الأزرق إيفانز أمثل البروتوكول لتقييم تسرب الأوعية الدموية في الماوس

Summary

ويرد بروتوكولا اقتصادا والأمثل، وبسيطة في هذه المادة، الذي يستخدم الأسلوب صبغة زرقاء إيفانز لتقييم التسرب البلازما في الأجهزة من الفئران ففبن التي يمكن تكييفها للاستخدام في السلالات الأخرى، والأنواع، والأخرى أو الأنسجة.

Abstract

تسرب في الأوعية الدموية، أو التسرب البلازما، يحتوي على عدد من الأسباب، وقد يكون نتيجة خطيرة أو أعراض الاستجابة الالتهابية. هذه الدراسة قد تؤدي في نهاية المطاف إلى المعارف الجديدة بشأن الأسباب أو طرق جديدة لمنع أو علاج التسرب البلازما. من المهم أن الباحثين لها الأدوات المناسبة، بما في ذلك أفضل الطرق المتاحة، لدراسة التسرب البلازما. في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول، استخدام أسلوب صبغة زرقاء إيفانز، من أجل تقييم التسرب البلازما في الأجهزة من الفئران ففبن. هذا البروتوكول بسيط عن عمد، لكبيرة بدرجة ممكن، لكنه يوفر بيانات عالية الجودة. تم اختيار صبغ إيفانز الأزرق أساسا لأنه من السهل للمختبر متوسط لاستخدام. أننا استخدمنا هذا البروتوكول أن تقدم الأدلة وتقديم الدعم للفرضية القائلة بأن نيبريليسين الإنزيم قد تحمي المفرج ضد التسرب البلازما. ومع ذلك، قد تستخدم تجريبيا هذا البروتوكول وتكييفها بسهولة للاستخدام في سلالات أخرى من الفئران أو في الأنواع الأخرى، وفي كثير من الأعضاء أو الأنسجة، مختلف الدراسات التي قد تنطوي على العوامل الأخرى التي تعتبر مهمة في فهم أو منع أو علاج التسرب البلازما. وقد تم تحسين هذا البروتوكول على نطاق واسع وتعديل البروتوكولات القائمة، ويجمع بين الموثوقية، وسهولة الاستخدام، والاقتصاد، والتوافر العام للمواد والمعدات، مما يجعل هذا البروتوكول متفوقة للمختبر متوسط لاستخدامها في تحديد كمية التسرب البلازما من الأجهزة.

Introduction

تسرب الأوعية الدموية في الأجهزة تشير إلى التسرب، أو تسرب لبلازما الدم من خلال الثغرات التي أنتجت في البطانة من وظيفة الأوردة الشعرية في الأجهزة. هذا التسرب البلازما أو زيادة نفاذية الأوعية الدموية، التي قد تنشأ من بعض نوع استجابة التحريضية، قد يؤدي إلى عواقب خطيرة. وبالتالي، فمن المهم أن دراسة هذه الظاهرة وأسبابها، والمغيرون، وعواقبه، ويفهم، وعلى نحو مماثل، أن المحققين لديهم جيدة الأدوات والبروتوكولات الملحقة بها لدراستها. الثغرات غشائي قد تنتج عن طريق عدد من المحفزات، ولكن عادة ما يتم إنتاجها بفعل العصبية الببتيد و/أو تاتشيكينينس على الجهاز. أحد الوسطاء طبيعيا الرئيسية لهذه العملية، مما يؤدي إلى زيادة البلازما التسرب، هو أونديكابيبتيدي تاتشيكينين نيوروبيبتيدي، فماده¹.

أساليب التحقيق وقياس نفاذية الأوعية الدموية أو التسرب البلازما، التي تستخدم خاصية الربط الزلال من صبغة زرقاء إيفانز، قد وضعت، وعادة ما تكون معروفة بدقتها، البساطة، والاقتصاد، والسلامة، وقدرة على السماح تحديد التسرب البلازما من أنسجة عدة في وقت واحد، إذا كان الأمر كذلك المطلوب^2،3،4،،من^56،،من^78،9 . هذا البروتوكول إيفانز الأزرق لتقييم التسرب البلازما في الأجهزة من الفئران ففبن يستخدم كل هذه، ولكنها تضيف بعض التعديلات الهامة التي تجعل من عموما مفيدة وقابلة للتكيف للدراسات المستقبلية، التي تشمل المختبر متوسط التي تنظم أو سوف إجراء دراسات هامة من العوامل المرتبطة بالتسرب البلازما أو نفاذية الأوعية الدموية. في هذا البروتوكول، وهو عرض فماده للفئران نمول 1/كغ، التي تقوي التسرب البلازما ب 1.5-fold. وهذا يزيد من الحساسية للبروتوكول، وأسفر عن نتائج قابلة للملاحظة ويمكن الحصول عليها بسهولة أكبر. قد تستخدم العوامل الأخرى التي تؤثر على نفاذية، مثل الببتيدات الأخرى المختلفة، والمواد الكيميائية، أو بعض أشكال الإصابة السامة، أو درس بمختبرات أخرى، كما هو مطلوب. وتستخدم حقن الوريد في هذا البروتوكول ﻹدخال الأزرق إيفانز ومضمون فالنظاميه، الأمر الذي يتطلب جراحة المحطة الطرفية. حبل الوريد الحقن^5،،من⁷¹⁰، حتى بعد النظر في التقنيات الجراحية اللازمة المحطة الطرفية، غير أسهل السيطرة ويؤدي إلى إنتاج نتائج أكثر اتساقا أكثر من دولة أخرى الحقن الوريدية، بما في ذلك الذيل الوريد الحقن^4،9. على الرغم من أنه قد يكون من الممكن إيفانز الأزرق سيدلي به حقن الجيوب الوريدية الرجعية-المداري، لا مراجع في الأدب قد وجد أن استخدام هذا الأسلوب لتسليم الأزرق إيفانز. بيد أما بالنسبة لحقن الوريد الذيل، درجة عالية من الخبرة والممارسة لتكاثر إتقان هذا الأسلوب إلى حد كبير حدود استعماله لنجاح إيفانز الأزرق الحقن. وفي المقابل، أسلوب الحقن بالوريد البديلة كما هو موضح في البروتوكول، ولدينا يقدم حلاً يمكن الحصول عليها من الناحية الفنية. تنفيذ إجراء حاسما لنضح عروق الماوس، فقط بعد التضحية بالماوس perfused الأزرق إيفانز، يزيل صبغ إيفانز الأزرق الزائدة، وقد تم توحيدها في هذا البروتوكول. الأساليب المذكورة سابقا من نضح قد درست بعناية وتعديلها للحصول على الإجراء الحالي. التعديلات الأخرى الموصوفة هنا جميع الأمثل ومباشرة، وغير مكلفة.

هناك بعض القيود الهامة للأسلوب صبغة زرقاء إيفانز. على سبيل المثال، قد تمنع حساسية منخفضة في بعض الأحيان المرتبطة بهذا الأسلوب بعض الفحص الإجمالي المرضية ونسيجية إضافية من الأنسجة من إيفانز الأزرق حقن الحيوانات. ومع ذلك، هذه وغيرها من القيود التي أدت إلى تطوير طرق بديلة والنماذج التي، على الرغم من ذلك، لا تزال تستخدم إيفانز الأزرق. قياس الأزرق إيفانز بالأسفار (بدلاً من مدى البصر) التحليل الطيفي قد تزيد حساسية الأسلوب. بالإضافة إلى ذلك، وضعت الأسفار مجهرية من الأنسجة الملطخة بالأزرق إيفانز للسماح لمراقبة تسرب الأوعية الدموية في مواقع متميزة أكثر¹¹. أيضا، كامل الجسم التصوير والمسح الحيوانات الحية سابقا حقن مع إيفانز الأزرق¹² يسمح للتحقيق في تركيزات إيفانز الأزرق بطريقة مستمرة، بدلاً من واحدة خاصة باختيار وقت نقطة من التجربة. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب توافر مرافق التصوير المناسبة، وقد تكون مكلفة للغاية. تعديلات تشمل إيفانز الأزرق والمؤداة في نوع في المختبر من النموذج، كما هو الحال في خلية الثقافة أو الفرخ النموذجي تشوريوالانتويك¹³ (كام) أيضا قد وصف. هذه النماذج تتم مراقبتها بواسطة الأسفار والفحص المجهري إينترافيتال¹⁴ ، والسماح للتحديد الكمي للتغييرات نفاذية الأوعية الدموية على مر الزمن، ولكن قد تثير مسائل تتعلق بالنمذجة الدقيقة في فيفو الظروف وقد تكون أيضا باهظة الثمن.

وهناك أساليب أخرى لتحديد وقياس تسرب الأوعية الدموية أو النفاذية، التي لا تنطوي على إدارة إيفانز الأزرق. قد تستخدم هذه الأساليب جزيء فلوري مناسبة (مثل الزلال أو فلوريسسين)، أو جزيء المعلمة نظير مسماة أو خلاف ذلك، الحيوانات الحية (أو إلى الخلية الثقافة أو تشوريوالانتويك (كام) نماذج¹³، تليها غير الغازية التصوير (المسح الحيوانات الأليفة، التصوير بالرنين المغناطيسي، مجهرية إينترافيتال، ومسح الجسم بأكمله) أو بواسطة الغازية التصوير (مجهر فلوري)^3،،من¹²¹⁵. على الرغم من أن هذه التقنيات قد توفر عددا من المزايا أكثر من غيرها إيفانز أساليب الأزرق، لديهم أيضا العيوب، التي قد تتضمن تعقيدات كبيرة، والخبرة المطلوبة، ومواردها، وارتفاع التكاليف النقدية.

نيبريليسين¹⁶ (peptidase الإنزيم NEP، المعروف أيضا CD10 أو مدام أو انكيفاليناسي) قد اقترح أن تشارك في منع التسرب البلازما، على الأقل جزئيا، من خلال التمثيل الغذائي الانزيمية والمنظمة الذاتية الجوهر ص وهكذا، في الأنسجة التي يحدث فيها بيبتيداسي الخلية السطحية NEP، قد يكون هناك تخفيف أثر فالجوهر، يفترض بنشاط بيبتيداسي NEP.

في البداية، قمنا باختبار للتسرب الناجم عن فماده البلازما استخدام هذا البروتوكول إيفانز الأزرق المعدلة، مع نوع البرية ففبن (وزن) والفئران (كو) بالضربة القاضية NEP. كان يشتبه في تورط NEP في التسرب المعقم فماده البلازما من هذه الدراسات الأولية، ونحن تصف هذه، وكذلك تجارب دور تشمل NEP في التسرب البلازما. ومع ذلك، التركيز في هذه المخطوطة ليست NEP أو دورها في التسرب البلازما، ولكن بدلاً من التسرب البلازما التجارب نفسها. النتائج NEP هي الممثل لهذا النوع من النتائج التي يمكن الحصول عليها من خلال استخدام هذا البروتوكول المعدل. وقد الأمثل الأسلوب إيفانز الأزرق لقياس التسرب البلازما وتعديلها، كما هو موضح بالتفصيل أدناه للفئران ففبن.

Protocol

وتلت جميع المبادئ الدولية والوطنية، و/أو المؤسسية من التوجيهية المطبقة لرعاية واستخدام الحيوانات (الفئران) في التجارب الموصوفة في هذه المخطوطة.

يستخدم هذا الأسلوب ففبن الفئران الكبار، الذين تتراوح أعمارهم بين 16-20 أسبوعا، تبين أن أمثل لأغراض هذه الدراسة. 1 اليوم الخطوات من 1-5 ويوم 2 تشمل الخطوات 6-7 (الشكل 1).

1-معدات التحضير

1. تأمين إمدادات كافية من المحاقن المعقمة، والمتاح والإبر، وإذا استخدم كالمخدر الكيتامين/إكسيلازيني (على النحو الموصى به). إذا تم استخدام إيسوفلوراني كالمخدر، التحقق من خزان الأكسجين ومستوى السائل إيسوفلوراني للتأكد من أن هناك إمدادات كافية للتجربة قبل البدء. كما أن تجميع نوسيكوني التنفس الدوائر وإرفاقها بمربع التعريفي؛ إرفاق الدموع الفحم الجديدة للدوائر في التنفس. إعداد مربع التعريفي بتحول على الأكسجين، والتأكد من أن يقرأ المرحلة الثانية حوالي 50 رطل/بوصة مربعة.
2. قم بتشغيل لوحة التدفئة إلى 37 درجة مئوية.
3. إعداد التحقيق درجة حرارة المستقيم لعملية جراحية.

2. إعداد الماوس

وتشمل هذه الخطوة التخدير، وإزالة الشعر، وتحديد المواقع (ففبن الفئران-سن البلوغ 16-20 أسبوعا).

1. وزن الفئران وتسجيل الأوزان.
2. تخدير الفئران.
   1. إدارة الملكية الفكرية الكيتامين و xylazine (80-100 مغ/كغ و 7.5-16 مغ/كغ، على التوالي). ومع ذلك، من المستحسن أن تبدأ بجرعات أقل من الكيتامين و xylazine (حول 30 ملغ/كغ و 6 مغ/كغ، على التوالي).
   2. المحافظة على التخدير مع حوالي 0.1-0.25 مرات الأولى جرعات من الكيتامين/xylazine طوال عملية جراحية. الكيتامين و xylazine، مخدر (المحليون) الاختيار في هذه الدراسة خاصة، كما لوحظت أكثر من إمكانية تكرار نتائج والبقاء على قيد الحياة. يمكن الاطلاع على مخدر (المحليون) الاختيار في دراسات أخرى أن تكون مختلفة.  إذا تم استخدام إيسوفلوراني، ضع الماوس في دائرة التعريفي وقم بتشغيل إيسوفلوراني إلى 5% حتى الماوس يفقد وعيه الكامل. ثم استخدم نوسيكوني الآنف تعيين في إيسوفلوراني 1.5-2.5 في المائة طوال ما تبقى من هذا الإجراء.
3. مراقبة الفئران كل دقيقة 2-3 برشة إصبع القدم للتأكد من ملائمة عمق التخدير.
4. حلاقة منطقة الرقبة البطني من الماوس.
5. ضع الماوس في وضع ضعيف على لوح مسخن. تأمين آثار أقدام واقدام من الماوس على سطح الجراحية مع الشريط.
6. ضع مرهم المسيل للدموع الاصطناعية على العينين لمنع الجفاف أثناء الجراحة.

3-العمليات الجراحية التفاصيل

1. جعل شق 1 سم في الرقبة حق البطني أكثر من حبل الوريد.
2. تطبيق قطرات واحد أو اثنين من يدوكائين (1-2 ٪) في منطقة شق لإدارة الألم وتعزيز توسع الأوعية. انتظر 2 دقيقة ليدوكائين المفعول.
3. فضح وعزل حبل الوريد الداخلي الحق عن طريق تشريح كليلة. ربط الوريد قبالة مع خياطة 4-0، وسحب بلطف نهاية السفينة مع هيموستات روسترال. قطع حفرة، استخدام مقص جيد، حوالي 3 مم أدناه أو والذيلية للتعادل، تقريبا في منتصف الطريق من خلال قطر الوريد.
4. مارك قسطرة البولي فينيل الكهروضوئية-1 1.5 سم من النهاية وأدخله في الوريد من خلال الثقب في استخدام ديلاتور سفينة، والخيط القسطرة نهاية والذيلية للسفينة، وحوالي 1.5 سم.
5. التعادل القسطرة بأمان داخل الجزء والذيلية من السفينة (تحت القص) مع الحرير 4-0. ربط الجزء روسترال من السفينة إلى خارج القسطرة مع نهايات فضفاض خياطة الجروح التي استخدمت لربط قبالة روسترال حبل الوريد، في الخطوة 3، 3.
6. تك الجلد فضفاضة معا مرة أخرى حول القسطرة مع الحرير 4-0 للمساعدة في منع فقدان حرارة الجسم وجفاف الأنسجة.
7. توصيل القسطرة بحقنه تحتوي على هيبارينيزيد المالحة (10 U/mL) وتدفق القسطرة.

4-حقن

1. حقن قسطرة الوريد، تليها كمية صغيرة من المحلول الملحي هيبارينيزيد لمسح الخط الحل إيفانز الأزرق (50 ميكروليتر من حل 30 ملغ/مل في المحلول الملحي العادي، أونهيبارينيزيد 0.9 في المائة، أو ما يقارب 50 مغ/كغ).
2. 2 دقيقة في وقت لاحق، حقن مادة ف (100 ميكروليتر من حل 0.3 ميكرومتر في المحلول الملحي العادي، أونهيبارينيزيد 0.9%، أو نمول 1/كجم)، تليها كمية صغيرة من المحلول الملحي هيبارينيزيد لمسح الخط. فماده تقوي التسرب بروتينات البلازما من خلال الطبقة غشائي؛ في هذا البروتوكول، فإنه يدفع بشكل روتيني زيادة قيم التسرب البلازما 1.5-fold تقريبا، مما يجعل البلازما القيم التسرب الأسهل لقياس.
3. انتظر 18 دقيقة بعد أن يتم حقن مادة P. خلال هذا الوقت، سوف حجته الصبغة الزرقاء إيفانز وتعميمها.
4. إنهاء هذه التجربة 18 دقيقة بعد حقن مادة ف (20 دقيقة بعد الحقن إيفانز الأزرق) بالتضحية بالماوس مع التفكك عنق الرحم. ومن المرجح أن الماوس يمكن أن مباشرة سيرفيكالي خلع، دون إعطاء أول جرعة زائدة من مخدر، أن الفأر هو على الأرجح لا يزال جيدا أنيسثيتيزيد من الجراحة. ومع ذلك، إذا لزم الأمر، جرعة زائدة من المسكنات الكيتامين/إكسيلازيني أو إيسوفلوراني، أو بينتوباربيتال قد تمنح، يليه سرطان عنق الرحم التفكك.

5-عزل الأجهزة

1. قص فتح تجويف الصدر من الماوس والجاذبية-نتخلل (من على ارتفاع حوالي 51 سم أو 20 بوصة) بالقلب والأوعية الدموية مع 50 مل سترات الصوديوم 50 مم، 3.5 درجة الحموضة. يفترض أن يحفظ pH 3.5 ملزمة إيفانز الأزرق للزلال.
2. المكوس الأجهزة ذات الصلة (الأنسجة) 1-5 مع مشرط تشريح (المثانةمثل الكلي، المعدة، الكبد، البنكرياس، القريبة أو البعيدة القولون، الدقاق، العفج، الجلد الجناح، آذان، الذيل، القلب والرئتين) وإزالة أي محتويات المتبقية، إذا الحالية.
3. شطف الأجهزة في درجة حرارة الغرفة (RT) مخزنة الفوسفات المالحة (برنامج تلفزيوني؛ ز 1.44 غ₂HPO4، 0.24 ز خ₂PO4, 8.0 g من كلوريد الصوديوم، وز 0.20 من بوكل في 1 لتر، درجة الحموضة 7.4).
4. لطخة الأجهزة مع الأنسجة وقطع كل جهاز في النصف، وتزن كل نصف (الرطب الأوزان، في ز).
5. الجاف لواحد نصف الأنسجة في فرن تجفيف عند 150 درجة مئوية، في إحباط، عن ح 48.
6. ضع الأنسجة الأخرى نصف في وحدة متسقة (تصل إلى 200 ميليلتر) من ميثلامين في [ميكروفوج] أنابيب ح 48 (وما يصل إلى 72 ساعة) لاستخراج إيفانز الأزرق.

6-قياس الأنسجة OD

1. إزالة 50 ميليلتر من ميثلامين الأزرق-أكسب إيفانز (بعد 48-72 ح RT الحضانة) من [ميكروفوج] أنابيب ومكان في بئر واحدة للوحة البوليستيرين 96-جيدا. كن حذراً لا لنقل قطع الأنسجة جنبا إلى جنب مع ميثلامين.
2. مكان 50 ميليلتر من ميثلامين نقية وجديدة في كل من بئرين فارغة من لوحة 96-جيدا للفراغات.
3. قياس وتسجيل OD₆₂₀ من كل بئر من لوحة 96-جيدا على قارئ لوحة امتصاص. 620 نانومتر هو امتصاص ماكس الأزرق إيفانز.

7-حساب التسرب البلازما

1. وزن الأنسجة الجافة النصف الذي تم في الفرن ح 48.
2. حساب نسبة وزن جاف الوزن الرطب جهاز معين من الفائدة من كل الماوس الفردية، بدءاً من الوزن الرطب لهذا النسيج نصف (التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.4)، مقسوماً الوزن الجاف لهذا النسيج نفسه نصف (التي تم الحصول عليها في الخطوة 7، 1).
3. حساب الوزن الجاف (في ز) الأنسجة نصف في ميثلامين بقسمة الوزن الرطب من الأنسجة النصف قبل أنه وضع في ميثلامين (التي تم الحصول عليها في الخطوة 5، 4) بواسطة الرطب: نسبة الوزن الجاف لجهاز معين للفائدة (المحسوبة في الخطوة 7، 2).
4. حساب القيم₆₂₀ OD تصحيحه . بدءاً OD₆₂₀ القيمة من كل بئر تجريبية للوحة 96-جيدا (التي تحتوي على ميثلامين الأزرق-أكسب إيفانز من كل الأنسجة، والتي تم الحصول عليها في الخطوة 6.3)، طرح فارغ جيدا قيمة₆₂₀ OD (يعني OD₆₂₀ قيمة OD بئرين المحتوية على ميثلامين نقية، أعدت في الخطوة 6، 2،₆₂₀ القيم التي تم الحصول عليها في الخطوة 6.3) من كل قيمة تجريبية.
5. حساب قيمة التسرب البلازما بقسمة OD المصوبة₆₂₀ (المحسوبة في الخطوة 7، 4) الوزن الجاف للأنسجة نصف في ميثلامين (المحسوبة في الخطوة 7، 3). وستكون وحدات بلازما التسرب OD₆₂₀/g الوزن الجاف.
6. تحليل البيانات وصريح كالمتوسط ± "sem. إحصائيا" مقارنة مجموعات اختبار t أو تحليل التباين أحادي الاتجاه واختبار متعددة-مقارنة في Scheffé (lycofs01.lycoming.edu)، حسب الاقتضاء.

النتائج

في الشكل 1، تخطيطي للإجراء الذي يظهر، التي تم العثور عليها لتؤدي القيم التسرب البلازما المستحثة فماده موثوقة ومتسقة من الأجهزة للفئران ففبن. هذا الإجراء عادة ما يستغرق يومين عمل، مفصولة بواسطة مالا يقل عن 48 ساعة وقت الانتظار. فمن الممكن انتشرت حتى أكثر من...

Discussion

كما نوقش أعلاه، دراسة التسرب البلازما قد تؤدي في نهاية المطاف إلى المعارف الجديدة بشأن الأسباب أو طرق جديدة لمنع أو علاج التسرب البلازما. الاستخدام الناجح لبروتوكول التسرب البلازما (أعلاه)، باستخدام صبغة زرقاء إيفانز، قد تجلى في المخطوطة الحالية. على الرغم من أن البيانات أظهرت مرة أخرى ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane	Vet One	200-070	inhaled anesthetic
ketamine	Vet One	200-055	injectable anesthetic
xylazine	Lloyd Laboratories	139-236	injectable anesthetic
syringes (10,3 & 1 cc)	Becton Dickinson	309604, 309657, 309659
needles (20G1,23G1 & 26G1/2)	Becton Dickinson	305178, 305193, 305111
isoflurane induction chamber	VetEquip	941443	1 Liter
nosecone breathing circuits	VetEquip	RC2	Rodent Circuit Controller 2
oxygen tank	Airgas	UN 1072	100% medical
heating pad	CWE Inc.	TC-1000	temperature controller
rectal temperature probe	CWE Inc.	10-09012	mouse
balance (for rodents)	Ohaus	CS 2000
surgical tools-scissors	Fine Science tools	15000-00	Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11151-10	Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13009-12	Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools -suture drivers	Fine Science tools	12502-12	Olsen-Hegar suture drivers (suturing)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11627-12	Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14110-15	Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	18025-10	suture tying forceps (used for Millar cath)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14078-10	Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11254-20	Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14082-09	Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11051-10	10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11251-35	Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)
surgical tools-retractors	Fine Science tools	17012-11	Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11294-00	Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11297-00	Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14058-11	tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11009-13	serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13003-10	Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11006-12	Adson serrated forceps (tissue grasping)
clippers	Oster	A5
tape	Fisherbrand	159015G
artificial tear ointment	Akorn Inc	13985-600-03
lidocaine	Hospira	0409-4277-01	2% injectable
polyvinyl catheters	Tygon	PV-1
Evans blue	Sigma Aldrich	E2129
Substance P	Bachem	H-1890
heparin	Sagent Pharmaceuticals	25201-400-10	1000 U/ml
saline solution	Hospira	0409-7138-09	0.9% sodium chloride
phenobarbital	Vortech	0298-9373-68
sodium citrate	Fisher Scientific	BP327-1
PBS	Sigma Aldrich	P4417-50TAB
Kimwipes for blotting	Fisher Scientific	06-666A
formamide	Sigma Aldrich	47670
microbalance	Denver Instrument	APX-60
microfuge tubes	Fisher Scientific	07-200-534
polystyrene 96 well plate	Becton Dickenson	351172
absorbance plate reader	BioTek	Synergy 2
polyacrylamide gels	Bio-Rad	3450014
protein molecular weight standard	Bio-Rad	1610374
Protran supported nitrocellulose	Amersham (GE)	10600015
gel box	Bio-Rad	1658005
Tris	Fisher Scientific	BP152-1
Tween20	Sigma Aldrich	P-1379
sodium chloride	Fisher Scientific	S271-1
primary NEP polyclonal antibody	R & D Systems	AF1182
doxycycline chow	Teklad (HARLAN)	TD.130750
FVB/NJ wild type mice	Jackson	001800
secondary antibody (goat anti-rabbit)	ZyMed	81-6120
ECL solution-Western Lightening Plus	PerkinElmer	NEL104001EA
film	Pierce	34091