JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يرد مقايسة fluorescence سهلة لتقييم كفاءة أزواج الأمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز/الحمض الريبي النووي النقال دمج البروتينات في خلايا الثدييات غير المقبول-الأحماض الأمينية (ncAAs). ويرد وصف تطبيق ncAAs لدراسة مستقبلات مقترنة بالبروتين G (جبكرس)، بما في ذلك رسم الخرائط crosslinking صور لربط المواقع ووسم هذه العملية بيورثوجونال على الخلايا الحية.

Abstract

إدراج الوراثية من الأحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) عن طريق قمع كودون وقف العنبر تقنية قوية لتثبيت المجسات مصطنعة ومويتيس رد الفعل على البروتينات مباشرة في الخلية الحية. هو إدماج كل نكا مكرسة متعامد القامع-الحمض الريبي النووي النقال/أمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز (AARS) زوج التي يتم استيرادها إلى الكائن الحي المضيف. يمكن تختلف كفاءة إدماج ncAAs مختلفة إلى حد كبير، وغير مرضية في بعض الحالات. ويمكن تحسين أزواج المتعامدة عن طريق التلاعب AARS أو الحمض الريبي النووي النقال. ومع ذلك، التطور الموجه للحمض الريبي النووي النقال أو AARS استخدام مكتبات كبيرة وأساليب الاختيار الميت/على قيد الحياة ليست ممكنة عمليا في خلايا الثدييات. ويرد هنا، سهلة وقوية تستند إلى الأسفار مقايسة لتقييم كفاءة أزواج متعامد في خلايا الثدييات. يسمح الفحص فحص عشرات ومئات متغيرات AARS/الحمض الريبي النووي النقال بجهد معتدل وضمن فترة زمنية معقولة. استخدام هذا التحليل لتوليد ترنس الجديدة التي تحسن كفاءة نظام متعامد بيروليسيني هو وصف، جنبا إلى جنب مع تطبيق ncAAs لدراسة البروتين ز إلى جانب المستقبلات (جبكرس)، التي تشكل تحديا الكائنات للرابطة الوطنية لرياضة الطفرات. أولاً، من خلال دمج بانتظام نكا صور--كروسلينكينج في جميع أنحاء سطح مستقبلات الخلية، يتم تعيين مواقع الربط من يغاندس مختلفة على مستقبلات سليمة مباشرة في الخلية الحية. الثانية، بتضمين ncAAs الجيل الأخير هذه العملية، فائق السرعة مجاناً محفز مستقبلات وسم بصبغة فلورسنت ويتجلى، الذي يستغل بيورثوجونال تروج لها سلالة معكوس "الدر ديلس" سيكلواديتيون (سبيداك) في الخلية الحية. كما يمكن تطبيق ncAAs عموما أي البروتين بشكل مستقل في حجمه، الأسلوب للمصلحة العامة لعدد من التطبيقات. وباﻹضافة إلى ذلك، إدراج نكا لا يتطلب أي معدات خاصة، ويتم بسهولة في مختبرات الكيمياء الحيوية القياسية.

Introduction

إدماج المجسات الكيميائية الوراثية في البروتينات وسيلة قوية لتسهيل التحقيق في الجوانب الهيكلية والديناميكية لوظيفة البروتين مباشرة في سياق الأصلية من الخلية الحية. في الوقت الحاضر، مئات أحماض الأمينية غير المقبول (ncAAs) مجهزة بمجموعات كيميائية الأكثر المتباينة يمكن سيتيسبيسيفيكالي إدراجها في البروتينات تخليق الحيوي1،2،،من34. بينهما، يجد المرء ncAAs المراعية للصور مثل الصور-كروسلينكيرس5و صور قفص6،7،،من89 والأحماض الأمينية-صور للتحويل10، 11، والأحماض الأمينية التي تحمل الالكينات المتوترة والكينس بيورثوجونال خالية من محفز الكيمياء2،،من1213،14،15،16 ،17والأحماض الأمينية التي تحمل دانسيل18و9،الكومارين19و21 برودان20،فلوروفوريس، ومجهزة بالمسابير الفيزيائية الحيوية الأخرى الأحماض الأمينية وكما هو الحال مع وظيفة التعديلات متعدية الجنسيات1،2،3،4،،من2223،24،25.

يتم تمكين الترميز الوراثي من نكا مخصصة أمينية-الأسيل-الحمض الريبي النووي النقال-سينثاتيز (AARS) إقران إلى المشابهة القامع-الحمض الريبي النووي النقال، الذي يتضمن نكا ردا على كودون وقف العنبر خلال التوليف ريبوسومال العادية. أزواج نكارس/الحمض الريبي النووي النقال صممت كي يكون متعامد في الكائن المضيف، أي لا عبر الحديث مع أزواج الذاتية. هذا الأسلوب راسخة في المضيفين بدائية وحقيقية النواة والخلايا تنطبق بسهولة على الثدييات. أزواج لإدماج نكا في خلايا الثدييات تستند إلى نظم متعامد الرئيسية الثلاثة: النظام تيروسيل، الذي يجمع بين تيرس من كولاي26 مع القامع العنبر تيروسيل من ستيروثيرموفيلوس باء-27 (Ec تيرس/زوج يامبتوقيت جنوب بريطانيا)، كولاي ليوسيل نظام (المفوضية الأوروبية/الحمض الريبي النووي النقاللويكوا زوج)6،،من1828 ونظام بيروليسيل أرتشايال (بيلرس/الحمض الريبي النووي النقال برونتوسوروس زوج)3، الذي بموجبه الحمض الريبي النووي النقالبرونتوسوروس القامع العنبر طبيعي. وبصفة عامة، كل نكا يعترف به نكارس متخصصة. اعتماداً على هيكل ncAA، يتم الحصول عليها في نكارس عن طريق التطور الموجه تيرس أو التي أو بيلرس، على الرغم من أن بعض سينثيتاسيس يمكن قبول أكثر من الرابطة الوطنية لرياضة.

يتم استيراد الزوج متعامد إلى الخلايا ببساطة استخدام ناقل بلازميد. والبلازميدات الأكثر شيوعاً وكفاءة بيسيسترونيك وترميز سواء بالنسبة سينثاتيز والحمض الريبي النووي النقال تشكيل زوج متعامد29. ترميز بلازميد الثاني لبروتين فوائد كودون العنبر في موقع مخصص للتعديل ترانسفيكتيد المشترك. نكا بساطة إضافة إلى متوسط نمو الخلية. ومع ذلك، غالباً ما تستخدم مختلف المجموعات المتخصصة أنواع مختلفة من بنيات بلازميد حتى بالنسبة لإدماج نكا نفس. بنيات تختلف في ترتيب الجينات في ناقلات، نوع من سينثاتيز كودون الاستخدام في الجينات سينثاتيز، استخدام المروج، والبديل للحمض الريبي النووي النقال وعدد الأشرطة التعبير الحمض الريبي النووي النقال. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تختلف فعالية إدماج ncAAs مختلفة جذريا بسبب كفاءة الحفاز مختلفة سينثيتاسيس مختلفة، ونوعية الحمض الريبي النووي النقال، و العوامل الأخرى30. ولذلك، من المهم أن يكون في متناول اليد طريقة سريعة وموثوق بها لتقييم كفاءة زوج متعامد، سواء في اختيار النظام الأكثر ملاءمة لتطبيق المطلوب والقيام ببعض خطوات التحسين التي تحسن عموما البروتين التعبير غلة.

وقد أنشأنا بسيطة وقوية تستند إلى الأسفار مقايسة لتقييم كفاءة أزواج متعامد29 (الشكل 1). في التحليل، خلايا transfected اشتركت مع بلازميد الترميز لزوج متعامد، جنبا إلى جنب مع بلازميد مراسل بيسيسترونيك ترميز سواء بالنسبة للبروتينات الفلورية الخضراء واضعة كودون وقف العنبر في موقف متساهلة (اجفبالعلامة) مشري الجينات. تتم قراءة الأسفار الحمراء والخضراء لكامل الخلية ليساتيس في قنوات منفصلة عن قارئ لوحة في لوحة 96-جيدا. كثافة الفلورية الخضراء مباشرة يرتبط بالكفاءة لقمع العنبر، حين يعطي كثافة ومضان أحمر تقدير حجم العينة المقاسة وكفاءة تعداء مباشرة. فيما يتعلق بفحوصات مماثلة تستند إلى الأسفار تلا مساعدة الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)32من31،، المقايسة يعطي تقييما فوريا وشاملاً للتعبير البروتين في السكان خلية كله، الذي أكثر تمثيلية من الظروف التجريبية المعتادة، ويقدم أكثر سهولة الحصول على البيانات وتجهيز مع البرامج القياسية. عموما، الميزة الرئيسية للفحص أنه وسيلة لعدد كبير من العينات يمكن تحليلها بالتوازي. استخدام هذا الفحص، ونحن قد فحص مكتبة مصممة بطريقة رشيدة من ترنس القامع لتحسين كفاءة نظام متعامد برونتوسوروس30. ويصف هذا العمل البروتوكول التجريبي القيام بهذا التحليل وإظهار أمثلة على تطبيقه، بما في ذلك الاستفادة المثلى زوج متعامد لإدراج الصور-كروسلينكينج نكا فأزيدو-L-فينيلالاناين (العازي) ومقارنة إدماج الكفاءات من الأحماض الأمينية مختلفة (الشكل 2).

على مدى السنوات الماضية، ثبت نكا أدوات قوية جداً للتحقيق في الهيكلية والجوانب الفنية للبروتين ز إلى جانب المستقبلات (جبكرس)33،34،35،،من3637 , 38-في البشر، وتكوين أسرة كبيرة من الغشاء مستقبلات (800 عضو) جبكرس وتمثل الأهداف الرئيسية للعقاقير العلاجية. الوصف الهيكلي مباشرة من جبكرس لا تزال صعبة وأساليب البيوكيميائية التكميلية العالية اللازمة للتحقيق فيها. نحن رائدة استخدام ncAAs كروسلينكينج صور لخريطة GPCR السطوح واكتشاف يجند ملزمة جيوب34. استخدام نظامنا الأمثل لإدماج عُزي، ادخلنا بانتظام عُزي عبر المجال جوكستاميمبراني كله من هذه العملية مباشرة في خلايا الثدييات الحية. عند إشعاع الأشعة فوق البنفسجية، عُزي أشكال أنواع نيتريني شدة رد الفعل الذي يلتقط الجزيئات المجاورة تساهمي. عندما تتم إضافة يجند للنظام، عُزي بمثابة تحقيق قرب تكشف فيها مواقف المستقبلات تقترب من يجند منضم. وبهذه الطريقة، وضع الربط من هرمون نيوروبيبتيدي أوروكورتين (Ucn1) على مستقبلات فئة GPCR ب كورتيكوتروبين-تحرير-عامل الكتابة 1 (CRF1R)33 كان أول كشف النقاب عنها. في الآونة الأخيرة، ونحن كشفت عن أنماط ملزمة مميزة ليضع والخصوم على مستقبلات نفس38. طبق نهج مماثل قبل الآخرين للكشف عن أورثوستيريك ومواقع ربط اللوستيريك الأخرى الببتيدات والجزيئات الصغيرة يغاندس على الأخرى جبكرس39،40،،من4142. ويصف هذه المخطوطة البروتوكول التجريبي المطبق في لدينا مختبر لرسم خرائط الصور-كروسلينكينج للسطوح GPCR. الطريقة سريعة نسبيا، واضحة ولا يتطلب أي معدات خاصة، حيث أنها تنطبق في مختبرات الكيمياء الحيوية القياسية. الأهم من ذلك، يوفر هذا النهج أداة قيمة ليس فقط لتحديد مواقع الربط يجند فيها البيانات الهيكلية 3D نادرة، ولكن أيضا تكملة الموجودة في المختبر البيانات مع معلومات من مستقبلات معدلة تماما بوستترانسلاتيونالي في البيئة الفسيولوجية للخلية الحية.

التطورات الأخيرة في رواية ncAAs تتعلق الجانب سلسلة مجموعات كيميائية مناسبة للكيمياء بيورثوجونال خالية من محفز فائق السرعة قد فتحت إمكانية تثبيت fluorophores الجيل الأخير لتصوير فائقة القرار إلى البروتينات مباشرة على يعيش الخلايا2،43. وتشمل هذه المراسي الكيميائية سيكلوكتيني المتوترة في سكوك14، نونيني بيسيكلو [6.1.0] في12،بكنك17، وعبر-سيكلوكتينيس في تكلفة الامتلاك الكلية * ك13،،من1517 من بين ncAAs أخرى إيواء نوربورنيني16،17،44 أو سيكلوبروبيني45،46 moiety. NcAAs ضخمة للكيمياء بيورثوجونال مدرجة بالبديل من بيلرس وعادة ما تتم الإشارة إليها بيلرسAF (يشير إلى الطفرة Y271A و Y349F في بيلرس م. باركيري )، فضلا عن الأخرى المخصصة تطورت نكارس17 , 44-المراسي بيورثوجونال تتفاعل مع تيترازيني الكواشف47 عبر سيكلواديتيون ديلز-الدر معكوس إلكترون-الطلب إعطاء غلات التوسيم عالية ضمن بضع دقائق43،48. بيد قد تم الطعن في تطبيق هذا النهج قوية إلى التسمية جبكرس سبب منخفضة كفاءة الكلية للنظام نكا متعامد على إدراج. استخدام نظامنا برونتوسوروس المعززة، أظهرنا مؤخرا إدماج عالية الغلة من هذه الأحماض الأمينية في جبكرس وفائق السرعة هذه العملية وضع العلامات على سطح خلايا الثدييات يعيش30. مستقبلات المسمى كانت لا تزال وظيفية، كما أنها تستوعب الفيزيولوجية عند تنشيط المستقبلات مع مؤثر. المراسي البروتوكول التجريبي لإدراج بيورثوجونال في جبكرس والخطوات وضع العلامات التالية التي تم وصفها هنا. تجهيز جبكرس مع فلوروفوريس مشرق الصغيرة هو الخطوة الأساسية الأولى باتجاه دراسة ديناميات GPCR الهيكلية في الخلية الحية عبر تقنيات متقدمة في الفحص المجهري.

Protocol

1-الأسفار على أساس الفرز لإدماج الكفاءات (الشكل 1)

  1. الحفاظ على خلايا HEK293 في المتوسط "تعديل النسر" دولبيكو (دميم؛ الجلوكوز عالية، 4 مم الجلوتامين، بيروفات) وتستكمل مع 10% (v/v) المصل البقري الجنين (FBS) والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO2.
  2. البذور في اليوم السابق تعداء الخلايا.
    1. فصل الخلايا لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في 0.05% التربسين/برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 0.5 مم يدتا. استخدم 1 مل التربسين/يدتا لطبق 10 سم. آرو مع 10 مجلدات متوسطة كاملة وريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج. حساب عدد الخلايا في تعليق استخدام هيموسيتوميتير49.
    2. بذور 6.0 × 105 HEK293 الخلايا الواحدة وكذلك لوحات 6-جيدا في 2 مل كاملة النمو المتوسطة. إعداد العديد من الآبار كعدد العينات، وبئرين إضافية اجفب البرية من نوع وعينه transfected وهمية، على التوالي.
  3. التحكم الملتقى (المنطقة التي تحتلها الخلايا) تحت مجهر. ترانسفيكت الخلايا عند التقاء ~ 70% استخدام كاشف بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد).
    1. ح 1 قبل تعداء، إضافة مبلغ الطازجة نكا الأسهم الحل المناسب لجميع الآبار لتركيز نكا نهائي من 0.25-0.5 ملم. إضافة الرابطة الوطنية لرياضة لجميع الآبار، بما في ذلك مراقبة البرية من نوع الإيجابية والخلايا transfected وهمية، لمنع الخلافات في إشارات الأسفار التي قد تنجم عن آثار ncAA على النمو الخلوي.
      ملاحظة: لإعداد حلول الأسهم، حل نكا إلى 0.1-0.5 م باستخدام 0.2-0.5 M هيدروكسيد الصوديوم. ومع ذلك، قد تتطلب بعض ncAAs solubilization الأولية في [دمس] و/أو تحييد من أربعة مجلدات 1 م حبيس (درجة الحموضة 7.4) قبل استخدام. وبشكل عام، توصي بها الشركة المصنعة وضع بروتوكول لإعداد حل أسهم.
    2. في أنبوب ميكروسينتريفوجي، خلط 1 ميكروغرام لترميز بلازميد الحمض النووي لزوج نكارس/الحمض الريبي النووي النقال لفحصها مع 1 ميكروغرام لمراسل بلازميد الحمض النووي (pcDNA3.0-اجفب183TAG-مشري). في أنابيب منفصلة، إعداد تعداء متطابقة استخدام مرجع البرية من نوع اجفب ومن تعداء وهمية.
      ملاحظة: عدد نسخ الكاسيت الحمض الريبي النووي النقال جزءا لا يتجزأ من بلازميد الترميز لزوج نكارس/الحمض الريبي النووي النقال يعتمد على التطبيق. تيسيرا للاستنساخ، 1 الحمض الريبي النووي النقال نسخة ينصح عند فحص ترناس مختلفة، بينما يوصي 4 نسخ (ولو لم يكن ضروريا) عند اختبار نكارس مختلفة أو إدراج ncAAs مختلفة بنفس زوج متعامد.
    3. لكل أنبوبة تحتوي على الحمض النووي إضافة 100 ميليلتر لاكتات مخزنة المالحة (رطل) الذي يحتوي على 20 مم لاكتات الصوديوم في pH 4.0 و 150 مم كلوريد الصوديوم. ميكس بإيجاز.
    4. لكل أنبوبة تحتوي على الحمض النووي في رطل إضافة 6 ميليلتر من 1 ميكروغرام/ميليلتر بي في رطل (نسبة بي/الحمض النووي = 3/1 ث/ث) ودوامه فورا. تبني على RT لمدة 10-15 دقيقة.
    5. تأخذ 400 ميليلتر الخلية المتوسطة من كل بئر وإضافته إلى خليط الحمض النووي-برينس لتحييد درجة الحموضة. لعاب خليط الحمض النووي إلى الخلايا.
      ملاحظة: عادة ما يتضمن دميم الفينول الأحمر كمؤشر الرقم الهيدروجيني. أثناء الخطوة تحييد سيغير لون الخليط أضيف في الأنبوب من الأصفر (الحمضية) إلى اللون الأحمر (المحايدة). على الرغم من أن تشكيل المجمعات الحمض النووي في رطل في الأس الهيدروجيني الحمضية يعطي غلة تعداء أعلى50، يمكن بدلاً من ذلك تشكيل مجمعات الحمض النووي-بي مباشرة على درجة الحموضة 7.4 (على سبيل المثال في دميم خالية من المصل). في حالة استخدام دميم لنموذج المجمعات الحمض النووي، تخطي الخطوة تحييد 1.3.5. على أي حال، من الضروري أن لا المصل موجود في الخليط عند تشكيل المجمعات.
  4. حصاد الخلايا تعداء بعد 48 ساعة.
    1. نضح المتوسطة وشطف الخلايا مرة واحدة مع 2 مل برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية). إضافة 800 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 0.5 مم يدتا واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. فصل وتعليق الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    2. نقل تعليق خلية في أنابيب 1.5 مل تحتوي على 200 ميليلتر PBS تستكمل مع 5 مم مجكل2.
    3. الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 x ز وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. وفي هذه الحالة، فلاش-تجميد الكريات في سائل ن2 وتخزينها في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. دائماً ارتداء نظارات حماية العين.
  5. إضافة 100 ميليلتر تريس تحلل العازلة (50 مم تريس-HCl pH 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1% X-100 تريتون، يدتا 1 مم وبمسف المضافة حديثا) إلى الخلية الكريات واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. لتسهيل تحلل، دوامة كل 5 دقائق.
  6. تدور أسفل الحطام خلية لمدة 10 دقيقة على 4 درجة مئوية و 14,000 س ز ونقل ميليلتر 90 من المادة طافية في أسود 96-جيدا لوحات. قياس اجفب ومشري fluorescence استخدام قارئ لوحة مزودة بوحدة نمطية الأسفار.
    ملاحظة: استخدام عوامل الإثارة والانبعاثات المناسبة اجفب (λإس: 488 نانومتر؛ λم: 509 نانومتر) ومتشيري (λإس: 588 نانومتر؛ λم: 611 nm). وسوف تمتد يقاس اجفب قيم مجموعة بين الحد الأدنى للقيمة التي تم الحصول عليها من خلايا ترانسفيكتيد وهمية وقيمة قصوى، التي يتم الحصول عليها عادة من اجفب البرية من نوع. رعاية إنشاء نافذة القياس الصحيح في الصك.
  7. يتم حساب كفاءة نكا التأسيس كالنسبة بين الأسفار العينة والأسفار التي تم الحصول عليها من التعبير عن اجفب البرية من نوع. يتم تطبيع كافة القيم إلى الأسفار متشيري.
    figure-protocol-5111

2-الوراثية إدماج ncAAs في جبكرس كروسلينكينج صور رسم الخرائط ليجند GPCR التفاعلات (الشكل 3)

  1. الحفاظ على خلايا HEK293T في دميم وتستكمل مع 10% (v/v) FBS، 100 يو/مليلتر البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO2.
  2. الخلايا في اليوم السابق تعداء من البذور.
    1. فصل الخلايا لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في 0.05% التربسين/برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 0.5 مم يدتا. استخدم 1 مل التربسين/يدتا لطبق 10 سم. آرو مع 10 مجلدات متوسطة كاملة وريسوسبيند الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. حساب عدد الخلايا في تعليق استخدام هيموسيتوميتير49.
    2. بذور 5.0 × 105 293T الخلايا كل بئر في 2 مل كاملة النمو المتوسطة في لوحات 6-جيدا. لكل موقف فحص، إعداد 1 جيدا كل يجند بالإضافة إلى بئر واحدة33،عنصر تحكم الربط38. قد يدرج بئر إضافي يكون transfected مع مستقبلات البرية من نوع (wt) للتحقق من مستوى التعبير المسخ.
  3. اليوم، وبعد السيطرة على التقاء (المنطقة التي تحتلها الخلايا) تحت مجهر. ترانسفيكت الخلايا عند التقاء ~ 70% استخدام بي.
    1. إضافة ح 1 قبل تعداء، عُزي إلى جميع الآبار بتركيز نهائي من 0.5 مم.
      1. إعداد حل أسهم 0.5 M عُزي. كل لوحة 6-جيدا، وتزن 1.2 ملغ عُزي في أنبوب وحله في 15 ميليلتر 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم. تمييع الحل الأسهم في المتوسط 1.2 مل كاملة وإضافة 200 ميليلتر من الخليط لكل بئر.
        ملاحظة: تعد حلاً أسهم طازجة من عُزي لكل تجربة. مجموعة أزيد نصف عمر قصيرة في المحاليل، لا سيما على درجة الحموضة الأساسية، ويشتمل أزيرس حالها، بل أيضا شكل المتدهورة.
    2. مبلغ إجمالي قدرة 2 ميكروغرام الحمض النووي كل بئر ترانسفيكت: 1 ميكروغرام من بلازميد الترميز لهذه العملية معلم العلم آخذة كودون علامة في الموضع المطلوب و 1 ميكروغرام من بلازميد الترميز لزوج متعامد مكرسة عُزي (E2AziRS51 و 4 نسخ قرابة يام بتوقيت جنوب بريطانياالقامع-الحمض الريبي النووي النقال)33،38.
      ملاحظة: عندما بما في ذلك مقارنة wt للتحقق من مستويات التعبير، ترانسفيكت كمية أقل من بلازميد الحمض النووي لمستقبلات wt. اعتماداً على هذه العملية، 0.2-0.5 مكغ بلازميد ترميز wt مستقبلات مستويات الغلة مماثلة ك 1.0 ميكروغرام من بلازميد المسخ. ترانسفيكت نفس الكمية من الحمض النووي في جميع الآبار، يملأ الحمض النووي المفقودين مع وهمية (على سبيل المثال موجه فارغ).
    3. المضي قدما كما هو موضح في 1.3.3-1.3.5.
    4. المضي قدما أما مع الخطوة 2.4 لصور--كروسلينكينج يغاندس تعداء بعد 48 ساعة، أو انتقل إلى الخطوة 2، 5 للحصاد المباشر والتحليل للتحقق من مستقبلات التعبير.
  4. صور--كروسلينكينج ليجند.
    1. إعداد حل أسهم يجند 1,000 x. حل يجند الببتيد بتركيز 100 ميكرومتر في [دمس].
      ملاحظة: يعتمد تركيز يجند على ثابت التفكك كد التفاعل GPCR يجند. تركيز نهائي العاشر 100 كد المفضل. إذا كان يجند الببتيد ملح حمض تريفلورواسيتيك (تفا)، تنظر في وزن تفا عند حساب الوزن الجزيئي (1 x TFA كل الأحماض الأمينية الأساسية في الببتيد). أيضا، نرى أن الببتيدات في العام بلوري. تجنب تكرار تجميد مسحوق الببتيد وفتح حاوية ببتيد ابدأ حتى أنه لم يبلغ درجة حرارة الغرفة.
    2. تمييع 1:1,000 حل الأسهم يجند في المخزن المؤقت ملزم يتألف من 0.1% جيش صرب البوسنة، 0.01 ٪ تريتون العاشر 100، 5 مم مجكل2 في المخزن المؤقت للانفصال حبيس (المحاسب) التي تحتوي على حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك 12.5 ملم 4 (حبيس)-HCl الأس الهيدروجيني 7.4، 140 ملم كلوريد الصوديوم و 5 ملم بوكل. تحضير 1 مل كل عُزي GPCR المسخ. استبدال المتوسطة الخلية مع 1 مل من يجند الحل. احتضان لمدة 10 دقائق في الرايت
      ملاحظة: ضبط وقت الحضانة إلى GPCR محددة، المحاسبة لاستيعاب حركية ومستقبلات يجند. إطالة فترة حضانة لا تحسين غلة crosslinking.
    3. تشعيع العينات لمدة 20 دقيقة في كروسلينكير الأشعة فوق البنفسجية في 365 نانومتر مع 5 × 8 ث أنابيب و ~ مسافة 5 سم للخلايا. فصل الخلايا من بيبيتينج وتحويلها إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل. بيليه الخلايا لمدة 3 دقائق في 800 x ز وتجاهل المادة طافية.
    4. حل قرص مثبطات البروتياز (PI) كوكتيل في 1 مل 25 مم يدتا/ح2س جعل حل أسهم 50 x. الكوة بي الأسهم الحل وتخزينها في-20 درجة مئوية. تمييع الأسهم 50 x 01:25 في المحاسب وريسوسبيند الكريات الخلية في 50 ميليلتر من 2 × PI في المحاسب. فلاش-تجميد الخلايا في السائل ن2.
      ملاحظة: ارتداء نظارات حماية العين. عند هذه النقطة، يمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. تابع مع الخطوة 2.6.
  5. الحصاد الخلية مباشرة.
    1. نضح المتوسطة. إضافة 800 ميليلتر من 0.5 مم يدتا في المحاسب. احتضان لمدة 10 دقيقة في الرايت أو على الجليد.
    2. فصل الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وتحويلها إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل. إضافة 200 ميليلتر من 5 مم مجكل2 في المحاسب. بيليه الخلايا لمدة 3 دقائق في 800 x ز وتجاهل المادة طافية.
    3. ريسوسبيند الكريات الخلية في 50 ميليلتر من 2 × PI في المحاسب وتجميد فلاش في سائل ن2. ارتداء نظارات حماية العين.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  6. تحلل الخلية.
    1. ذوبان الجليد الخلايا في حمام مائي عند 37 درجة مئوية 30-45 ثانية ودوامه بإيجاز. الاحتفاظ بعينات الباردة من الآن فصاعدا. بيليه الأغشية في 2,500 س ز و 4 درجة مئوية للحد الأدنى 10 تجاهل المادة طافية، الذي يحتوي على الجزء الأكبر البروتينات سيتوسوليك.
    2. ريسوسبيند الكريات في 50 ميليلتر حبيس تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 مم HCl حبيس الرقم الهيدروجيني 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10 ٪، 1 ٪ X-100 تريتون، 1.5 مم مجكل2، 1 مم عطا، 1 مم DTT وأضاف طازجة 2 × كوكتيل PI. مزيج دقيق. الخلايا و 30 دقيقة على الجليد ودوامه كل 5 دقائق.
    3. تدور أسفل الحطام خلية ل 10 دقيقة في 14,000 س ز و 4 درجة مئوية. نقل المادة طافية على الفور إلى أنبوب رد فعل جديدة.
      ملاحظة: المضي قدما في التحليل الحق بعيداً. يمكن تخزينها في ليساتيس في-20 درجة مئوية، ولكن كل دورة تجميد أذاب يضعف نوعية النتائج.
  7. تحليل لطخة غربية.
    1. إعداد العينة وتأخذ 3-5 ميليلتر ليستي وملئه يصل إلى 7 ميليلتر مع ح22 إضافة سين ميليلتر م 1 DTT وميليلتر 3 4 x عينة المخزن المؤقت الذي يحتوي على 2% الحزب الديمقراطي الصربي، والغليسيرول 10% وبرومفينول 0.04% مم 63 تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8، الزرقاء. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. عندما يكون هذه العملية الغليكوزيلاتي وعصابات باهتة أو بقع مشكلة، عينات ديجليكوسيلاتي مع بنغازي و زيادة كثافة الإشارات وشحذ العصابات. استخدام 3-5 ميليلتر ليستي وديجليكوسيلاتي في إجمالي حجم 10 ميليلتر يتبع البروتوكول المورد. إضافة ميليلتر 3 4 x عينة المخزن المؤقت.
      ملاحظة: غالباً ما تكون بروتينات الغشاء الغليكوزيلاتي في العديد من المواقع والدول، مما يضعف نوعية القرار في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحليل. ومع ذلك، لا ديجليكوسيلاتي لا العينات لتحليل مستوى التعبير من طفرات عُزي-هذه العملية باستخدام الأجسام المضادة العلم لأنها ذات صلة بتقييم جزء الغليكوزيلاتي تماما، ناضجة مستقبلات على سطح الخلية.
    3. حل عينات عن طريق صفحة صحيفة بيانات السلامة القياسية ولطخة نقل البروتينات إلى غشاء PVDF.
      تنبيه: اكريلاميد الأعصاب. ارتداء القفازات وحماية العين.
    4. كتلة الغشاء ح 1 في الرايت أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الحليب المقشود 5% في تي تبس تحتوي على 20 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.4، 0.15 م كلوريد الصوديوم و 0.1% 20 توين.
    5. التحقيق الغشاء مع جسم المضادة يجند متبوعاً بالجسم المضاد الثانوي مترافق برنامج الصحة الإنجابية. أغسل بينهما مع TBS-ت. للكشف عن مستوى التعبير عُزي-هذه العملية، التحقيق في الغشاء مع جسم HRP تجارية (انظر الجدول للمواد).
    6. القيام برد فعل تشيميلومينيسسينسي المحسنة (القامة) باستخدام كاشف مسافنة محلية الصنع وكشف الإشارات لمدة 5 دقائق في الظلام.

3-فائق السرعة بيورثوجونال وسم من جبكرس في خلايا الثدييات الحية

ملاحظة: البروتوكول هو الأمثل للبئر 4 غرف كوفيرسليبس (المنطقة جيدا = 2.2 سم2). لأحجام مختلفة تماما، يجب تحجيم البروتوكول تبعاً لذلك.

  1. طلاء السطح من شرائح المجهر. القيام بالإجراء برمته تحت غطاء عقيمة.
    1. إعداد هيدروبروميد بولي-د-يسين (MW = 500-550 كاتشين) حل الأسهم (PDL) بتركيز 1 ملغ/مل في المخزن المؤقت بورات 50 مم (8.5 درجة الحموضة). تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. لا تجمده.
    2. تمييع PDL حل الأسهم 01:40 في المياه النقية فائقة العقيمة لتركيز 25 ميكروغرام/مل (العامل الحل) نهائي، ثم تصفية الحل من خلال عامل تصفية عقيمة 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: ويمكن تخزين الحل العامل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
    3. تغطي تماما أسفل كل من شريحة مجهرية جيدا مع 500 ميليلتر لحل عملي PDL. احتضان لمدة 20 دقيقة في الرايت ونضح الحل العامل PDL.
      ملاحظة: ويمكن استخدام الحل العامل PDL يصل إلى ثلاث مرات. إذا كان الحل يحتاج إلى إعادة استخدامها، نقل الحل المستخدمة من الشرائح المغلفة بأنبوب عقيمة جديدة وتسمية الأنبوب تبعاً لذلك. ابدأ مزيج الحل المعاد تدويرها مع حل جديد.
    4. أشطف كل س 3 جيدا مع ~ 700 ميليلتر مياه نقية فائقة العقيمة واسمحوا جافة على الأقل 1 ح.
      ملاحظة: من المهم جداً شطف الآبار بدقة، كما بقايا الحل PDL السامة للخلايا. يمكن استخدامها على الفور للفحص المجهري الشرائح المغلفة أو تخزينها لفترة تصل إلى أسبوع واحد في 4 درجات مئوية.
  2. الحفاظ على خلايا HEK293T في دميم وتستكمل مع 10% (v/v) FBS، 100 يو/مليلتر البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين في 37 درجة مئوية ورطوبة 95% ونسبة 5% CO2.
  3. الخلايا في اليوم السابق تعداء من البذور.
    1. فصل الخلايا لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في 0.05% التربسين/برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 0.5 مم يدتا. استخدم 1 مل التربسين/يدتا لطبق 10 سم. آرو مع 10 مجلدات متوسطة كاملة وريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج. حساب عدد الخلايا في تعليق استخدام هيموسيتوميتير49.
    2. بذور 1.0 × 105 HEK293T الخلايا في البئر (منطقة cm ² 2.2) في 600 ميليلتر مجاناً صبغ دميم كاملة.
      ملاحظة: لأغراض التصوير، وأنها مريحة جداً للعمل منذ البداية في متوسط الذي لا يحتوي على أي صبغة. صبغة مجاناً دميم تركيبات متاحة تجارياً.
  4. التحكم الملتقى (المنطقة التي تحتلها الخلايا) تحت مجهر وترانسفيكت الخلايا في التقاء ~ 70% استخدام كاشف تعداء على أساس المادة الدهنية.
    1. ح 1 قبل تعداء، تعد حلاً أسهم طازجة 100 مم من تكلفة الامتلاك الكلية * K في 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم و [دمس] 15% (v/v).
    2. كل جيدا، تخلط 3 ميليلتر من تكلفة الامتلاك الكلية * ك حل الأسهم مع 12 ميليلتر من 1 م حبيس الأس الهيدروجيني 7.4. بلطف إضافة الحل إلى الآبار لتكلفة الامتلاك الكلية نهائية * K تركيز 0.5 مم.
    3. إعداد مبلغ إجمالي قدرة 500 نانوغرام دنا كل بئر. في أنبوب ميكروسينتريفوجي، يؤدي إلى تمييع 200 نانوغرام pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-اجفب، 200 نانوغرام بلازميد ترميز/tRNAAFبيلرس ميغابايتبرونتوسوروس زوج متعامد (أربعة أشرطة للحمض الريبي النووي النقالM15) و 100 نانوغرام pcDNA3.1_Arrestin3 بلازميد في 50 ميليلتر المتوسطة (صبغ مجانية، وخالية من المصل، والمضادات الحيوية الحرة).
      ملاحظة: وبصفة عامة، تعداء المشارك من أريستين ليس من الضروري مراعاة استيعاب هذه العملية. بيد يسرع Arrestin3 المشترك ترانسفيكتينج تدخيل CRF1R، ومريحة للغاية عند تحليل تدخيل طفرات عديدة.
    4. تمييع ميليلتر 1.25 من الكاشف تعداء على أساس المادة الدهنية (2.5 ميليلتر الواحدة 1 ميكروغرام من الحمض النووي) في 50 ميليلتر المتوسطة (صبغ مجانية، وخالية من المصل، والمضادات الحيوية الحرة) وإضافة الحل إلى خليط الحمض النووي. دوامة فورا واحتضان 5-10 دقيقة في مجمعات الرايت إضافة الحمض النووي-الدهن في الخلايا.
      ملاحظة: في تجربتنا، transfected مورفولوجيا الخلايا باستخدام تعداء على أساس المادة الدهنية تبدو الفسيولوجية أكثر بالمقارنة مع الخلايا transfected مع بي. برينس تعطي درجة أعلى من الكفاءة تعداء، ينبغي أن يكون بي يفضل للمتلقين للمعلومات من التطبيقات مثل لطخة غربية، بينما تعداء على أساس المادة الدهنية خيار أفضل ترانسفيكت الخلايا لتصوير التجارب.
  5. ح 24 تعداء بعد، تسمية المستقبلات مع الأصباغ الفلورية.
    1. إعداد حل أسهم صبغ تيترازيني 0.5 مم في [دمس] و 10 ملغ/مل من الحمض النووي تلطيخ صبغ حل الأسهم في نقية فائقة H2o.
    2. نقل 100 ميليلتر المتوسطة من كل بئر في أنبوب 1.5 مل رد فعل. إضافة ميليلتر 1.8 الحل صبغ تيترازيني الأسهم وميليلتر 0.3 من الحمض النووي تلطيخ صبغ الأسهم الحل. نقل المتوسطة التي تحتوي على صبغات مرة أخرى إلى البئر واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: وقد صبغ تيترازيني-أورانج-فلوري بتركيز نهائي من 1.5 ميكرومتر.
    3. نضح المتوسطة وشطف الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني لإزالة الزائدة من صبغة بلطف. إضافة 600 ميليلتر الكامل صبغ يسخن المتوسطة النمو الحر إلى 37 درجة مئوية.
  6. استيعاب الفحص المجهري ومستقبلات الأسفار.
    1. تصور مستقبلات المسمى تحت 63 x (أو ما شابه) التكبير باستخدام عوامل التصفية المناسبة للتجارة والنقل (λإس: 488 نانومتر؛ λم: 509 نانومتر)، صبغة اللون البرتقالي الفلورسنت (λإس: 550 نانومتر؛ λم: 570 نانومتر) والحمض النووي تلطيخ صبغ (λ إس: 350 نانومتر؛ Λم: 461 nm). التقاط صورة مع كل مرشح قبل تفعيل المستقبلات.
    2. تعزيز استيعاب مستقبلات استخدام 200 نيوتن متر Ucn1.
      1. إعداد حل أسهم 1,000 x Ucn1 من 200 ميكرومتر في [دمس].
        ملاحظة: تبعاً لقابلية ذوبان الببتيد، قد تتمكن من إعداد المخزون في المياه النقية أو المخزن المؤقت.
      2. نقل 100 ميليلتر المتوسطة من بئر في أنبوب رد فعل 1.5 مل وإضافة 0.6 ميليلتر من الحل الأسهم مؤثر الببتيد. نقل الخلف متوسطة في البئر.
      3. مراقبة الاستيعاب الداخلي تحت المجهر. التقاط الصور بعد وقوع الكشف الواضح لاستيعاب (10-15 دقيقة إلى ساعة، اعتماداً على مستقبلات و overexpression من أريستينس) باستخدام عوامل التصفية المذكورة سابقا.

النتائج

الخطوط العريضة للمقايسة الأسفار هو مبين في الشكل 1. الإنزيم يعمل في ثلاثة طلبات. في المقام الأول، يتم فحص عدد من المتغيرات الحمض الريبي النووي النقال لإدماج Lys(Boc) بزوج متعامد برونتوسوروس. Lys(Boc) هو من الأحماض الأمينية ستيريكالي مماثلة إلى برونتوسوروس. برونت...

Discussion

ويصف البروتوكول مقايسة بسيطة وموثوق بها تقييم الكفاءة لأزواج متعامد لإدماج ncAAs في البروتينات التي أعرب عنها في خلايا الثدييات. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب فيما يتعلق بالاختبارات المستخدمة على نطاق واسع يستند إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية هو أنه يسمح بإعداد المتزامنة وقياس لعدد أكب...

Disclosures

الكتاب على لا تعارضات أن تعلن.

Acknowledgements

تم تأسيس هذا العمل قبل الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) ضمن المنح CO822/2-1 (برنامج إيمي نويثر) و CO822/3-1 إلى جيم

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)Carl Roth3029.1
Ammonium persulfate (APS)Carl Roth9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi)BachemF-3075.0001
Boric acidSigma AldrichB6768
BromphenolblueSigma-AldrichB0126-25G
Bovine serum albumine (BSA)Carl Roth8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))NovaBiochem8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)SichemSC-8000
DMEMLife Technologies41966052
DMSOCarl RothA994.2
DTTCarl Roth6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL) home-made10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTACarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)SichemSC-8014
FBSThermo Fisher (Gibco)10270106
FluoroBrite DMEMThermo Fisher (Gibco)A1896701
GlycerolCarl Roth7533.1
GlycinCarl Roth3908.3
HEPESCarl Roth9105.3
Hoechst 33342Sigma AldrichB2261
KClCarl Roth6781.3
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher11668019
LuminolApplichemA2185,0005
MethanolCarl Roth0082.3
MgCl2Carl Roth2189.2
NaClCarl RothHN00.2
Na-LactateSigma-Aldrich71718-10G
NaOHGrüssing121551000
PBSSigma-AldrichP5493-1L
p-Coumaric acidSigma-AldrichC9008-1G
poly-D-lysine hydrobromideCorning354210
PEIPolysciences23966
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher (Gibco)11548876 (15140-122)
PMSFCarl Roth6367.1
PNGase FNEBP0704L
Protease InhibitorRoche11873580001
PVDF membrane Immobilon-PMilliporeIPVH00010
Skim Milk Powder Sigma70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Carl RothCN30.2
Tetrazine-Cy3Jena BioscienceCLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Carl Roth2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)SichemSC-8008
TRISSigma-AldrichT1503
Triton X-100Carl Roth3051.4
Trypsin 2.5%Thermo Fisher (Gibco)15090046
Tween 20Carl Roth9127.2
Wasserstoffperoxid (30%)Merck1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-305
HEK293T cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nmBio-Budget Technologies GmbH40-BLX-E3655 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRSThe huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmidsPlasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAGSynthesized by Genart (Life Technologies)Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate Sigma-AldrichA8592 monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibodySanta Cruzsc-2004
Rabbit-anti-CRF antibodyhome-madePBL #rC69polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibodyhome-madePBL #5779polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

134 crosslinking

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved