JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

أسلوب يظهر هنا لإعداد المصفوفة خارج الخلية اللسان (TEM) مع ديسيلولاريزيشن تتسم بالكفاءة. يمكن استخدام في تيم السقالات الوظيفية لإعادة بناء نموذج الخلايا الحرشفية (TSCC) اللسان تحت ظروف ثقافة ثابتة أو المقلبة.

Abstract

من أجل بناء نموذج فعال وواقعي للسان صدفية خلية سرطان (TSCC) في المختبر، تم إنشاؤها بأساليب لإنتاج ديسيلولاريزيد اللسان خارج الخلية مصفوفة (TEM) الذي يوفر السقالات الوظيفية للبناء TSCC. تيم تنص مكانة في المختبر لنمو الخلايا، والتمايز، والهجرة الخلية. المجهرية من المصفوفة خارج الخلية الأصلية (ECM) والتراكيب الكيميائية الحيوية الإبقاء في المصفوفة على ديسيلولاريزيد توفير منافذ خاصة بالانسجة لترسيخ الخلايا. يمكن أن تتحقق تلفيق تيم بالهضم ديوكسيريبونوكليسي (الدناز) مصحوبا جدية للمعالجة العضوية أو غير العضوية. من السهل أن تعمل هذا البروتوكول ويضمن كفاءة عالية ديسيلولاريزيشن. وأظهرت تيم سيتوكومباتيبيليتي مواتية للخلايا TSCC ظروف ثقافة ثابتة أو المقلبة، التي تمكن من بناء نموذج TSCC. كما استخدمت مفاعل حيوي عصامي للشرط المقلبة المستمرة لثقافة الخلية. وأظهرت TSCC أعيد بناؤها باستخدام ال سمات وخصائص تشبه السريرية TSCC الأنسجة، مما يوحي بإمكانية البحث TSCC.

Introduction

وقد اللسان مختلف المهام الهامة، مثل ديجلوتيشن، وصياغة، وتذوق. وهكذا، الأضرار بوظيفة اللسان تأثيراً كبيرا على نوعية حياة المرضى1. هو الورم الخبيث الأكثر شيوعاً في تجويف الفم اللسان الخلايا الحرشفية (TSCC)، التي تحدث عادة في الأشخاص الذين يشربون الكحول أو دخان التبغ2.

في السنوات الأخيرة، تم إحراز تقدم ضئيل في البحوث الأساسية في TSCC. الافتقار إلى الكفاءة في المختبر البحث نماذج يظل واحداً من أكبر المشاكل. وهكذا، تبين المصفوفة خارج الخلية (ECM) أن يكون حل محتمل. نظراً لإدارة المحتوى في المؤسسة إطار شبكة معقدة تتألف من عناصر المصفوفة درجة عالية من التنظيم، ستكون المواد سقالة بعد إدارة المحتوى في المؤسسة مثل هيكل وتكوين المختصة لبحوث السرطان. يمكن أن توفر إدارة المحتوى في المؤسسة ديسيلولاريزيد تماما المكانة للخلايا من نفس المنشأ في المختبر، الذي تبين أن أهم ميزة إدارة المحتوى في المؤسسة.

يمكن الاحتفاظ بالمحتوى مع المكونات الخلوية تجري إزالته من الأنسجة من خلال ديسيلولاريزيشن استخدام المنظفات والأنزيمات. توفر مختلف عناصر إدارة المحتوى في المؤسسة، بما في ذلك الكولاجين وفيبرونيكتين laminin في مصفوفة ديسيلولاريزيد المكروية أصلي-الأنسجة-مثل للخلايا المستزرعة، والتشجيع على البقاء والانتشار، وتمايز الخلايا3. وعلاوة على ذلك، يمكن تقليل الاستمناع لزرع الأعضاء إلى الحد أدنى مع عدم وجود المكونات الخلوية في إدارة المحتوى في المؤسسة.

حتى الآن، وقد حاولت اختﻻق أساليب لإدارة المحتوى في المؤسسة ديسيلولاريزيد في مختلف الأنسجة والأعضاء، مثل قلب4،5،،من67، الكبد8،9،10 ،11، الرئة12،13،،من1415،،من1617و18،الكلي19 , 20-ومع ذلك، قد وجدت لا البحوث ذات الصلة على القيام بأعمال مماثلة في اللسان لأفضل معرفتنا.

في هذه الدراسة، كانت ملفقة اللسان ديسيلولاريزيد المصفوفة خارج الخلية (TEM) كل كفاءة وبأسعار زهيدة بسلسلة من المعالجة الفيزيائية والكيميائية والانزيميه. ثم استخدمت في تيم للخص TSCC في المختبر، عرض محاكاة مناسبة للسلوك TSCC والتنمية. وقد تيم حسن توافق مع الحياة، فضلا عن القدرة على توجيه الخلايا المتخصصة الخاصة بالانسجة، مما يشير إلى أن تيم قد إمكانات كبيرة في TSCC البحث3. البروتوكول هو موضح هنا يوفر خياراً للباحثين الذين يدرسون في نشوء المرض أو العلاجات السريرية في TSCC.

Protocol

جميع الحيوانات العمل المنجز وفقا لقانون رعاية الحيوان، المبادئ التوجيهية المؤسسية والمعتمدة برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة، جامعة سون يأت-صن.

1-إعداد تيم

  1. تنفيذ الفئران بواسطة التفكك عنق الرحم وإزالة اللسان استخدام مقص الجراحية المعقمة وملاقط.
  2. تزج الألسنة في الإيثانول 75% لمدة 3 دقائق، ثم وضعت كل اللسان 1.5 مل أنابيب ايبندورف (الجيش الشعبي) مع 1 مل فوسفات 10 ملم معقمة مخزنة الحل (PBS).
    ملاحظة: تركيز برنامج تلفزيوني في جميع الخطوات التالية نفس التركيز في هذه الخطوة.
  3. خلية تفسخ بذوبان التجميد: تجميد الألسنة في أنابيب الجيش الشعبي في-80 درجة مئوية ح 1، وثم ذوبان الجليد الألسنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة لدورات 3.
  4. تحميل كل اللسان على قطعة من خياطة الجروح الجراحية باستخدام إبرة جراحية والتفاف نهاية الخياطة مع قطعة صغيرة من ورق ألمونيوم العقيمة. تنفيذ العملية في صحن ثقافة 3.5 سم أو 6 سم تحتوي على 75 ٪ إيثانول في ظروف معقمة.
    ملاحظة: الطول المناسب لكل قطعة من خياطة الجراحية حوالي 20 سم، والحجم المناسب لكل قطعة من ورق ألمونيوم عن 0.3 سم2 (1 سم × 0.3 سم). يجب أن يتم تحميل اللسان قرب ورق ألمونيوم.
  5. أشطف كل اللسان مع 3 مل PBS العقيمة في صحن ثقافة 3.5 سم أو 6 سم عن 30 س. إجراء هذه العملية في ظروف معقمة.
  6. أغسل اللسان بماء عالي النقاوة: إضافة أمبيسيلين في زجاجة الفم واسعة مع 250 مل من الماء المعقم عالي النقاوة إلى تركيز نهائي 90 ميكروغرام/مل. وضع الألسنة في زجاجة تحتوي على بار ضجة. تشديد غطاء زجاجة مع جزء من خياطة المتبقية خارج الزجاجة. القيام بهذه العملية في ظروف معقمة.
    ملاحظة: يمكن وضع ما يصل إلى 5 الألسنة في الزجاجة نفس النظر توينينج للخياطة. ورق ألمونيوم في نهاية الخياطة في زجاجة للحيلولة دون انزلاق قبالة اللسان. ينبغي أن توضع الألسنة ارتفاعها 2 سم من الجزء السفلي من الزجاجة بضبط طول خياطة المتبقية داخل الزجاجة. ملاحظة هذا أيضا خطوات 1.8 و 1.10 1.12 1.16.
  7. وضع الزجاجة على محرض مغناطيسي ح 12.
  8. أغسل اللسان مع كلوريد الصوديوم: إضافة أمبيسيلين في زجاجة الفم واسعة مع 250 مل من 1 العقيمة "م كلوريد الصوديوم" بتركيز نهائي 90 ميكروغرام/مل. التحرك الألسنة وشريط إثارة إلى القمقم. تشديد غطاء زجاجة مع جزء من خياطة المتبقية خارج الزجاجة. القيام بهذه العملية في ظروف معقمة.
  9. وضع الزجاجة على محرض مغناطيسي ح 24.
  10. خلية تفسخ واسطة X-100 تريتون: إضافة أمبيسيلين إلى نهائي تركز 90 ميكروغرام/مل في زجاجة الفم واسعة مع 250 مل معقمة 2% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني. التحرك الألسنة وشريط إثارة إلى القمقم. تشديد غطاء زجاجة مع جزء من خياطة المتبقية خارج الزجاجة. القيام بهذه العملية في ظروف معقمة.
  11. وضع الزجاجة على محرض مغناطيسي ح 48.
  12. أغسل اللسان مع كاكل2/MgCl2: إضافة أمبيسيلين في زجاجة الفم واسعة مع 250 مل من 5 ملم معقمة كاكل2/MgCl2 إلى تركيز نهائي 90 ميكروغرام/مل. التحرك الألسنة وشريط إثارة إلى القمقم. تشديد غطاء زجاجة مع جزء من خياطة المتبقية خارج الزجاجة. القيام بهذه العملية في ظروف معقمة.
  13. وضع الزجاجة على محرض مغناطيسي ح 24.
  14. الهضم من الدناز: إضافة 1 مل هانك لموازنة الحل الملح (حبس) لكل أنبوبة الجيش الشعبي. إضافة الدناز إلى حبس على التوالي إلى تركيز نهائية من 300 ميكرون. تحريك كل اللسان في كل أنبوب الجيش الشعبي، مع جزء من الخياطة خارج الأنبوب. القيام بهذه العملية في ظروف معقمة.
    ملاحظة: تأكد من أن الجزء من خياطة الجروح التي ما زالت داخل الزجاجات في الخطوات السابقة ما زالت أيضا داخل أنبوب الجيش الشعبي في هذه الخطوة، وتأكد من أن الجزء من خياطة الجروح التي لا تزال خارج الزجاجات في الخطوات السابقة ما زالت أيضا خارج الأنبوب الجيش الشعبي في هذه الخطوة.
  15. احتضان الألسنة في أنابيب الجيش الشعبي في 37 درجة مئوية ح 24.
  16. أغسل اللسان ببرنامج تلفزيوني: إضافة أمبيسيلين في زجاجة الفم واسعة مع 250 مل من PBS العقيمة إلى تركيز نهائي 90 ميكروغرام/مل. التحرك الألسنة وشريط إثارة إلى القمقم. تشديد غطاء زجاجة مع جزء من خياطة المتبقية خارج الزجاجة. القيام بهذه العملية في ظروف معقمة.
  17. وضع الزجاجة على محرض مغناطيسي ح 24.
  18. تخزين تيم معدّة في برنامج تلفزيوني العقيمة في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

2-ثلاثي الأبعاد (3D) إعادة تشكيل TSCC

  1. بناء نموذج TSCC ثابتة
    1. بذور 1.0 × 106 TSCC الخلايا المفردة (Cal27) في صحن ثقافة 3.5 سم. أضف 3 مل دولبيكو لتعديل المتوسطة/F12 (DF12) التي تحتوي على 10% الجنيني البقري المصل (FBS) و 90 ميكروغرام/مل ampicilin 90 ميكروغرام/مل كاناميسين النسر.
    2. ثقافة الخلايا Cal27 في 37 درجة مئوية لمدة 2 إلى 3 أيام. تأكد من أن الخلايا تغطي 60 في المائة على الأقل منطقة أسفل الطبق.
    3. تحميل تيم على المونولاير Cal27 في الطبق الثقافة.
    4. وضع الطبق حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية لمدة 28 يوما.
    5. تحديث المتوسط الثقافة كل يوم أثناء عملية الثقافة الخلية. أن تركيز أول أكسيد الكربون2 في الحاضنة هو 5%.
  2. بناء نموذج TSCC المقلبة
    1. إعداد مينيبيوريكتور المقلبة عصامي
      1. أخرج المكبس من حقنه 10 مل.
      2. حفر حفرة (قطر 1 سم) قرب المحطة الطرفية السفلي للقضيب وتحميل شريط ضجة في الحفرة.
      3. حفر حفرة (القطر من 0.5 سم) في وسط غطاء زجاجة زجاجة بلاستيكية على مستوى الفم ووضع قضيب المكبس عن طريق عملية النداءات الموحدة.
      4. قطع نصف أنبوب الطرد المركزي 50 مل واللحام أنه على الجانب الخارجي من غطاء الزجاجة.
      5. إرفاق فيشووكس بالقضيب بالتفاف القضيب مع خطوط الصيد التي ترتبط فيشووكس.
        ملاحظة: يمكن إرفاق ما يصل إلى 4 فيشوكس لقضيب.
      6. اﻷوتوكﻻف المجمع عصامي قبل الاستخدام.
        ملاحظة: لا لا اﻷوتوكﻻف زجاجة بلاستيكية واسعة الفم. استخدام زجاجة الفم واسعة بلاستيكية معقمة جديدة بينما استزراع الخلايا.
  3. خلية حيوية الثقافة
    1. بذور 1.0 × 106 خلايا Cal27 واحد في مينيبيوريكتور عصامي. إضافة 150 مل متوسطة DF12 الذي يحتوي على 10% FBS و 90 ميكروغرام/مل ampicilin كاناميسين 90 ميكروغرام/مل.
    2. تحميل تيم على مينيبيوريكتور استخدام فيشوكس تعلق على القضيب.
    3. تشديد غطاء الزجاجة ووضع مينيبيوريكتور على محرض مغناطيسية. تنشيط مينيبيوريكتور 200 لفة في الدقيقة في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية لمدة 7 إلى 14 يوما.
      ملاحظة: تركيز CO2 في الحاضنة2 CO هو 5%.

النتائج

هذا البروتوكول للتحضير لتبين أن تكون فعالة ومناسبة. أظهرت تيم ديسيلولاريزيشن مثالية بالمقارنة مع الأنسجة لغتهم الأصلية. وأكد نجاعة ديسيلولاريزيشن الهيماتوكسيلين-ويوزين (أنه) تلوين (الشكل 1أ-ب). وكشف أنه يلطخ النتائج الاختفاء التام لتلطيخ النووي...

Discussion

بروتوكول راسخة لتلفيق ECM ديسيلولاريزيد ينبغي الاحتفاظ بتكوين إدارة المحتوى في المؤسسة الأصلية أثناء إزالة المكونات الخلوية في الأنسجة تقريبا تماما21. وعلى الرغم من ديسيلولاريزيشن المبلغ عنها حاليا البروتوكولات التي تتطلب نضح عن طريق المفرج إزالة المواد الخلوية عن طريق النق...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

الكتاب تقر بالدعم للمنح البحثية من مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (31371390)، وبرنامج مشروع تنمية التكنولوجيا العالية الدولة (2014AA020702) والبرنامج "قوانغدونغ العلوم" والتكنولوجيا (2016B030231001).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
C57-BL/6J miceSun Yat-sen University Laboratory Animal Center
EthanolGuangzhou Chemical Reagent FactoryHB15-GR-2.5L
Sodium chlorideSangon BiotechA501218
Potassium chlorideSangon BiotechA100395
Dibasic Sodium PhosphateGuangzhou Chemical Reagent FactoryBE14-GR-500G
Potassium Phosphate Monobasic Sangon BiotechA501211
1.5 mL EP tubeAxygenMCT-150-A
Ultra-low temperature freezer Thermo Fisher Scientific
3.5 cm cell culture dishThermo Fisher Scientific153066
6 cm cell culture dishGreiner628160
Triton X-100Sigma-AldrichV900502
Calcium chlorideSigma-Aldrich746495
Magnesium chlorideSigma-Aldrich449164
DNaseSigma-AldrichD5025
Magnesium sulphateSangon BiotechA601988
GlucoseSigma-Aldrich158968
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761
AmpicillinSigma-AldrichA9393
KanamycinSigma-AldrichPHR1487
Surgical sutureShanghai Jinhuan
250 mL wide-mouth bottleSHUNIU1407
Magnetic stirrerAS ONE1-4602-32
CO2 incubatorSHEL LABSCO5A
10 mL syringeHunan Pingan
50 mL centrifuge tubeGreiner227270
Cal27 cellChinese Academy of Science, Shanghai Cell BankTongue squamous cell carcinoma cell line
U2OS cellChinese Academy of Science, Shanghai Cell BankHuman osteosarcoma cell line
DMEM/F12Sigma-AldrichD0547
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280
Hepes free acidBBIA600264
FBSHycloneSH30084.03
4 °C fridgeHaier
Water purifierELGA
HemocytometerBLAU717805

References

  1. Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
  2. Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
  3. Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
  4. Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
  5. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  6. Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
  7. Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
  8. Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
  9. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
  10. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
  11. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
  12. Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
  13. Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
  14. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
  15. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  16. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
  17. Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
  18. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  19. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
  20. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  21. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  22. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
  23. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
  24. Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
  25. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
  26. Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved