مولتيتارجيت ومضادات الميكروبات12، 13 , 14 , 15.

هنا، نحن وصف بروتوكول مفصلة لثقافة explants الأنسجة البشرية التي تم الحصول عليها من اللوزتين والأنسجة المخاطية من انخفاض الأنثى التناسلي (عنق الرحم)، تغطي تشريح الأنسجة explant التحدي مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 بطريقة غير الاستقطاب. ثقافة الأنسجة explants في واجهة الهواء السائل، استخدام الأسفنج الجيلاتين كدعم، يزيد من التعرض للهواء الأكسجين مع توفير إمكانية الوصول إلى المواد الغذائية المتوسطة الثقافة من خلال الأسفنج الشعيرات الدموية، مما أدى إلى تأخير عن الاضمحلال الطبيعي. الطريقة الأكثر مباشرة لتقييم فيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ المتماثل في نظامنا لقياس كمية الفيروس أصدرته المناعة أو qPCR في الأجلين المتوسط والثقافة explant على مر الزمن. الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 والمرضية (مثلاً.، استنفاد الخلايا CD4 T) يمكن أيضا تقييم في الأنسجة explants بالجملة استخراج الحمض النووي الريبي/الحمض النووي وقبكر في الموقع تلطيخ أو تحليل خلية واحدة عند الهضم الأنسجة بالتدفق الخلوي.

Protocol

البروتوكول المتعلق بمجموعة من الأنسجة البشرية قد تتطلب الموافقة الأخلاقية من السلطات المحلية المختصة. وفي حالة العمليات الجراحية المشار إليها مثل استئصال اللوزتين واستئصال الرحم، لا تكون العينات التي تم جمعها خصيصا لغرض البحث والدراسة لا تعتبر البحوث على البشر (المعاهد الوطنية للصحة. البحوث على البشر. https://humansubjects.nih.gov/walkthrough-investigator#tabpanel11). ومع ذلك، الحصول على البيانات الشخصية والطبية الأنسجة المانحين (مثلاً.، الجنس والسن، واستعمال المخدرات الحالية وتاريخ العدوى، إلخ) التي قد تساعد على تفسير النتائج التجريبية، يثير مخاوف المستنيرة والخصوصية التي يجب أن تكون تناولها في البروتوكول من أجل جمع الأنسجة.

تحذير: الإجراء بأكمله ينبغي أن يتم في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء. قد تأوي جميع العينات البشرية، بما في ذلك تلك من الأفراد 'صحية'، العوامل المعدية. المشغل يجب أن تتلقى التدريب على العمل مع مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الدم بأمان التعامل مع عينات الأنسجة، حتى إذا كانت التجارب لا تنطوي على استخدام فيروس نقص المناعة البشرية. ينبغي إجراء تقييم مخاطر لإجراء تشريح الأنسجة والإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية من الموظفين المدربين لضمان سلامة المشغل وزملاء العمل. يتطلب استخدام فيروس المعدية السلامة الأحيائية مكرسة بيئات المستوى 2 أو 3 حسب البلد واللوائح الخاصة بالمعهد على المستحضرات البيولوجية الخطرة والمسببة للأمراض المنقولة بالدم.

1-إعداد الأسفنج الجيلاتين

ملاحظة: على الرغم من أنه ليس ضروريا تماما لإعداد الأسفنج الجيلاتين قبل تشريح الأنسجة، أكثر ملاءمة لاتباع الترتيب المبين هنا، خاصة عند التعامل مع كمية كبيرة من الأنسجة و/أو من العديد من الجهات المانحة.

  1. تعد الثقافة المتوسطة (سم) واستكمالها بحل المضادات الحيوية (تيركاسيلين-كلافولاناتي ميكس) قبل استخدامها لجعل CMT (جدول المواد). تجاهل أي حل بقايا المضادات الحيوية.
    ملاحظة: تيكارسيلين وكلافولاناتي في CMT سيئة مستقرة. إذا لزم الأمر، إعادة تكملة CMT مع حل المضادات الحيوية بعد حوالي 24 ساعة من التحضير. غير مطلوب لإضافة حل المضادات الحيوية explant المتوسطة كل 24 ساعة خلال الثقافة.
  2. ملء 100 ملم × 20 ملم طبق بيتري مع حوالي 20-30 مل CMT.
    ملاحظة: هذا الإعداد الأمثل لتحضير الأسفنج الجيلاتين ما يكفي لاثنين 6-جيدا لوحات أو لوح 12-بئر واحد في الوقت. إذا لزم العديد من لوحات، استخدام طبق بيتري أوسع وأكبر من حجم CMT إلى الإسراع في الإعداد.
  3. نقل sponge(s) الجيلاتين في طبق بتري استخدام الملقط العقيمة. الرطب الأسفنج على كلا الجانبين والسماح الأسفنج لامتصاص المتوسطة للحد الأدنى 1 اضغط الأسفنج ضد الجزء السفلي من صحن بيتري لحوالي 2 دقيقة باستخدام ملعقة عقيمة.
    ملاحظة: هذه الخطوة من الأهمية بمكان نظراً لوجود فقاعات الهواء في الأسفنج سوف كتلة الشعيرات الدموية من خلالها الوصول المتوسطة الثقافة الغذائية إلى الأنسجة. الأسفنج الجيلاتين هشة جداً عندما المجففة. ادفع برفق إلى أسفل في الأسفنج مع البسط، خصوصا في البداية، لتجنب كسر الأسفنج.
  4. استخدام مقص معقم قص الأسفنج امهاء الجيلاتين إلى أجزاء متساوية في الحجم حوالي 1 سم2. نقل 1 قطعة من الأسفنج باستخدام الملقط في كل بئر من لوحة الثقافة. إضافة 3-4 مل CMT في كل بئر من لوحة 6-جيدا (اللوزتين) و 1 مل كل بئر في لوحة 12-جيدا (عنق الرحم). وضع اللوحات في الحاضنة، تعيين في 37 درجة مئوية، 5% CO2≥ 90% رطوبة، حتى explants الأنسجة على استعداد ليتم تحميلها على الاسفنجيات.
    ملاحظة: ينبغي تعديل حجم فريق الإدارة القطري إضافة إلى اللوحة لسمك الاسفنجة للحفاظ اكسبلانتس في واجهة الهواء السائل.

2-تشريح الأنسجة البشرية تونسيلار

ملاحظة: اللوزتين ينبغي تجهيز وقت ممكن بعد الجراحة، من الناحية المثالية في نفس اليوم لعملية جراحية. وبدلاً من ذلك، العينات يمكن ترك CMT المغمورة في ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.

  1. السماح لمجلس الوزراء قبل استعد ما يكفي من الوقت تصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT) أو وضعه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. الملحق سم مع حل المضادات الحيوية (CMT) قبل الاستخدام. تجاهل أي حل المضادات الحيوية التي خلفها. صب محلول الإيثانول 70% في حاوية نظيفة نقع الملقط ومشرط كلما دعت الحاجة أثناء إجراء تشريح. تنظيف الأدوات وتغيير شفرة المبضع بين تشريح عينات من مختلف الجهات المانحة.
  2. نقل اللوزتين من حاوية النقل إلى طبق 100 مم-بيتري التي تحتوي على 10-20 مل CMT استخدام الملقط العقيمة.
    ملاحظة: العينات مع المناطق على نطاق واسع كوتيريزيد، دموية أو أنسجة نخرية يجب أن يتم تجاهل.
  3. استخدام غطاء صحن بيتري كسطح قطع لتشريح الأنسجة. عقد الأنسجة بلطف مع الملقط، قطع كل لوزة إلى عدة قطع كبيرة باستخدام مشرط معقم وبليد.
    تنبيه: التعامل مع الأدوات الحادة تشريح العينات البشرية يزيد من خطر الإصابة والتلوث. ينبغي أن تنظر المشغل ارتداء المعدن، شبكة، قفازات مقاومة لقص كحماية إضافية.
  4. إزالة كوتيريزيد، الدموي، والنسيج الليفي، وأي أجزاء تتضمن tonsilloliths (مواد متكلسة) و/أو مع اللون الأخضر-البنى باستخدام الملقط ومشرط.
    ملاحظة: أثناء العمل على قطعة واحدة من الأنسجة، من المهم للحفاظ على ما تبقى الأنسجة مغمورة في المتوسط لتفادي جفاف الأنسجة.
  5. قص كل قطعة النسيج إلى شرائح حوالي 2 مم في السمك. قم بإزالة أي جزء غير مرغوب فيها كما هو الحال في الخطوة السابقة. قطع شرائح النسيج إلى شرائح سميكة مم 2. مقطعة شرائح الأنسجة 2 مم سميكة كتل. وينبغي أن ينتج عن هذا الأنسجة explants تقريبا 8 مم3.
  6. نقل explants في طبق بتري 100 ملم جديدة تحتوي على 10 – 20 مل من فريق الإدارة القطري لتجنب جفاف الأنسجة أثناء إجراء التشريح. في نهاية التشريح، دوامة اللوحة توزيع explant بطريقة عشوائية. 9 مكان الأنسجة explants على رأس كل الأسفنج الجيلاتين في صفيحة 6-جيدا باستخدام الملقط، السماح لمسافة بينهما. العودة اللوحات للحاضنة.
    ملاحظة: عادة، explants تستزرع بين عشية وضحاها، ويتم إجراء التطعيم للثقافات مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 في اليوم التالي. وهذا للتأكد من أن أي تلوث جرثومي أو فطري يتطور في الثقافة. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا تميل إلى خروج تونسيلار الأنسجة explants بعد التشريح. الانتهاء من هذه العملية إلى حد كبير خلال 24 ساعة الأولى من الثقافة1.
  7. التخلص من جميع النفايات البيولوجية في حاويات محلها وفقا للوائح المعهد في التعامل مع المستحضرات البيولوجية الخطرة، وتقييم المخاطر المحددة.

3-الإصابة تونسيلار الأنسجة Explants مع فيروس نقص المناعة البشرية-1

ملاحظة: يجب استخدام إعداد الفيروس نفسه لإجراء دراسة كاملة للحد من تقلب النتيجة بين التجارب المستقلة،. ثم يمكن ثقافة طافية الكوتيد للتخزين في-80 درجة مئوية لتجنب تكرار تجميد وذوبان الجليد (جدول المواد) ويمكن نشر الفيروس في خلايا الدم الطرفية تنشيط مناشئ وحيدات النوى.

  1. وضع مجلس الوزراء في حمام مائي استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية. الملحق سم مع حل المضادات الحيوية (CMT) قبل الاستخدام. تجاهل أي حل بقايا المضادات الحيوية.
  2. نضح المتوسطة في plate(s) 6-جيدا مع ماصة وتخلص منه في حاوية بمحلول مطهر. إمالة اللوحة ودفع الأسفنج الجيلاتين بلطف إلى الجزء العلوي من البئر للسماح بالمتوسط إلى التجمع في الجزء السفلي، ونضح وتجاهل ذلك. إضافة 3-4 مل من فريق الإدارة القطري لكل بئر.
  3. ذوبان الجليد إعداد الفيروسات فيروس نقص المناعة البشرية-1 في حوض ماء في 37 درجة مئوية. إذا لزم الأمر، تضعف مخزون الفيروس مع سم (الجدول 1).
    ملاحظة: ينبغي أن تضعف مخزون فيروس حيث أن العدوى المحدد الوارد في وحدة تخزين من 5 – 8 ميليلتر (الجدول 1). لعدوى كفاءة، من الضروري استخدام الحد الأدنى من الوقت اللازم بين ذوبان إعداد فيروس نقص المناعة البشرية-1 وإصابة الأنسجة explants.
  4. "الماصة؛" العدوى الفيروس مباشرة على رأس كل من اكسبلانتس 9 على الأسفنج جيلاتين. العودة plate(s) للحاضنة بمجرد الانتهاء من العدوى. تجاهل أي إعداد الفيروسات المتبقية. الاستمرار في القسم 5.
    ملاحظة: لدقة إيصال العدوى الفيروس المشغل أن تنظر باستخدام تقنية بيبيتينج العكسية وتغيير تلميح لكل بئر. وهذا ينطوي على دفع المكبس ماصة وصولاً إلى موقف التصريف (المحطة الثانية) لوضع العدوى الفيروس، ودفع للمحطة الأولى لتسليم العدوى، مما يساعد على التقليل إلى أدنى حد من تشكيل فقاعة والخطأ المقترنة بتكرار أخذ العينات الصغيرة وحدات التخزين، أي، 5 – 8 ميليلتر.

4. تسلخ والتهاب الغشاء المخاطي لعنق الرحم

ملاحظة: لتحقيق أفضل النتائج، اكسبلانتس ماكس عنق الرحم ينبغي معالجتها والمصابين وقت ممكن بعد الجراحة، من الناحية المثالية في نفس اليوم لعملية جراحية. بدلاً من ذلك، يمكن تخزين العينات المغمورة في CMT في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها، والمصابة فورا بعد التشريح.

  1. السماح لمجلس الوزراء قبل استعد ما يكفي من الوقت التوصل إلى الرايت أو وضعه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. الملحق سم مع حل المضادات الحيوية (CMT) قبل الاستخدام. تجاهل أي حل بقايا المضادات الحيوية. صب محلول الإيثانول 70% في حاوية نظيفة نقع بالملقط ومشرط كلما دعت الحاجة أثناء إجراء تشريح. تنظيف الأدوات وتغيير شفرة المبضع بين تشريح عينات من جهات مانحة متعددة.
  2. استخدام الملقط العقيمة، نقل العينة من حاوية النقل إلى 100 مم طبق بتري يحتوي على 10 – 20 مل CMT.
  3. استخدام غطاء صحن بيتري كسطح قطع لتشريح الأنسجة. عقد الأنسجة بلطف مع الملقط، فصل في الغشاء المخاطي اكتوسيرفيكس و/أو اندوسيرفيكس من تحت stromal وأنسجة العضلات (سوبموكوسا) بدون مشرط وشفرة للحصول على شرائط من الغشاء المخاطي.
    ملاحظة: أثناء العمل على قطعة واحدة من الأنسجة، من المهم للحفاظ على ما تبقى الأنسجة مغمورة في المتوسط لتفادي جفاف الأنسجة.
  4. قطع في الغشاء المخاطي إلى 2 مم على نطاق المنظومة الشرائط، وإزالة وتجاهل سوبموكوسا قدر ممكن، وترك طبقة سميكة مم 2 فقط من الأنسجة. قص الشرائط إلى 2 مم سميكة كتل. وينبغي أن ينتج عن هذا الأنسجة explants تقريبا 8 مم3.
    تنبيه: التعامل مع الأدوات الحادة تشريح العينات البشرية يزيد من خطر الإصابة والتلوث. ينبغي أن تنظر المشغل ارتداء المعدن، شبكة، قفازات مقاومة لقص كحماية إضافية.
  5. نقل الأنسجة explants إلى طبق بتري 100 ملم جديدة تحتوي على 10 – 20 مل من فريق الإدارة القطري لتجنب جفاف الأنسجة أثناء إجراء التشريح. في نهاية التشريح، دوامة اللوحة توزيع explant بطريقة عشوائية.
  6. مع الملقط العقيمة، نقل explants إلى العقيمة 1.5 مل tube(s) المخروطية (explants 16 كحد أقصى في الأنبوب). إزالة أي وسيط في الأنبوب باستخدام ماصة.
  7. ذوبان الجليد فيروس نقص المناعة البشرية-1 إعداد في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. إذا لزم الأمر، تضعف مخزون الفيروس مع سم. نقل الفيروس إلى tube(s) التي تحتوي على اكسبلانتس. تجاهل أي إعداد الفيروسات المتبقية.
    ملاحظة: ينبغي أن تضعف مخزون الفيروس حيث أن العدوى المحدد الوارد في حجم الحد الأدنى 0.5 مل (الجدول 1). الحد من تقلب النتيجة بين تجارب مستقلة، ينبغي استخدام إعداد الفيروس نفسه لدراسة كامل (جدول المواد).
  8. تحويل الأنابيب إلى حرارية-شاكر واحتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية هزاز 300 لفة في الدقيقة. عكس الأنابيب برفق بضع مرات كل 30-60 دقيقة.
    ملاحظة: لعدوى تتسم بكفاءة، من الأهمية بمكان استخدام الحد الأدنى من الوقت اللازم بين ذوبان فيروس نقص المناعة البشرية-1 إعداد ونقل الأنابيب إلى 37 درجة مئوية.
  9. ملء صفيحة 6-جيدا مع 3-4 مل في بئر المالحة العازلة الفوسفات العقيمة (PBS). في الحضانة مع فيروس نقص المناعة البشرية-1، تجاهل جميع إعداد الفيروسات في tube(s) في وعاء مع الحل مطهرة باستخدام ماصة. نقل اكسبلانتس في لوحة 6-كذلك يتضمن برنامج تلفزيوني استخدام الملقط.
  10. السماح اكسبلانتس للراحة في برنامج تلفزيوني لمدة 1 دقيقة على RT، وثم غسلها بلطف بيبيتينج صعودا ونزولاً في برنامج تلفزيوني في البئر 2-3 مرات. تجاهل برنامج تلفزيوني في حاوية مع الحل مطهرة باستخدام ماصة. إضافة 3-4 مل من برنامج تلفزيوني جديد لكل بئر. كرر مرتين أخريين ليصبح مجموع يغسل ثلاث. تجاهل برنامج تلفزيوني فقط قبل نقل اكسبلانتس للاسفنج لتجنب جفاف الأنسجة.
    ملاحظة: اكسبلانتس من الغشاء المخاطي لعنق الرحم، وفي اندوسيرفيكس خاصة، الإفراج عن كميات كبيرة من المخاط أثناء الإصابة. من الضروري غسل وإزالة المخاط قدر ممكن لأن الاحتفاظ بها غير محدد على explants واللاحقة إطلاق الفيروس في المادة طافية الثقافة يمكن أن تخفي فيروس النسخ المتماثل.
  11. باستخدام الملقط، نقل explants 5-8 على رأس كل الأسفنج الجيلاتين في صفيحة 12-جيدا. العودة اللوحة للحاضنة.
  12. التخلص من جميع النفايات البيولوجية في حاويات محلها وفقا للوائح المعهد في التعامل مع المستحضرات البيولوجية الخطرة، وتقييم المخاطر المحددة.

5-هيستوكولتوري

  1. تغيير سم كل 3 أيام بدءاً من وقت الإصابة حتى يوم 12 – 15 ما بعد الإصابة. ويمكن تذوق سم و/أو اكسبلانتس على فترات منتظمة طوال الوقت الثقافة لتقييم النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية-1 بين المعلمات الأخرى.
  2. وضع مجلس الوزراء في حمام مائي استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: ليس المطلوب لتكملة سم مع حل المضادات الحيوية في هذه المرحلة.
  3. جمع عينة سم مع ماصة وتحويلها إلى العقيمة 1.5 أو 2 مل ملولبة tube(s) للتخزين في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم تجميع سم من آبار نسخ متماثل في مجموعة.
  4. الحصاد الأنسجة explants مع الملقط العقيمة، إزالة المتوسطة الزائدة على explants بوضعها على قطعة من الورق (اختياري)، ونقل اكسبلانتس إلى tube(s) ملولبة 1.5 أو 2 مل العقيمة. معالجة أو تخزين عينات الأنسجة كما هو مطلوب بالتجربة.
    ملاحظة: لقياس التدفق، explants يتم فورا هضمها كوكتيل الانزيمية للحصول على تعليق خلية واحدة (لمزيد من التفاصيل انظر المراجع 1, 9 و 16 و 17). لاستخراج الحمض النووي الريبي، يتم الاحتفاظ اكسبلانتس في حل استقرار الجيش الملكي النيبالي في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها قبل تخزينها في-80 درجة مئوية. لاستخراج الحمض النووي أو في الموقع تلطيخ (عنق الرحم)، يمكن تجميد المفاجئة في الملاط سائل النيتروجين أو الثلج الجاف/الإيثانول explants وتخزينها في-80 درجة مئوية. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تكون ثابتة explants تونسيلار بغمر في حل من بارافورمالدهيد PBS و 4% لتلطيخ في الموقع .
  5. نضح سم المتبقية في البئر مع ماصة وتخلص منه في حاوية بمحلول مطهر. إمالة اللوحة ودفع الأسفنج الجيلاتين بلطف إلى الجزء العلوي من البئر للسماح بالمتوسط إلى التجمع في الجزء السفلي، وثم نضح وتجاهل ذلك.
  6. إضافة مل 3-4 سم لكل بئر. استخدام الملقط العقيمة، عودة أي الأنسجة explants التي انخفضت في المتوسط إلى الأسفنج الجيلاتين. العودة اللوحة للحاضنة.
  7. في نهاية الثقافة، التخلص من جميع النفايات البيولوجية في حاويات محلها وفقا للوائح المعهد في التعامل مع المستحضرات البيولوجية الخطرة، وتقييم المخاطر المحددة.

النتائج

يمكن استخدام العديد من التقنيات لتقييم فيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها في الأنسجة explants. القراءة لدينا معيار لقياس الكمية من فيروس نقص المناعة البشرية-1 p24اسكت صدر في سم على مر الزمن مع المناعة18.

الأنسجة explants من مختلف...

Discussion

استخدام الأنسجة البشرية explants لدراسة الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 يوفر مزايا أكثر من مونوتيبيك وثنائي الأبعاد التجريبية النظم التقليدية، مثل الخلايا الأولية أو خطوط الخلايا، سبب قدرتهم الفائقة على استنساخ التفاعلات بين الخلايا و الوظائف الخلوية (مثلاً، إنتاج سيتوكين) كما ال...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

بتأييد هذا العمل بمنح من بيلت مؤسسة بلانسيفلور بونكومباني Ludovisi ني (http://blanceflor.se/)، وأطباء المؤسسة السويدية ضد الإيدز (http://www.aidsfond.se/، الرقم FOa2014-0006)، واندريا Fondazione ه لوريني الليبي (http ://fondazionelorini.it/) إلى إينترويني أندريا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge PfizerNDC:  0009-0315-08Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin spongeFerrosan Medical DevicesMS0002Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.
RPMI 1640 with phenol red and glutamineThermoFisher Scientific21875034To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)ThermoFisher Scientific11140035To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Sodium pyruvate, 100 mM (100x) ThermoFisher Scientific11360070To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Gentamicin 50 mg/mL (1000x) ThermoFisher Scientific15750037To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Amphotericin B 250 μg/mL (100x) ThermoFisher Scientific15290018To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Fetal bovine serum (FBS) To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).
Ticarcillin disodium saltSigma-AldrichT5639-1GResuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Potassium clavulanateSigma-Aldrich33454-100MGResuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3 g) and potassium clavulanate (100 mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol redTo use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. 
Sterile cell culture grade water
Sterile transportation container
70% ethanol solution
Disinfectant solution for biological waste disposal
Sterile metal forceps or tweezers
Sterile metal scissors
Sterile flat weighing metal spatula
Sterile scalpels and blades
6-well cell culture plates
12-well cell culture plates
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaLNIH AIDS Reagent Program510The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04NIH AIDS Reagent Program2522The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Lamivudine (3TC)NIH AIDS Reagent Program8146Resuspend in DMSO at 10 mg/mL, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing.
Biological safety cabinet
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity
Water bath set at 37 °C
Sterile 1.5 and 2mL screw cap tubes
Dry bath shaker with heating block for 1.5 mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm

References

  1. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
  2. Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
  3. Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
  4. Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
  5. Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
  6. Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
  7. Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
  8. Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
  9. Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
  10. Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
  11. Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
  12. Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
  13. Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
  14. Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
  15. Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
  16. Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
  17. Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
  18. Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
  19. Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
  20. Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
  21. Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
  22. Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
  23. Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
  24. Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
  25. Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140 1 explants

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved