JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وترد هنا بروتوكولات مفصلة لاستزراع خط الخلية 32D/ز-CSF آر السلائف النقوي مورين وأداء العدوى الفيروسية، والقيام بفحوصات الانتشار والتفرقة. هذا الخط خلية مناسبة لدراسة التنمية الخلية النقوي، ودور جينات فائدة في نمو الخلايا النقوي والتمايز بيضاء.

Abstract

فهم بيولوجيا الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم على آثار هامة للطب التجديدي، وعلاج أمراض الدم. على الرغم من البيانات الأكثر أهمية التي يمكن الحصول عليها باستخدام النماذج في فيفو أو الثقافات الأولية، يقيد وفرة منخفضة للخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم إلى حد كبير مجموعة تقنيات مناسبة للتحقيق فيها. ولذلك، يسمح استخدام خطوط الخلايا يكفي إنتاج المواد البيولوجية لأداء عروض أو الاختبارات التي تتطلب إعداد كبيرة من الخلايا. وهنا يقدم وصفاً مفصلاً، وقراءات، وتفسير لفحوصات الانتشار والتفرقة التي تستخدم لتحقيق العمليات التي ينطوي عليها ميلوبويسيس والتمايز بالعدلات. وتستخدم هذه التجارب خط الخلية النقوي مورين التابعة سيتوكين 32D/ز-CSF آر، التي تمتلك القدرة على تكاثر حضور إيل-3 والتفريق في ز-CSF. نحن نقدم الأمثل بروتوكولات للتعامل مع الخلايا 32D/ز-CSF آر ومناقشة المزالق الرئيسية والسلبيات التي قد تضر بوصف فحوصات والنتائج المتوقعة. بالإضافة إلى ذلك، تحتوي هذه المقالة على بروتوكولات لإنتاج لينتيفيرال والفيروسات التراجعية، والمعايرة، وتوصيل الخلايا 32D/ز-CSF-R. علينا أن نظهر أن التلاعب الوراثي لهذه الخلايا يمكن أن تستخدم لإجراء الدراسات الفنية والجزيئية، التي يمكن أن تكمل النتائج التي تم الحصول عليها مع الأولية المكونة للدم الخلايا الجذعية والسلف أو نماذج في فيفو بنجاح.

Introduction

إمدادات السكان المكونة للدم الجذعية والسلف الكائن مع مجموعة كبيرة من الخلايا الناضجة، بما في ذلك الخلايا من نسب النقوي (العَدلات، الحمضات، الاسسه، ووحيدات). العملية التي تقود إنتاج خلايا النقوي من الخلايا الجذعية المكونة للدم يعرف باسم ميلوبويسيس، ويكفي إنتاج خلايا النقوي ناضجة في الاستجابة للمتطلبات المتغيرة شرط مسبق للتعامل السليم في الحي مع الإجهاد الشروط، مثل الالتهابات وفقدان الدم. قد يؤدي عدم كفاية إنتاج خلايا النقوي ناضجة للتمكن من القضاء على مسببات الأمراض وتخثر الدم المخفضة، وأخرى تهدد الحياة ظروف1،2. وبالإضافة إلى ذلك، تعديلات في نسب النقوي التنمية قد يكون مرتبطاً أيضا بالأورام الخبيثة الدموية، مثل سرطان الدم النقوي الحاد (AML)3. قد تحدث تغييرات في ميلوبويسيس لأسباب مختلفة، مثل عيوب في خلايا المستقبلات السطحية4، تعبيرات غيرت من عوامل النسخ5، ضعف مسارات الإشارات6، الطفرات أسفر عن تشكيل/ تفعيل المسرطنة7، أو المنظمة من ورم المكثف الجينات8.

وقد وضعت أساليب مختلفة لدراسة التنمية النقوي، وتقييم أثر التعديلات الوراثية المحددة في هذه العملية. ينطوي النهج المشتركة المستخدمة لدراسة ميلوبويسيس الخلايا الأولية والفئران المعدلة وراثيا. على الرغم من أن هذه النماذج تسمح الحصول على البيانات ذات الصلة بيولوجيا، لديهم بعض القيود. واجه استخدام الخلايا الأولية على عدد محدود من الخلايا وفترة مقيدة للثقافة، وتضييق إمكانيات لتغيير التعبير الجيني وتحليل البيولوجية أو الكيميائية الحيوية اللاحقة. الفئران المعدلة وراثيا هي مكلفة وتتطلب درجة معقولة من التبرير البيولوجي. وبالإضافة إلى ذلك، يضيف العامل مع نماذج في فيفو على درجة من التعقيد في فهم دور الجينات للاهتمام بعملية معينة. ولذلك، يلزم نهج بديلة للتحايل على هذه القيود. خطوط الخلية لها مزايا لا جدال فيه: (1) أنها تمتلك قدرة الانتشار غير المحدود الذي يسمح لتوليد ما يكفي من المواد للدراسات البيوكيميائية والبيولوجية، (2) فعرضه للتلاعب الوراثي (ضربة قاضية، خروج المغلوب، overexpression)، (3) التكلفة منخفضة نسبيا، و (4) أنها تسمح بقدر من التبسيط البيولوجية المطلوبة في بعض النهج التجريبي.

3 إيل الأبوية (انترلوكين-3) 32D تعتمد خط الخلية أنشئت في عام 1983 جرينبيرجير وزملاؤه بعدوى خلايا نخاع العظام من الفئران C3H/HeJ مع صديق اللوكيميا مورين الفيروسات9. ووصفت استنساخ 32D عدة في الأدب: cl-239و cl-310و cl-1011. وعرضت 32D cl-3 الخلايا تتكاثر في إيل-3 والخضوع للتمايز بيضاء على المعاملة مع مستعمرة المحببات التحفيز عامل (ز-CSF)10. على العكس من ذلك، 32D cl-10 خلايا، حين أنها تعتمد على 3 إيل، أصلاً كانت لا التفريق في الاستجابة للعلاج ز-CSF. وفي عام 1995 ترانسدوسيد مجموعة الدكتور إيفو تو ريتروفيرالي 32D cl-10 خلايا مع نوع البرية وأشكال المسخ من مستقبلات ز-CSF (ز-CSF آر)، بغية تحديد المناطق الهامة وظيفيا لهذا مستقبلات11. وأسفرت هذه الدراسة جيل الخلايا 32D/ز-CSF آر، التي تعتمد على نحو مماثل في إيل-3، ولكن في غضون 6 إلى 10 يوما بعد استبدال إيل-3 مع ز-CSF، تتوقف الخلايا تتكاثر وتفرق بلا رجعة في العَدلات الناضجة. هذه الخصائص تجعل 32D cl-3 والخلايا 32D/ز-CSF آر نماذج مبسطة من التمايز بالعدلات مورين التي يمكن أن تكون عن طريق اثنين من نمو محددة تحديداً جيدا وعوامل التمايز-إيل-3 وز-CSF التضمين. خلال العقود الماضية قد استخدمت مجموعات متعددة الخلايا 32D/ز-CSF آر لدراسة دور الجينات خاصة في الانتشار وتمايز الخلايا النقوي في الثقافة12،13،،من1415 , 16، ودراسة ز-CSF مما يشير إلى17،18. الأهم من ذلك، النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الخط خلية ترتبط مع البيانات التي تم الحصول عليها مع الخلايا الأولية والفئران المعدلة وراثيا16،19،،من2021. ونتيجة لذلك، نعتقد أن الخلايا 32D/ز-CSF آر، يجري نموذج الراسخة والمستخدمة على نطاق واسع، تمثل نظاما قيماً لدراسة النقوي التمايز التي يمكن استخدامها بالتوازي مع نهج أخرى التصدي لهذه المسألة.

هنا، يرد بروتوكولات مفصلة تصف التعامل مع خط الخلية 32D/ز-CSF آر، التي توسع الغطاء والتمايز وتقييم الانتشار والتفريق بين هذه الخلايا. للتعديل الوراثي للخلايا 32D/ز-CSF آر، أما عن طريق توصيل النسخ العكسي أو لينتيفيرال، فضلا عن البروتوكولات لمعايرة الفيروس هي معلومات تفصيلية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير العديد من النتائج التمثيلية التي تثبت التطبيقات المحتملة للخلايا 32D/ز-CSF آر.

Protocol

ملاحظة: الخطوات تصف التوسع، التمايز، وتوصيل الخلايا 32D/ز-CSF آر ترد أدناه.

1-إعداد

  1. إعداد الوسائط
    1. تحضير 250 مل من الثقافة المتوسطة: المتوسطة 1640 RPMI (معهد ميموريال بارك روزويل) تستكمل مع الحرارة 10% إبطال FBS (الجنين المصل البقري)، وايل-3 مورين (10 نانوغرام/مل).
      1. وبدلاً من ذلك، استخدم الصنع IL-3. لإنتاج إيل-3 الصنع، ترانسدوسي الخلايا HEK293 مع إيل-3 ناقلات وإذ تعرب عن وجمع إيل-3 تتضمن طافية22.
        ملاحظة: المضادات الحيوية، مثل البنسلين ز (100 وحدة/مل)، ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل) ومن الجنتاميسين (40 ميكروغرام/مل)، يمكن لاستزراع الخلايا في أي خطوة للبروتوكول ما لم يذكر خلاف ذلك.
    2. إعداد 50 مل متوسطة التمايز: المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% FBS، والبشرية ز-CSF (100 نانوغرام/ملليلتر).
      ملاحظة: (مهم) ليس كل مصل دفعات دعم التمايز للخلايا 32D/ز-CSF آر. قبل بدء التجربة اختبار مجموعات مختلفة من المصل. من المستحسن اختبار دفعات مختلفة على الأقل 4 وحدد الأمثل استناداً إلى قدرة الخلايا 32D/ز-CSF آر على التفريق. انظر البروتوكول التمايز 32D/ز-CSF آر أدناه.
    3. إعداد 10 مل من تجميد المتوسطة: المتوسطة RPMI 1640 تستكمل مع 40% FBS، و 10% [دمس] (ثنائي ميثيل سلفوكسيد).
  2. الإنتاج لفي
    1. لوحة تعليق خلية واحدة من الخلايا Bosc23 (6 × 106) في طبق بتري 16 سم وزراعتها في 18 مل دميم (المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو) التي تحتوي على 10% FBS حتى كونفلوينسي للثقافة تصل إلى 80% (24 ساعة).
      ملاحظة: يجب أن تنمو الخلايا في كتل أحادي الطبقة ولا من النموذج في الثقافة. عد الخلايا يمكن أن يؤديها باستخدام أساليب مختلفة (صالحة لبقية البروتوكولات المقدمة هنا). في حالة انخفاض عدد العينات، ينصح العد اليدوي تحت المجهر باستخدام الدائرة Bürker. في هذه الحالة، استخدم تريبان الأزرق لاستبعاد خلايا الميتة. مزيج من الخلايا 1:1 مع 0.4% تريبان الأزرق في برنامج تلفزيوني. لإجراء عد لعدد كبير من العينات، يمكن أن تستخدم عداد تلقائي خلية.
    2. الجمع بين 40 ميكروغرام لبناء النسخ العكسي (مثل مسكف)، 20 ميكروغرام pCL-إيكو (ناقل التعبئة والتغليف)23، 80 ميليلتر من بي (بولييثيلينيميني)، و 2 مل من المصل خفض المتوسطة (مثل غروب-الفنزويلية) متوسطة (بدون المضادات الحيوية). احتضان هذا الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. استبدال Bosc23 الخلايا المتوسطة بعناية مع 16 مل دميم وتستكمل مع 2% FBS. قبل الحارة المتوسط إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
      ملاحظة: لا تستخدم المضادات الحيوية خلال تعداء، نظراً لأنها قد تقلل من كفاءة تعداء.
    4. إضافة خليط أعدت في 1.2.2. دروبويسي وعناية Bosc23 الثقافة، واحتضان ح 4 في 37 درجة مئوية. الحد من الحضانة إلى أقل من 6 ح سبب سمية بي.
    5. بعد الحضانة، تغيير Bosc23 المتوسطة لمل 18 قبل استعد دميم التي تحتوي على 10% FBS، وزراعة الخلايا ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية. ضع الأطباق في مختبر مستوى 2 للسلامة الأحيائية وتبقى هنا من هذه الخطوة على اتباع إجراءات السلامة القياسية.
    6. جمع Bosc23 المتوسطة (التي تحتوي على جزيئات اكوتروبيك الفيروسات التراجعية) استخدام ماصة 25 مل مصلية في أنبوب 50 مل مخروطية، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: ينبغي التوصل إلى كفاءة تعداء (هام) 90% لإنتاج فيروس عيار عالية.
    7. إضافة مل 18 قبل استعد دميم 10% FBS إلى Bosc23 الخلايا وزراعتها ح 24.
    8. كرر الخطوة 1.2.6.
      ملاحظة: يمكن تجميع supernatants الفيروسات التراجعية من 1.2.6 و 1.2.8 بمجرد أن تصل إلى نفس درجة الحرارة المحافظة على سلامة الفيروسية (4 درجات مئوية).
    9. لتجنب التلوث Bosc23 في supernatants الفيروسية، تدور الفيروسات التي تم جمعها في ز 1500 × لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. فيروس الكوة، التقط تجميد استخدام النتروجين الثلج الجاف أو السائل، وتخزين في-80 درجة مئوية. ومع ذلك، ملاحظة أن الفيروس الطازجة جودة أعلى من حيث الكفاءة العدوى من الأرصدة المجمدة.
      ملاحظة: (هام) تجنب تكرار تجميد/ذوبان الجليد للفيروس، نظراً لأنه يؤدي إلى تدهور الفيروسية.
  3. إنتاج لينتيفيروس
    1. لوحة تعليق خلية واحدة من الخلايا (الكلي الجنينية البشرية 293T) HEK293T (6 × 106) في طبق بتري 16 سم وزراعتها في 18 مل دميم التي تحتوي على 10% FBS حتى كونفلوينسي للثقافة تصل إلى 80% (24 ساعة).
      ملاحظة: يجب أن تنمو الخلايا في كتل أحادي الطبقة ولا من النموذج في الثقافة.
    2. الجمع بين 15 ميكروغرام لبناء لينتيفيرال (مثل pGhU6)، التعبئة والتغليف pCMVdR8.74 البلازميدات (ترميز لهفوة/بول، 12 ميكروغرام) و pMD2.VSVG (ترميز لمنظمة-ز، 1.4 ميكروغرام)، ميليلتر 85.2 بي، و 2 مل من المصل خفض متوسط (بدون المضادات الحيوية). احتضان هذا الخليط لمدة 20 دقيقة في الرايت
    3. استبدال المتوسطة HEK293T بعناية مع 16 مل دميم وتستكمل مع 2% FBS. قبل الحارة المتوسط إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. عدم استخدام المضادات الحيوية خلال تعداء، نظراً لأنها قد تقلل من كفاءة تعداء.
    4. إسقاط الخليط أعدت في 1.3.2 لثقافة الخلية HEK293T بعناية واحتضانها ح 4 في 37 درجة مئوية. تحديد مدة الحضانة إلى داخل ح 6 لمنع التسمم بي.
    5. متوسط التغير لمل 18 قبل استعد دميم 10% FBS وزراعة الخلايا ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية. ضع الأطباق في مختبر مستوى 2 للسلامة الأحيائية وتبقى هنا من هذه الخطوة على اتباع إجراءات السلامة القياسية.
    6. جمع HEK293T المتوسطة (التي تحتوي على جزيئات أمفوتروبيك لينتيفيرال) باستخدام ماصة 25 مل مصلية في أنبوب 50 مل مخروطية وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: ينبغي التوصل إلى كفاءة تعداء (هام) 90% لإنتاج فيروس عيار عالية.
    7. عناية إضافة 18 مل دميم دافئة قبل 10% FBS للخلايا HEK293T. زراعة عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    8. كرر الخطوة 1.3.6.
      ملاحظة: يمكن تجميع سوبيرناتانتس لينتيفيرال من 1.3.6 و 1.3.8 بمجرد أن تصل إلى نفس درجة الحرارة المحافظة على سلامة الفيروسية (4 درجات مئوية).
    9. لتجنب التلوث من المادة طافية الفيروسية مع الخلايا HEK293T، تدور الفيروسات التي تم جمعها في ز 1500 × لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. فيروس الكوة، التقط تجميد استخدام النتروجين الثلج الجاف أو السائل، وتخزينها في-80 درجة مئوية. ومع ذلك، لاحظ أن طازج الفيروس جودة أعلى من حيث الكفاءة العدوى من الأرصدة المجمدة.
      ملاحظة: (هام) تجنب تكرار تجميد/ذوبان الجليد للفيروس، نظراً لأنه يؤدي إلى تدهور الفيروسية.
  4. معايرة للفيروس التي تحتوي على بروتينات فلورية خضراء مراسل
    1. البذور 1 × 105 المعاهد الوطنية للصحة/3T3 الخلايا في 300 ميليلتر من دميم 10% FBS الواحدة وكذلك في لوحة 24-جيدا. سوف تستخدم الآبار 7 لفيروس عيار واحد.
    2. ذوبان الجليد الفيروس عند 37 درجة مئوية وإضافة 1، 5، 10، 50، 100 و 500 ميليلتر الفيروس إلى المعاهد الوطنية للصحة/3T3 الثقافات. لا تقم بإضافة أي فيروس في مراقبة سلبية أيضا. زراعة الخلايا حضور الفيروس عن 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    3. حصاد المعاهد الوطنية للصحة/3T3 الخلايا باستخدام 30 ميليلتر التربسين/يدتا (حمض الإيثيلين) (0.25% التربسين، يدتا 0.01 ٪ في برنامج تلفزيوني) ووضع الخلايا في برنامج تلفزيوني ميليلتر 250 في أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية (الأسفار تنشيط الخلية الفرز).
    4. تحديد وتيرة التجارة والنقل+ الخلايا بالتدفق الخلوي في كل عينة24. استبعاد الخلايا الميتة عن طريق إضافة صبغة الجدوى، مثل هويشت 33258.
    5. حساب إجمالي عدد الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ (استناداً إلى عدد الخلايا مطلي والنسبة المئوية للخلايا بروتينات فلورية خضراء+ )، وارسم لهم ضد وحدة التخزين المستخدمة للإصابة بالفيروس.
      ملاحظة: تصل الكفاءة (هام) الإصابة بهضبة عند تطبيق جرعات كبيرة الفيروسية. ولذلك، من المهم تقدير عيار استناداً إلى التركيزات الفيروسية في العدوى التي تحدث الكفاءة في مجموعة خطية (على سبيل المثال في الجدول 1). عدد الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ يشير إلى عدد الجسيمات الفيروسية الوظيفية (تو-تحويل الوحدات) في وحدة تخزين فيروس معين. حساب عدد تو كل مل.
  5. معايرة للفيروس التي تحتوي على مراسل بوروميسين
    1. البذور 5 × 104 خلايا المعاهد الوطنية للصحة/3T3 في 3 مل دميم 10% FBS كل بئر في لوحة 6-جيدا؛ توظيف 6 آبار لفيروس عيار واحد. الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    2. وفي اليوم التالي يضعف الفيروس كما هو مبين في الجدول 2. لتمييع الفيروسات، استخدم دميم دافئة قبل 10% FBS. عدم دوامة.
    3. إزالة الثقافة المتوسطة من المعاهد الوطنية للصحة/3T3 الخلايا وإضافة 1 مل فيروس المخفف.
    4. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    5. استبدال بلطف المتوسطة المحتوية على الفيروس مع 2 مل دميم دافئة قبل 10% FBS، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    6. استبدال المتوسطة المعاهد الوطنية للصحة/3T3 برفق مع 2 مل من قبل حرارة دميم 10% FBS المحتوية على بوروميسين (2 ميكروغرام/مل).
    7. الثقافة في 37 درجة مئوية والتحديث في المتوسط بعناية مع بوروميسين كل 3 أيام أو عندما يتحول إلى اللون الأصفر المتوسطة.
    8. 10-12 يوما بعد الإصابة، نضح المتوسطة من كل بئر وتغسل برفق مع برنامج تلفزيوني.
    9. وصمة عار مع 1 مل من محلول الكريستال البنفسجي (0.5% الكريستال البنفسجي في 20% من الإيثانول و dH2س)، 2 دقيقة في RT، وتغسل بعناية مع برنامج تلفزيوني مرتين.
    10. عد المستعمرات الزرقاء الموجودة في كل بئر تحت مجهر (التكبير X4). ينبغي أن يراعي لا مستعمرات في مراقبة سلبية أيضا.
    11. حساب العدد الإجمالي لتو/مل النظر في معامل التخفيف.

2-توسيع وصيانة خلايا 32D/ز-CSF-R

  1. إذا كان يتم تجميد الخلايا 32D/ز-CSF آر، تأخذ قاسمة وذوبان الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وتصب الخلايا من القنينة مباشرة في 10 مل من قبل حرارة متوسطة RPMI 1640 تستكمل مع 10% FBS في أنبوب 15 مل. إزالة المادة طافية عكس أنبوب 3 مرات وتدور الخلايا لأسفل في 400 × زاي وريسوسبيند الخلايا في إيل-3 تتضمن الثقافة المتوسطة بتركيز 0.3 × 106 خلايا/مل.
  2. تركز النمو الأمثل الخلية هي 0.25-0.5 × 106 خلايا/مل. تقسيم الخلايا كل يومين تقديمهم إلى تركيز 0.1-0.2 × 106 خلايا/مل.
    ملاحظة: الخلايا 32D/ز-CSF-R (هام) قد جزئيا تفقد قدرتها على التفريق إذا نما إلى تركيزات أعلى من 1 × 106 خلايا/مل. ولذلك من المهم جداً تقسيم الخلايا 32D/ز-CSF آر في الوقت المناسب.
  3. حسب الحاجة، تجميد وتخزين الخلية مختبرين لفترات طويلة من الزمن في-80 درجة مئوية أو في نيتروجين سائل. تدور أسفل 3 × 106 خلايا وإزالة المادة طافية، وريسوسبيند في 1 مل من تجميد المتوسطة. ضع الأنبوبة في حاوية تجميد في-80 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل، قم بتغيير موضع الخلايا للنتروجين السائل.

3-توصيل الخلايا 32D/ز-CSF-R

  1. لوحة خلايا 32D/ز-CSF-R في لوحة 6-جيدا بتركيز 0.3 × 106 خلايا/مل.
  2. إضافة كمية مناسبة من الفيروس للوصول إلى موي (تعدد العدوى) بين 10 و 40.
    ملاحظة: سيؤدي موي أعلى في زيادة النسبة المئوية للخلايا بروتينات فلورية خضراء+ ، فضلا عن مستويات أعلى من التعبير عن الجينات للفائدة. على سبيل المثال: لتصيب 0.3 × 106 خلايا مع موي 10؛ سوف تحتاج إلى 3 × 106 تو المراد إضافتها إلى الخلايا 32D/ز-CSF-R.
  3. إضافة بوليبريني إلى التركيز النهائي 8 ميكروغرام/مل واحتضانها ح 6 عند 37 درجة مئوية. وبدلاً من ذلك، تنفيذ إجراء تلقيح تدور: الطرد المركزي في ز 1200 × لمدة 90 دقيقة في 30 درجة مئوية في صفيحة تثقيف استخدام دوار سوينغ-دلو، واحتضان ح 3 في 37 درجة مئوية.
  4. جمع الخلايا، نقل إلى أنبوب 15 مل، وتدور في 450 × ز لمدة 5 دقائق (4 درجات مئوية).
  5. تجاهل المادة طافية، ريسوسبيند الخلايا الأعلاف في 6 مل من الثقافة المتوسطة، ووضع في قارورة ثقافة الخلية T25، والثقافة في 37 درجة مئوية.
  6. 48 ساعة في وقت لاحق، حصاد الخلايا وتدور لهم في 450 × ز لمدة 5 دقائق (4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية.
  7. في حالة مراسل التجارة والنقل: وضع الخلايا في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وفرز الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ باستخدام أرز تدفق الخلوي. في حالة مراسل بوروميسين التي تحتوي على ناقل: وضع الخلايا في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 2 ميكروغرام/مل من بوروميسين.
  8. توسيع نطاق الخلايا حسب الحاجة لمزيد من التحليل والتجارب.
    ملاحظة: الخلايا ترانسدوسيد (اختياري) يمكن المجمدة في تجميد وسائل الإعلام في حاوية تجميد في-80 درجة مئوية، وكذلك تخزينها في نيتروجين سائل.

4-32D/ز-CSF آر خلية تحليل انتشار

  1. لتقييم انتشار معدل مكان 0.2 × 106 خلايا في 1 مل من الثقافة المتوسطة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. وفي اليوم التالي عد عدد الخلايا وتمييع لهم العودة إلى تركيز من 0.2 × 106 خلايا/مل تستخدم الثقافة المتوسطة. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. الاحتفاظ بسجلات لتركيزات الخلية وتخفيف المطبقة على ثقافات اليومية باستخدام الجدول 3.
  3. كرر الخطوة 4، 2 لعدد الأيام الانتشار يحتاج إلى تقييم.
    ملاحظة: طول فحوصات انتشار سيتوقف على تأثير الجينات للفائدة. في حالة النمط الظاهري قوية، 8-9 أيام قد تكون كافية لمراقبة تأثير كبير (انظر الشكل 3A). ومع ذلك، في حالة النمط الظاهري معتدل، فترات أطول من الزمن قد تكون لازمة.
  4. تقييم نمو الخلايا بجعل منحنى انتشار كما هو مبين في الجدول 3.

5-32D/ز-CSF آر خلية تحليل التمايز

  1. أغسل 0.2 × 106 خلايا 32D/ز-CSF آر مرتين مع المتوسطة ربمي دون السيتوكينات.
    ملاحظة: الخطوات الغسيل قبل إضافة ز-CSF في الثقافة هامة، نظراً لوجود بقايا إيل-3 قد تحول دون تفرقة.
  2. وضع الخلايا في 1 مل التمايز المتوسطة (التي تحتوي على 100 نانوغرام/مليلتر ز-CSF) في بئر 24/لوحة، أدى إلى تركيز خلية من 0.2 × 106 خلايا/مل (يوم 0). الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  3. حساب عدد الخلايا/مل كما هو مبين أعلاه (الخطوة 1.2.1).
  4. سيتوسبين 2-5 × 104 خلايا على شريحة زجاج (76 مم × 26 مم) باستخدام أجهزة الطرد مركزي مع محولات اللازمة في 20 × ز.
  5. تحديث تمايز الخلايا المتوسطة ولوح بتركيز 0.2 × 105 خلايا/مل في بئر 24/لوحة (1 يوم). تجاهل لوحة قديمة، والمضي قدما في اليوم التالي مع الخطوة 5.6 مع لوحة جديدة.
  6. في يوم 2 إلى 7، كرر الخطوات من 5.3 إلى 5.5. تقييم انتشار الخلايا حضور ز-CSF كما هو موضح في الخطوة 4.
    ملاحظة: (هام) خلال التمايز، يبطئ انتشار الخلايا، ولذلك بعد 3 إلى 4 أيام حضور ز-الخدمات القطرية أنها كافية لثقافة الخلايا بتركيزات أعلى.
  7. تقييم حالة تمايز الخلايا 32D/ز-CSF آر استناداً إلى مورفولوجيا الخلايا.
    1. إصلاح الخلايا من الخطوة 5.4 في الميثانول لمدة 5 دقائق في الرايت وتترك الشرائح أيردري.
      ملاحظة: الشرائح من 0 إلى 7 يوم يمكن تخزينها في الرايت، وثابتة في نفس الوقت. وبالمثل، يمكن أن توضع أيضا في RT لفترات أطول بعد التثبيت.
    2. وصمة عار الخلايا باستخدام Giemsa Grünwald أيار تلطيخ بروتوكول الشركة المصنعة التالية.
    3. تصور الملون الخلايا باستخدام مجهر والتكبير X40.
    4. التحديد الكمي لعدد من الانفجارات وخلايا متمايزة العولم المحببة الناضجة باستخدام صور توضيحية في الشكل 1 ووصف في الجدول 4.

النتائج

انتشار وتمايز الخلايا 32D/ز-CSF-R

لتقييم انتشار الخلايا 32D/ز-CSF آر تحت ظروف برو التكاثري والمؤيدة التمايز، كان مثقف خلايا 32D/ز-CSF-R في الوسائط التي تحتوي على 3 إيل وز-CSF، على التوالي. ولوحظ أن انقسام الخلايا المستزرعة في إيل-3 التي تحتوي على المتوسط (...

Discussion

اختيار نموذج تجريبي إحدى القضايا الرئيسية في مجال البحوث. على الرغم من أن يعتقد أن الخلايا الحيوانية والبشرية الأساسية لإنتاج البيانات ذات الصلة الأكثر بيولوجيا، هذه النماذج قد تشمل الشواغل الأخلاقية وغالباً ما تكون مقترنة بإجراءات مكلفة و/أو المتطورة العزلة/استزراع. الخلايا الأولية مح...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون البروفيسور رود دلول والبروفيسور إيفو تو لتزويدنا بخط الخلية 32D/ز-CSF آر، والبروفيسور دانيال زاي تينين على تزويدنا بخط الخلية Bosc23. أيد منح الوكالة منحة للجمهورية التشيكية (جاكر 15-03796S وجاكر 17-02177S) لما ي هذا العمل، ودعم من معهد علم الوراثة الجزيئي "أكاديمية العلوم التشيكية" (رفو 68378050) MA-ي، زمالة المملكة المتحدة GA (المشروع رقم 341015) من جامعة تشارلز في براغ لعضو الكنيست، وزمالة المملكة المتحدة GA (المشروع رقم 1278217) من جامعة تشارلز في براغ للمشتريات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 powder mediumMerck, Kenilworth, NJ, USAT 121-10without NaHCO3, with L-glutamine
DMEMThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15028
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA31985-047L-Glutamine, Phenol Red
Fetal bovine serum (FBS)PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)MT35011CVFor differentiation of 32D/G-CSF-R cells
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10270Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells
PenicillinSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)P3032
StreptomycinSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)S9137Streptomycin sulfate salt powder
GentamicinSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)G1914
murine IL-3PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA213-13
human G-CSFPeproTech, Rocky Hill, NJ, USA300-23
PolyethyleniminePolyscience, Warrington, PA, USA23966Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
PolybreneSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)H9268
TrypsinVWR Chemicals, Radnor, PA, USA0458
EDTASigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)E5134
Crystal violetSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)C0775
Trypan blueSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)T6146
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)D2650
May-Grünwald GiemsaDiaPath, Martinengo, BG, Italy10802

References

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132 32D CSF 3 CSF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved