JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذا البروتوكول يركز على التحليل الكمي لتعقيد أربوريزيشن الجذعية العصبية (نداك) في المورفولوجية، التي يمكن استخدامها لإجراء دراسات ل morphogenesis الجذعية.

Abstract

Dendrites الإسقاطات متفرع من خلية ومورفولوجيا الجذعية يعكس المنظمة متشابك أثناء تطوير النظام العصبي. المورفولوجية اليرقات أربوريزيشن الجذعية العصبية (دا) نموذج مثالي لدراسة morphogenesis dendrites العصبية ووظيفة الجينات في تطوير الجهاز العصبي. وهناك أربع فئات من الخلايا العصبية دا. الفئة الرابعة هي الأكثر تعقيداً مع نمط المتفرعة التي تغطي المنطقة بأكملها تقريبا من الجدار الجسم اليرقات. نحن تميزت سابقا أثر إسكات أورثولوج المورفولوجية ل SOX5 على الدرجة الرابعة أربوريزيشن الجذعية العصبية التعقيد (نداك) باستخدام المعلمات الأربعة: طول dendrites، والمساحة السطحية لتغطية تغصن، إجمالي عدد الفروع، وهيكل التفريع. ويقدم هذا البروتوكول سير العمل من نداك التحليل الكمي، تتألف من تشريح اليرقات والفحص المجهري [كنفوكل]، وإجراءات تحليل الصورة باستخدام البرمجيات إيماجيج. سيتم تحسين الفهم لوظيفة الخلايا العصبية مزيد من التبصر في دا العصبية التنمية وآلياتها الأساسية وتقديم أدلة حول الأسباب الأساسية للجهاز العصبي والاضطرابات النمائية.

Introduction

Dendrites، وهي إسقاطات متفرع من خلية، تغطي الحقل الذي يشمل مدخلات العصبية الحسية ومتشابك من1،الخلايا العصبية الأخرى2. تعد مكوناً هاما لتشكيل المشبك dendrites وتلعب دوراً حاسما في إدماج المدخلات متشابك، فضلا عن الترويج لتحفيز الكهروكيميائية في خلية. أربوريزيشن الجذعية (دا) هي عملية التي تشكل الخلايا العصبية الأشجار الجذعية جديدة وفروع لإنشاء نهايات جديدة. التنمية ومورفولوجيا دا، مثل أنماط التجميع، وكثافة فرع نتيجة الخطوة متعددة العمليات البيولوجية وهي ارتباطاً وثيقا بالوظيفة العصبية. والهدف من هذا البروتوكول توفير وسيلة للتحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون ديندريتريك الخلايا العصبية في المورفولوجية.

تعقد dendrites يحدد أنواع متشابك والاتصال، ومدخلات من الخلايا العصبية شريك. أنماط التفريع وكثافة dendrites تشارك في معالجة الإشارات التي تتلاقى على3،حقل الجذعية4. Dendrites تتمتع بالمرونة للتكيف في مجال التنمية. على سبيل المثال، يشير متشابك له تأثير على المنظمة تغصن في العصبية somatosensory خلال مرحلة النمو و النضج العصبي5. إنشاء اتصال الخلايا العصبية تعتمد على morphogenesis ونضوج dendrites. تشوه dendrites مقترن تلف في وظيفة الخلايا العصبية. وقد أظهرت الدراسات أن شذوذ morphogenesis العصبية دا قد يسهم في مسببات أمراض الأعصاب متعددة، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD)، ومرض باركنسون (PD)، مرض هنتنغتون (HD)، ولو جيهريج المرض/ التصلب العضلي الجانبي (المرض)6،،من78. تظهر التعديلات متشابك في المرحلة المبكرة من الإعلان، بالتضافر مع انخفاض وضعف العصبية الدالة7،8. بيد أن التفاصيل المتعلقة بكيفية إسهام علم الأمراض تغصن المرضية في هذه الأمراض الأعصاب لا يزال بعيد المنال.

وينظم وضع dendrites الجينات ترميز شبكة معقدة من المنظمين، مثل الأسرة Wnt البروتينات9،10، وعوامل النسخ ويغاندس على مستقبلات سطح الخلية11،12 . المورفولوجية دا الخلايا العصبية تتكون من أربعة فصول (الفصل الأول والثاني الثالث، الرابع)، من الفئة التي الرابع دا الخلايا العصبية الأكثر تعقيداً في أنماط التفريع وقد استخدمت كنظام تجريبي قوية لتحسين فهم morphogenesis13، 14. خلال أوائل morphogenesis، overexpression و/أو [رني] إسكات الجينات في الصف الرابع دا الخلايا العصبية تؤدي إلى تغيرات في أنماط التفريع وتغصن التقليم13. من المهم وضع طريقة عملية للتحليل الكمي من أربوريزيشن الجذعية العصبية.

وقد أظهرنا سابقا أن إسكات أورثولوج المورفولوجية من SOX5، Sox102F، أدى إلى أقصر dendrites من الخلايا العصبية دا وتقليل التعقيد في الصف الرابع دا الخلايا العصبية15. نقدم هنا، إجراء تحليل كمي لمدى تعقيد أربوريزيشن الجذعية العصبية (نداك) في المورفولوجية. يوفر هذا البروتوكول، مقتبس من وصف المنهجية السابقة، أسلوب مختصر للاعتداء تنمية الخلايا العصبية الحسية دا. فإنه يوضح صورة قوية العلامات والعصبية دا في الثالثة الطور اليرقات جدار الجسم16،17،،من1819. هو بروتوكول قيماً للباحثين الذين يرغبون في التحقيق في نداك والفوارق التنموية في فيفو.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-إعداد التجريبية

  1. إعداد الكواشف التالية: الفوسفات في دولبيكو مخزنة المالحة (PBS)؛ Triton X-100؛ 0.2 ببست % (برنامج تلفزيوني + 0.2% Triton X-100)؛ 32% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين) وتخفيفه إلى نسبة 4 في المائة قبل الاستخدام؛ سيليكون الاستومر قاعدة وعامل المعالجة؛ تركيب أنتيفادي المتوسطة (مثلاً، إطالة الذهب)؛ وظفر البولندية.
  2. إعداد المعدات التالية: مجهر التشريح، اثنان حادة ملقط ومقص ميكروديسيكشن، عدد من المسامير ميكروديسيكشن، طبق بيتري لصنع طبق التشريح وشرائح المجهر وكوفيرسليبس، مجهر [كنفوكل]، الكمبيوتر مع تركيب البرمجيات ImageJ فيجي.

2. جمع اليرقات

  1. ورفيقه UAS-Sox102F-[رني] الذباب مع UAS-التجارة والنقل أو ppk-GAL4 ث1118 الذباب نوع البرية، على التوالي. ثقافة الذباب في الظروف القياسية عند 25 درجة مئوية.
  2. في ~ 5-6 أيام، جمع يرقات الطور الثالث من UAS-Sox102F-[رني]/ppk-GAL4، UAS-التجارة والنقل أو UAS-التجارة والنقل، و ppk-GAL4/+ التحكم بعناية مع الملقط للتشريح.

3-تشريح لليرقات

ملاحظة: يتم تشغيل كافة الإجراءات الموجودة في هذا القسم تحت مجهر ميكروديسيكتيون. التكبير ما يصل إلى المحققين. في محاولة لضبط عرض الأفق الأمثل. ويوصي بالتكبير X ~ 4-6.

  1. ضع يرقة في طبق تشريح مصنوع من سيليكون الاستومر قاعدة وثقافة الأنسجة طبق بيتري.
  2. دبوس هوك فم اليرقة للسماح للجانب الظهرية مواجهة، ودبوس ثم ذيل اليرقة. ضع الجانب الظهرية في الوسط إلى أقصى حد ممكن لفضح خط الوسط، الذي سيكون علامة الانفتاح.
  3. إضافة 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لليرقة للحفاظ على رطوبة الجسم.
  4. جعل قطع مع زوج من المقص على طول خط الوسط الظهرية بين تراتشيس اثنين، من والذيلية إلى روسترال. قم بقطع صغيرة في كل من الزوايا الأربع من جسم اليرقة.
  5. ضع رقم pin في كل من الزوايا الأربع للجسم حيث يكمن الجسم مسطح.
  6. إصلاح الجدار هيئة يرقة في 4% منهاج العمل لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. غسل في ببست لمدة 5 دقيقة كرر مرتين أكثر.
  8. قم بإزالة المسامير من الأنسجة. ثم نقل الأنسجة إلى شريحة زجاج، وتغطي مع تصاعد أنتيفادي المتوسطة، وجبل كشف الغطاء. الهواء الجاف ح 1 وختم الحواف مع البولندية ظفر.

4-تجهيز التصوير

ملاحظة: تم أخذ صور باستخدام نظام مجهر مقلوب [كنفوكل]. ويمكن تصوير المستخدم العينة باستخدام هدفا X 20 (مستحسن).

  1. التقاط الصور سلسلة Z. فتح مربع الحوار "التقاط سلسلة Z" في برنامج مجهر [كنفوكل]. تحديد نطاق لالتقاط الصور سلسلة Z.
    1. انقر فوق الزر "أعلى وأسفل". تحديد أعلى وأسفل بوضع وإدخال القيم إلى "أسفل:" و "أعلى:" مربعات. تعيين "خطوة" في مربع الحوار "التقاط سلسلة Z" ك 0.5 ميكرومتر. ثم انقر فوق الزر "تشغيل الآن" للحصول على صور سلسلة Z.
  2. حفظ الصور التي تم الحصول عليها كملفات *.tiff أو *.nd2.
  3. تخزين الشرائح في الظلام حامل في 4 درجات مئوية بعد التصوير.

5-تغصن التقييم

ملاحظة: كان البروتين بروتينات فلورية خضراء overexpressed co في UAS-التجارة والنقل والذباب ppk-GAL4 في الخلايا العصبية دا للأسفار بروتينات فلورية خضراء التصوير التحليل. تم قياس كمية طولها والمتفرعة، وهيكل الخلايا العصبية دا في يرقات الطور الثالث. وتشمل تحليل معلمات طول dendrites (ميكرومتر)، المساحة السطحية (ميكرومتر2)، ومجموع عدد الفروع، وهيكل التفريع (%). ويبين الشكل 1 المعلمات التحليل بالتفصيل.

  1. طول Dendrites
    ملاحظة: طول dendrites هو مجموع كافة dendrites المسمى الراسم في البرنامج المساعد.
    1. إعداد وتشغيل البرمجيات20 "فيجي إيماجيج" (https://fiji.sc/). ثم تقسيم الصور إلى قنوات منفصلة، إذا كانت هناك عدة قنوات للصور.
      ملاحظة: الصورة في هذا البروتوكول إلا على قناة واحدة للتجارة والنقل.
    2. تشغيل "الصورة | مكدسات | المشروع Z "للحصول على إسقاط Z؛ سوف تظهر نافذة جديدة باسم 'Z-الإسقاط.' انقر فوق "كثافة كحد أقصى" لنوع الإسقاط، وتنظيم أرقام بين شريحة بدء وإيقاف الشريحة اعتماداً على التفضيلات الفردية. انقر فوق "موافق". سوف تظهر صورة Z-إسقاط تقديم إسقاطات تغصن الواضح.
    3. تتبع في نيوريتيس.
      1. حدد "الإضافات | تجزئة | بسيطة الراسم نيوريتيس "في الإطار تتبع في dendrites. تجد سوما العصبية، ومن ثم انقر فوق نقطة واحدة في تغصن بدءاً من جسم الخلية، وهناك نقطة أخرى في التلميح لهذا تغصن.
        ملاحظة: البرنامج سيتم توصيل النقطتين مع خط أزرق.
      2. اضغط على "Y" في إطار المكون الإضافي إذا كان المسار واضح؛ يتم تتبع المسار تغصن حتى النهاية للمسار المحدد في الصور المرئية. انقر فوق "المسار الكامل" في إطار البرنامج المساعد نفسه؛ يتم إكمال الجزء (الشكل 2).
        ملاحظة: بعض dendrites انتهت بعيداً عن نقاط الانطلاق، التي قسمت الطريق إلى أجزاء أصغر. كانت مجتمعة في الجزء المتعلق بتوفير مسار كامل للتتبع.
    4. بعد اكتمال مسار، العودة إلى نقطة جديدة فيها الفروع. المسار الجديد يمكن أن يبني على؛ سوف تظهر مربع نافذة "كافة المسارات" قيم طول جميع المسارات (الشكل 3). حفظ ملف تتبع، ومتابعة آثار لم تنته كما هو مبين في الشكل 2.
    5. تصدير بيانات الطول تغصن بالنقر فوق، "ملف | تصدير *.cvs "في نافذة' المساعد '. ثم نلخص جميع أطوال المسار، وتصدير البيانات إلى برنامج تحليل/جدول بيانات. (الشكل 3).
  2. المساحة السطحية للخلايا العصبية دا
    1. حدد أداة الرسم اليدوي الحر في إطار '"فيجي إيماجيج"'. تتبع المسار، ثم قم بتوصيل نقاط النهاية. من القائمة 'تحليل'، حدد "تعيين قياسات | المنطقة. " انقر فوق "قياس" من القائمة 'تحليل'. تظهر النتيجة في مربع جديد مع القيمة لمنطقة محددة (الشكل 4). قم بنسخة إلى برنامج تحليل البيانات.
  3. إجمالي عدد الفروع وهيكل المتفرع من الخلايا العصبية دا
    1. حساب إجمالي عدد الفروع بفتح "التحليل"، ثم "تجعل | تحليل مسارات سكيليتونيزيد "في إطار البرنامج المساعد للبحث عن المفقودين (الشكل 5).
      ملاحظة: بنية أربور هي مجموع مستويات فروع. تم تعريف المسار بين خلايا الجسم ونصائح تغصن، ويمكن أن يتضمن المسار واحد فروع متعددة، مثل العرش الأولية هي dendrites من جسم الخلية العصبية. العرش الثانوي فروع من المرحلة الابتدائية مع العرش رباعي، وكويناري في التعليم العالي، وهلم جرا. يتم فصل هيكل تغصن التفريع تبعاً لمستويات فروع. على سبيل المثال، % الأساسي هو عدد الفروع مقسمة حسب العدد الإجمالي التفريع، وهلم جرا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كانت تعتبرها dendrites من الخلايا العصبية دا بروتينات فلورية خضراء co overexpressing (UAS-التجارة والنقل؛ ppk-GAL4) في سوما دا العصبية والعرش الجذعية للأسفار بروتينات فلورية خضراء التصوير التحليل. وكان تصويرها مورفولوجية dendrites العصبية دا قبل مجهر مقلوب [كنفوكل] (الشكل 2).

...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Dendrites التي يعصب البشرة مناطق الإدخال من الخلايا العصبية، ومورفولوجيس على تحديد كيفية تلقي المعلومات ومعالجتها بواسطة الخلايا العصبية الفردية. ويعكس التنمية تغصن مورفولوجيا التحوير الجيني للمنظمة تغصن. العصبية دا اليرقات المورفولوجية للجهاز العصبي المحيطي نموذجا هاما لدراسة التنم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

نود أن أشكر إيمير ألف وليام للتصوير من المساعدة التقنية. هذا العمل كان يدعمها الصندوق "علاج مرض الزهايمر" [أن R.E.T]، "المعهد الوطني للصحة" [R01AG014713 و R01MH60009 إلى R.E.T؛ R03AR063271 و R15EB019704 إلى أ. ل.]، ومؤسسة العلوم الوطنية [NSF1455613 إلى أ. ل.].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline(PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyde(PFA)Electron Microscopy Sciences15714-S
Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agentDow Corning Corportation3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
Fingernail polish CVS72180
Stereo microscopeNikonSMZ800
Confocal microscopeNikonEclipse Ti-E
Petri dishFalcon353001
ForcepsDumont11255-20
Scissors Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
Insect Pins Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Microscope slides and cover slipsFisher Scientific15-188-52

References

  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  6. Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
  7. Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer's disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
  8. Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
  9. Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
  10. Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
  11. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  12. Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
  13. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
  14. Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
  15. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
  16. Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
  17. Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
  18. Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
  19. Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
  22. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  23. Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
  24. Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
  25. Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).
  26. Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
  27. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
  28. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved