JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تعمل خلية نائمة ونشط سرطان اتسمت استخدام تصوير المرحلة الكمية. خلية انتشار، والهجرة، ومورفولوجيا فحوصات متكاملة وتحليلها بأسلوب بسيط واحد.

Abstract

الحصول على النمط الظاهري الأوعية عنصر أساسي من الهروب من السكون الورم. على الرغم من أن قد وضعت الكلاسيكية في المختبر فحوصات (مثلاً، والانتشار، والهجرة، وغيرها) و في فيفو نماذج عديدة للتحقيق وتميز تعمل الخلية الأوعية وغير الأوعية، هذه الأساليب هي الوقت والعمل المكثف، وغالباً ما تتطلب الكواشف باهظة الثمن والصكوك، فضلا عن خبرة كبيرة. في دراسة أجريت مؤخرا، استخدمنا مرحلة كمية رواية التصوير تقنية (كبي) إجراء الأوصاف الوقت الفاصل بين وخالية من العلامات للأوعية وغير الأوعية خلايا كوس أوستيوساركوما البشرية. فريق معلمات الخلوية، بما في ذلك مورفولوجيا الخلايا وانتشارها، وحركية، تم قياسها كمياً وتحليلها باستخدام كبي. هذه الرواية والنهج الكمي يوفر الفرصة للدراسة بشكل مستمر وغير إينفاسيفيلي العمليات الخلوية ذات الصلة والسلوكيات، وخصائص الخلايا السرطانية وغيرها من أنواع الخلايا بطريقة بسيطة ومتكاملة. ويصف هذا التقرير لدينا بروتوكول تجريبية، بما في ذلك إعداد الخلية واقتناء قبي وتحليل البيانات.

Introduction

إحدى نقاط التفتيش أقرب في التنمية والتقدم من ورم صلبة هو اقتناء الأوعية النمط الظاهري، من السمات مميزة للسرطان. ويشمل هذا التقدم مجموعة متنوعة من العمليات الكيميائية الحيوية والجزيئية1،،من23. تحديا تقنيا في دراسة هذه الخطوة الرئيسية في تطور الورم هو عدم وجود أدوات كمياً بشكل مستمر وتميز وتفرق بين الأوعية والأوعية غير تعمل الخلايا السرطانية الحية بطريقة غير متحيزة. تتطلب فحوصات التقليدية المستخدمة للتحقيق في سلوك الخلوية لخلايا الأوعية والأوعية غير عادة الكواشف باهظة الثمن والصكوك، على سبيل المثال، الخلية الانتشار والهجرة فحوصات،،من45 6،،من78،9،10،11،12،،من1314 أو تكميلية في فيفو تقييمات4،5،،من68،15،16، فضلا عن التي تتطلب خبرة كبيرة ومكثفة استهلاك الوقت والعمل.

في الآونة الأخيرة، برز الكمية المرحلة التصوير (كبي) كأسلوب رواية التي تمكن من تقييم الوقت الفاصل بين وخالية من العلامات لمجموعة متنوعة من الخلية مورفولوجيا والسلوك معلمات17،،من1819، 20 , 21 , 22-خلافا للفحص المجهري الضوئي التقليدية، قبي يوضحها الاختلافات في مرحلة التحول بكسل بكسل بعد الضوء يمر من خلال كائن بصري، ويعيد بناء القرص مع سمك الضوئية المحولة ووحدة التخزين، مما مكن المباشرة تحليل الخلايا الحية والميزات التالية: التصوير (1) الكمية، (2) غير الغازية والوقت الفاصل بين التصوير والتصوير (3) خالية من التسمية وتصوير المعلمة متعددة (4) المتزامنة. هذه الميزات تجعل قبي أداة قوية لتقييم وفهم العمليات المرضية على المستوى الخلوي.

في دراسة أجريت مؤخرا، ونحن تستخدم قبي كمياً تميز وتفرق بين الأوعية خوس-أ وغير الأوعية خوس ن تعمل الخلايا البشرية أوستيوساركوما بطريقة منهجية والكمية، يجمع بين تحليلات مورفولوجيا الخلايا، الانتشار، وحركية23. استخدام برنامج تحليل الصور، فريق خلية المورفولوجية والسلوك قورنت معلمات كمياً بين الخلايا البشرية osteosarcoma الأوعية وغير الأوعية وحددت خمسة الفروق المميزة بين هذين تعمل. هذا النهج المبتكر يوفر منصة متكاملة والكمية لتقييم مجموعة متنوعة من الخصائص الخلوية البيولوجية ذات الصلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها لجنة السلامة الأحيائية المؤسسية المستشفى من "الأطفال بوسطن".

1-إعداد الخلية

  1. ذوبان الجليد، كوس والخلايا-N
    1. الاحماء الثقافة المتوسطة، أي، دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل العجل الجنين (المجلد/المجلد) (FBS) و 1% (المجلد/المجلد) البنسلين/ستربتوميسين.
    2. تأخذ قنينة المبردة من الخلايا من خزان النتروجين السائل وتزج الجزء السفلي من القنينات في المياه الدافئة في حمام مائي 37 درجة مئوية، وهزه بلطف قنينات المبردة لتسريع عملية ذوبان. الحفاظ على غطاء قنينات المبردة من الاتصال بالمياه لتفادي التلوث. حالما يتم إذابة الخلايا، تعقيم قنينة المبردة برش محلول الإيثانول 70% ومحو القنينة.
    3. في غطاء الاندفاق الصفحي، نضح فورا تعليق خلية من القنينة المبردة، وتعلق برفق في 10 مل استعد الثقافة المتوسطة (الموصوفة في 1.1.1). الطرد المركزي تعليق خلية في حوالي 200 غ س لمدة 5-7 دقائق.
    4. ريسوسبيند بيليه الخلية مع 10 مل استعد الثقافة المتوسطة، وتنقل إلى قارورة T75. بلطف "الماصة؛" عدة مرات بتعليق الخلايا بالتساوي باستخدام بيبيت 10 مل.
    5. وضع في قارورة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% (المجلد/المجلد) CO2 وجو هوميديفيد. السماح بإرفاق لمالا يقل عن 12 ح الخلايا.
    6. احتضان خلايا لحوالي 3-7 أيام حتى روافد 80-100%. تغيير الثقافة المتوسطة كل 2-3 أيام.
  2. تقسيم كوس-أ والخلايا-N
    1. قم بإزالة وسائط الثقافة من قارورة.
    2. تغسل الخلايا مع PBS العقيمة 5 مل (س 1) دون الكالسيوم والمغنيسيوم، لإزالة الخلايا غير ملتصقة أو الكسر.
    3. إضافة حل يدتا التربسين 0.05% 1 مل إلى قارورة، ودوامه بإيجاز في قارورة لضمان أن التربسين-يدتا موزعة بالتساوي.
    4. احتضان قارورة دقيقة 2-3 في حاضنة 37 درجة مئوية أو 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. فحص الخلايا تحت مجهر في حوالي 400 x التكبير للتأكد من أن الخلايا هي تقريب والمنفصلة.
    5. حالما يتم فصل الخلايا، أضف 10 مل الثقافة المتوسطة ولطف "الماصة؛" المتوسط صعودا وهبوطاً عدة مرات لتفريق المجاميع الخلية في تعليق خلية مفردة باستخدام بيبيت 10 مل.
    6. حساب عدد الخلايا باستخدام عداد خلايا. البذور بتعليق خلية في قوارير T75 جديد في كثافة 2 × 106 خلايا أو بنسبة 1:4.
    7. السماح للخلايا أن تنمو إلى التقاء 80-100% قبل البذر للتجربة كبي.
  3. خلايا-N كبي والبذر كوس-أ
    1. خلايا-N في لوحات 6-جيدا في كثافة الخلايا 50,000-300,000/جيدا مع 5 مل الثقافة المتوسطة بعد عد مع عداد خلية والبذور كوس-أ.
      ملاحظة: كثافة البذر يتوقف على معدل انتشار الخلايا، والفترة الزمنية التصوير كي يكون < التقاء 100% أثناء التصوير اقتناء.
    2. احتضان خلايا على الأقل 12 ح للسماح بالمرفقات.
    3. تغيير المتوسطة مع وسائط جديدة قبل إجراء قبي.

2-كبي اقتناء

  1. كشف غطاء إعداد
    1. تنظيف بكشف الغطاء عن طريق الشطف عدة مرات مع تشغيل المياه وتعقيم مع 75% من محلول الإيثانول بالغمر عن 15 دقيقة بدأ بكشف الغطاء غطاء الاندفاق الصفحي عقيمة لتجف.
    2. ضع بعناية بكشف الغطاء على طبق من ذهب 6-جيدا لتجنب فقاعات واضحة. التأكد من أن الجزء السفلي من كشف الغطاء هي مغمورة في ثقافة وسائل الإعلام (والحد الأدنى 5 مل/أيضا).
    3. ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية و أول أكسيد الكربون 5%2، وجو هوميديفيد) حجته لمدة 15 دقيقة على الأقل. إذا كان الضباب أشكال على كشف الغطاء، واستخدام مسحه القطن معقمة للقضاء عليه نظيفة.
  2. تصوير الخلايا بالمجهر
    1. قم بفتح البرنامج لتهيئة النظام، بما في ذلك معايرة الذاتي من زمن التعرض للضوء والتباين نمط الضوضاء صورة ثلاثية الأبعاد. تأكد من أن القيم مقبولة (كما هو موضح في النطاق الأخضر أو الأصفر).
    2. ضع لوحة 6-جيدا على خشبة المسرح المجهر كبي.
    3. انقر فوق "التقاط العيش"، وحدد "الدليل" في "برنامج التركيز." خشنا تركز الصور المرحلة من الخلايا عن طريق ضبط المسافة العمل في "وضع المجهر" للحصول على الخطوط العريضة للخلايا في مرحلة الصور. تغيير إلى "تلقائي" في "برنامج التركيز."
    4. انقر فوق "التجربة الجديدة" لإنشاء تجربة جديدة. ابدأ باختيار مواقع الحصول على الصورة باستخدام الماوس أو مفاتيح الأسهم على لوحة المفاتيح الرقمية. انقر فوق "تذكر" بعد كل تحديد. عادة ما يتم تحديد مواقع 3-5 لكل عينة.
    5. قم بإعداد فترات التصوير والفترة الزمنية في المقطع "Timelapse".
      ملاحظة: لتعقب الخلايا السرطانية واضح، ينبغي أن يكون الفترات أقصر من 5 كحد أدنى 48 ساعة تم تعيينها كفترة زمنية للجمع بين التحليل قبي.
    6. تبدأ التجربة بواسطة النقر فوق "التقاط"، التي ستركز تلقائياً والحصول على الصور في نقاط وقت الإعداد.

3-بيانات التحليل

  1. تحليل مورفولوجيا الخلايا
    1. انقر فوق "تحديد الخلايا". قم بضبط الإعداد الرقمية لعتبة "الخلفية" حيث أنه يتم فصل مناطق الخلية جيدا من ضجيج الخلفية. ضبط عدد الإعداد "حجم الكائن" للتأكد من أن كل خلية تحتوي على نواة واحدة. الحفاظ على معلمات متسقة للعينات التي تحتاج إلى أن تكون المقارنة، كما قد تؤثر هذه القياسات وحجم النهائي. تعديل أجزاء الخلية يدوياً باستخدام "تغييرات يدوية،" إذا لزم الأمر.
    2. استخدم الدالة "تحليل البيانات" في البرنامج لتحليل الخلايا. بدء تحليل جديد لبيانات بواسطة النقر فوق "تحليل جديدة". اسحب الصور المحددة إلى "مصدر الإطارات" التبويب وخلية مورفولوجيا المعلمات بما في ذلك منطقة الخلية (2من ميكرومتر)، وسمك الضوئية (ميكرومتر)، وحجم (3من ميكرومتر) لكل خلية فردية. اختر مبعثر مؤامرة أو الرسم البياني الوضع وتصدير البيانات كالجداول أو الأرقام.
  2. تحليل انتشار الخلايا
    1. حدد على الأقل 5 صور لنقاط زمنية مختلفة للفائدة (مثلالأولى، ح 12، ح 24، ح 36 وح 48). خلية تسجيل الأرقام التي يتم توفيرها من قبل البرنامج.
    2. لتقدير الوقت مضاعفة، ارسم أرقام الخلية بعد تطبيع مع الأرقام الأولية وتناسب مع منحنيات النمو المتسارع.
  3. خلية تحليل الحركة
    1. استخدم الدالة "تعقب الخلايا" في البرنامج. انقر فوق "تحليل جديد" لبدء إجراء تحليل بيانات جديدة. سحب سلسلة من الصور لفترة زمنية محددة (مثلاً، ح 4 بعد حضانة 24 ساعة) في علامة التبويب "مصدر الإطارات" اختيار عشوائي 10-30 الخلايا بالنقر فوق الخلايا ضمن وضع التحديد "إضافة خلايا". استبعاد الخلايا على الحواف وتلك التي تنتقل من مجال الرؤية.
    2. فحص دقيق للتتبع في سلسلة الصور. في حالة ما إذا يفقد مسار خلية النظام أو مسارات الخلية غير صحيح، يدوياً ضبط الخلية تتبع بالنقر فوق "تحديد" لتحديد الخلايا أو النقر فوق "تعديل الموقع" ضمن الوضع "Select" تعديل موقع الخلية.
    3. اختر الأرض ارتفع من مسارات الخلية في "حركة الأرض" أو مؤامرة للمعلمات المتعلقة بالحركة الأخرى في "مؤامرة ميزات" مثل سرعة حركية (ميكرومتر/h) وحركية (ميكرومتر) والهجرة (ميكرومتر) والهجرة المباشرة. تصدير البيانات كالجداول أو الأرقام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويصور الشكل 1 وصفاً مورفولوجيا خلية نموذجية. وتعرض الصور هولوجرافس (الشكل 1A-ب) وصور ثنائية الأبعاد (الشكل 1-د). سمك الخلية الضوئية (محسوبة من الانكسار وطول مسار بصري) كمياً عن طريق خط الشخصية أو قياس خلية كل?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه الدراسة، يصف لنا في المختبر، غير الغازية، وخالية من تسمية أسلوب استخدام كبي كمياً تميز تعمل الأوعية والأوعية غير الخلايا البشرية osteosarcoma. قد تم تحليلها معلمات الخلوية متعددة في نفس الوقت بهذه الطريقة المتكاملة، والإنتاجية العالية، بما في ذلك منطقة الخلية، سمك الخلية، حجم الخل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وأعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

امتنان يعترف الكتاب الدعم من مؤسسة أبحاث سرطان الثدي ومؤسسة البحوث الطبية المتقدمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
T75 flaskCorning, NY, USA353136
6-well plates Corning, NY, USA3506
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA11965092
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals, GA, USAS11550
Penicillin StreptomycinThermo Fisher Scientific, MA, USA15140122
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA10010023
Beckman Z1 Coulter counterBeckman Coulter, IN, USAZ1 
HoloMonitor M4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SwedenM4Microscope
HololidPhase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SwedenPHI 8020
HStudioM4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SwedenHStudioM4Software

References

  1. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
  2. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
  3. Harper, J., Moses, M. A. Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications. EXS. (96), 223-268 (2006).
  4. Naumov, G. N., et al. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).
  5. Fang, J., et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).
  6. Almog, N., et al. Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype. Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).
  7. Hu, J., et al. Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer. Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).
  8. Harper, J., et al. Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24. Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).
  9. Jia, D., et al. Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo. Blood. 121 (4), 707-715 (2013).
  10. Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).
  11. Almog, N., et al. Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).
  12. Almog, N., et al. Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype. PloS One. 7 (8), e44001(2012).
  13. Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PloS One. 7 (9), e44395(2012).
  14. Almog, N., et al. Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190. Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).
  15. Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 319 (5860), New York, N.Y. 195-198 (2008).
  16. Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).
  17. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw-Hill: New York. (2011).
  18. Lee, K., et al. Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  19. Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. Quantitative Phase Imaging. Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).
  20. Marrison, J., Räty, L., Marriott, P., O'Toole, P. Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information. Scientific Reports. 3, 2369(2013).
  21. Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gjörloff Wingren, A. Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells. PloS One. 9 (9), e106546(2014).
  22. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).
  23. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).
  24. Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PloS One. 9 (2), e89000(2014).
  25. Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy. Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).
  26. Park, Y., et al. Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).
  27. Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. Real time blood testing using quantitative phase imaging. PloS One. 8 (2), e55676(2013).
  28. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 5, 9976(2015).
  29. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, 34257(2016).
  30. Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry. Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved