هلام-seq: طريقة لإعداد مكتبة تسلسل واحد من الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي باستخدام مصفوفات المائية

Summary

هلام-seq تمكن الباحثين في نفس الوقت إعداد مكتبات لكلا الحمض النووي--والحمض النووي الريبي-seq في التكلفة المضافة ضئيلة بدءاً من 100-1000 الخلايا باستخدام جهاز هيدروجيل بسيطة. وتعرض هذه الورقة نهجاً مفصلة لتصنيع الجهاز، فضلا عن البروتوكول البيولوجي لإنشاء مكتبات المزدوجة.

Abstract

إلا تحقق القدرة على تضخيم وتسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من عينات صغيرة في البداية في السنوات الخمس الماضية. ولسوء الحظ، البروتوكولات القياسية لتوليد الجينوم أو مكتبات ترانسكريبتوميك تتنافى والباحثين يجب أن تختار ما إذا كنت تريد تسلسل الحمض النووي الريبي أو لنموذج معين. هلام-seq يحل هذه المشكلة عن طريق تمكين الباحثين في نفس الوقت إعداد مكتبات للحمض النووي والجيش الملكي النيبالي بدءاً من 100-1000 الخلايا باستخدام جهاز هيدروجيل بسيطة. وتعرض هذه الورقة نهجاً مفصلة لتصنيع الجهاز، فضلا عن البروتوكول البيولوجي لإنشاء مكتبات المزدوجة. نحن تصميم seq جل بحيث يمكن تنفيذه بسهولة من الباحثين الآخرين؛ مختبرات علم الوراثة كثيرة لديها بالفعل المعدات اللازمة لإنتاج تصنيع الجهاز جل seq. لدينا بروتوكول يستخدم مجموعات المواد المستخدمة بشكل شائع لكلا التضخيم كل نسخة (الرغبة) وإعداد مكتبة، الذي من المرجح أيضا أن تكون مألوفة للباحثين بالفعل على دراية بتوليد الجينوم وترانسكريبتوميك المكتبات. نهجنا يسمح للباحثين لكي تتحمل سلطة تسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي على عينة واحدة دون تقسيم ومع التكلفة المضافة لا يعتد بها.

Introduction

الجيل التالي التسلسل (خ ع) كان لها تأثير عميق على الطريقة التي تجري بحوث علم الوراثة. حيث مرة ركز الباحثين على تسلسل الجينوم أكمله الأنواع، من الممكن الآن تسلسل الجينوم من ورم واحد أو حتى خلية واحدة في تجربة واحدة. ¹ خ ع أيضا جعلها فعالة من حيث التكلفة تسلسل وقائع الجيش الملكي النيبالي وجدت داخل خلية، عبارة عن مجموعة من البيانات المعروفة باسم الترنسكربيتوم. إلا تحقق القدرة على تضخيم وتسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من عينات صغيرة في البداية في السنوات الخمس الماضية. ^{2 , 3 ,} ولسوء الحظ، ⁴ البروتوكولات القياسية غير متوافقة والباحثين يجب أن تختار ما إذا كنت تريد تسلسل الحمض النووي الريبي أو لنموذج معين. عند انطلاق عينة كبيرة بما يكفي، فإنه يمكن تقسيم في النصف. في جداول صغيرة، ومع ذلك، الخسائر المادية بسبب تقسيم العينات يمكن أن يؤثر على نوعية المكتبة، وتجميع عينات يمكن متوسط من الاختلافات مثيرة للاهتمام بين الخلايا. ⁵ وعلاوة على ذلك، الباحثين مهتما متزايدة في فحص العينات التي لا يمكن تقسيم، مثل خلايا مفردة أو الخزعات الصغيرة الورم غير متجانسة. ⁶

ولمعالجة هذه المشكلة، وضعت مؤخرا ثلاثة بروتوكولات لتسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من نفس العينة انطلاق: جل seq⁷، ز & T-seq⁸والدكتور seq⁹. تعرض هذه المقالة بروتوكول مفصل لجل-seq، التي يمكن استخدامها لإنشاء مكتبات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في وقت واحد من عدد قليل من الخلايا 100 في التكلفة المضافة لا يعتد بها. الجانب رواية لجل seq هو القدرة على فصل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي تستند حصرا إلى حجم استخدام مصفوفات المائية منخفضة التكلفة. الابتكار الأساسية للبروتوكول Seq جل هو الفصل المادي للحمض النووي من الجيش الملكي النيبالي. ويتحقق هذا الفصل اليكتروفوريتيكالي باستخدام مزيج من الأغشية polyacrylamide التي تستفيد من حجم الاختلافات بين هذه الجزيئات. لوضع هذه الاختلافات في الحجم وفي السياق، تنظر كيف يتم تصويرها الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي: بينما الحمض النووي موجود بمقياس ميكرون، ويمكن عرضها باستخدام المجاهر التقليدية، الحمض النووي الريبي موجود بمقياس نانومتر ويجب تصويرها باستخدام تقنيات معقدة مثل البرد-إلكترون الفحص المجهري. ¹⁰

ويرد في الشكل 1النهج المتبع في فصل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في هذا البروتوكول. اللوحة اليسرى يظهر الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي حرة عائمة في الحل بالقرب غشاء. عندما يتم تطبيق مجال الكهربائي، كما هو مبين في اللوحة اليمنى، الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي تجربة قوة الغرواني الكهربي الحث على الهجرة من خلال الغشاء. وقد أنشأنا بضبط خصائص الغشاء، غشاء شبه منفذ يفصل الحمض النووي الريبي. جزيئات الحمض النووي يتم الضغط ضد الغشاء، ولكن أصبح متشابكاً في الحافة بسبب حجمها الكبير. جزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة، من ناحية أخرى، يمكن تكوين ونسج طريقهم عبر الغشاء. تشبه هذه العملية، المعروفة باسم ريبتيشن، على طريقة ثعبان يتحرك من خلال العشب. في نهاية المطاف توقفت هذه جزيئات الحمض النووي الريبي غشاء عالي الكثافة، والثاني أن من الصعب جداً للبوليمرات حتى أصغر (> 200 قاعدة أزواج) التملص من خلال. مرة واحدة مفصولة ماديا، يمكن استرداد الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي وتجهيزها لتوليد معلومات عن الجينوم والترنسكربيتوم على السواء. وفي حين أننا يمكن فصل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، وجدنا يتم الحصول على نتائج أفضل إذا كان الجيش الملكي النيبالي عكس نسخها إلى كدنا قبل الانفصال. هجن كدنا/الحمض النووي الريبي هي أكثر استقرارا من الحمض النووي الريبي وحدها ولا يزال يمكن أن تمر عبر غشاء منخفضة الكثافة.

الشكل 1 . مبدأ التشغيل جل seq. والمبدأ الأساسي المستخدمة فعلياً فصل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. في مجال الكهربائي المطبق، جزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة تهاجر عبر غشاء منخفضة الكثافة ولكن جزيئات الحمض النووي كبيرة محاصرون في السطح. واستنسخ هذا الرقم من الرقم 7 بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وتصف هذه الورقة بالتفصيل كلا تصنيع الجهاز seq جل وإقران البروتوكول البيولوجي لإنشاء مكتبات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. ويبين الشكل 2نظرة عامة على حد سواء. الجهاز مختلق من طبقات ثلاثة مختلفة الكثافة polyacrylamide الجل فوق بعضها البعض في عملية مماثلة لإنشاء معيار الجل التراص. ¹¹ البروتوكول البيولوجي يبدأ مع خلايا 100-1000 تعليق في برنامج تلفزيوني. يتم تفكيك الخلايا والحمض النووي الريبي يتم تحويلها إلى كدنا قبل استخدام الجهاز بفصل الدنا الجينومي الهجينة كدنا/الجيش الملكي النيبالي. بعد الانفصال، والانتعاش، والجينوم وترانسكريبتوميك تعد المكتبات باستخدام عملية أن يتابع عن كثب البروتوكول طقم الإعداد القياسي جينوم كل مكتبة. يمكن قراءة المزيد من التفاصيل حول التنمية والتحقق من الصحة لجل seq في مختبر على رقاقة منشور "seq جل: كل الجينوم وتسلسل الترنسكربيتوم عن طريق المتزامنة ذات المدخلات المنخفضة الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي مكتبة الإعداد باستخدام الحواجز المائية شبه نفاذية ." ⁷

الشكل 2 . بروتوكول جل seq. إقران لمحة عامة عن الخطوات لاختلاق الجهاز seq جل والبروتوكول إنشاء مكتبات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. استنسخت أجزاء من هذا الرقم من الرقم 7 بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

لإنشاء مكتبات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من الخلايا المفردة، وينبغي النظر في استخدام أما ز & T-seq أو ما يليها الدكتور ز & T-Seq، مثل seq جل الباحثين، يعتمد على فصل المادي للجيش الملكي النيبالي من الحمض النووي. هذا النهج يعتمد على رسول رنا (مرناً) 3 ' بوليادينيلاتيد الذيل كهدف سحب لأسفل. يتم التقاط مرناً على حبة مغناطيسي باستخدام تمهيدي اليغو-dT بيوتينيلاتيد. متى تم التقاط مرناً الخرز وتعقد في مكان مع مغناطيس ويمكن إزالة المادة طافية تحتوي على الحمض النووي الجينومي وتحويلها إلى أنبوب آخر. بعد الانتهاء من هذا الفصل المادي، يمكن إنشاء مكتبات منفصلة من مرناً والحمض النووي. ⁸ هذا النهج يعمل جيدا إذا كان الجيش الملكي النيبالي للاهتمام بوليادينيلاتيد، ولكن لا يمكن استخدامه لدراسة النصوص غير بوليادينيلاتيد، مثل الرنا الريباسي، الحمض الريبي النووي النقال، أو الحمض النووي الريبي من بدائيات النوى.

الدكتور seq يعتمد على خطوة ما قبل تضخيم حيث تتضخم الحمض النووي وكدنا المستمدة من الجيش الملكي النيبالي في الأنبوب نفسه. العينة ثم تقسيم في اثنين وتجهيزها بالتوازي مع إعداد مكتبات تسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي. للتمييز بين الحمض النووي وكدنا المستمدة من الجيش الملكي النيبالي، الدكتور seq نهجاً حسابية. تسلسلات التي تتواجد فيها إلا exons تقمع حسابياً في بيانات الحمض النووي الجينوم، كتلك التي يمكن نشأت من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. ميزة هذا النهج أن الحمض النووي وكدنا/الجيش الملكي النيبالي بحاجة لا يمكن فعلياً فصل كما الحال في جل seq وز & T-ما يليها ⁹ العيب، ومع ذلك، هو أن الدكتور seq يتطلب معرفة مسبقة بالجينوم والترنسكربيتوم (أي، exons مقابل introns)، وقد لا تكون مثالية لتطبيقات مثل تسلسل نويات، فيها العديد من النصوص لا بعد تماما تقسم ولا يزال يحتوي على إينترونس. ¹²

الجانب رواية لجل seq هو القدرة على فصل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في مئات خلايا استناداً إلى حجم حصرا. يتطلب هذا الأسلوب لا المعرفة مسبقاً من الجينوم أو الترنسكربيتوم، هو قوي ضد الربط غير مكتملة، ولا تقتصر على النصوص بولي-أدينيلاتيد. للتطبيقات حيث يمكن أن يبدأ باحث مع خلايا على الأقل 100، يوفر جل seq نهج مباشرة باستخدام مواد رخيصة ومتاحة على نطاق واسع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-إعداد الحل الأسلحة الكيميائية

ملاحظة: الخطوات التالية لإعداد المحاليل الكيميائية المطلوبة في خطوات لاحقة. وهذه يمكن إجراؤها بكميات كبيرة وتخزينها لعدة أشهر.

1. للبدء، إعداد 50 مل مياه النقية، ومنزوع تعقيم في 254 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية crosslinking فرن لمدة 15 دقيقة (15 مللي جول/سم² إجمالي التعرض) لتحييد أي تلويث الحمض الخلوي الصبغي. الحرارة إلى 37 درجة مئوية للاستخدام في الخطوات التالية.
2. جعل 10 مل 40% إجمالي (T) و crosslinker 3.3 في المائة (ج) (فيها) polyacrylamide السلائف الحل. وزن ز 3.867 مونومر الاكريلاميد و 0.133 ز من مونومر مكررا-مادة اكريلاميد. الجمع بين وإعادة التخزين يصل إلى 10 مل مع تنقية المياه الدافئة ودوامه حتى يذوب. مخزن محمية من الضوء في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: خلط 40% T، 3.3% C (فيها) polyacrylamide الحلول يمكن شراؤها تجارياً.
3. جعل 10 مل من 50% T، 5 ٪ ج جل الحل. وزن ز 4.750 مونومر الاكريلاميد و 0.250 غرام من مركب الاكريلاميد مكررا. الجمع بين وإعادة التخزين يصل إلى 10 مل باستخدام تنقية المياه الدافئة ودوامه حتى يذوب. مخزن محمية من الضوء في درجة حرارة الغرفة.
4. جعل 10 مل محلول السكروز 50% (w/v). إضافة السكروز 5 غ إلى اسطوانة وإضافة تنقية المياه الحارة تصل إلى إجمالي حجم 10 مل. ودوامه حتى يذوب وتخزين في درجة حرارة الغرفة.
5. جعل مل 10% 10 وكالة الأنباء الجزائرية (w/v). إضافة 1 ز من فوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) اسطوانة. إضافة الباردة (~ 4 درجة مئوية) تنقية المياه تصل إلى إجمالي حجم 10 مل ودوامه حتى يذوب. فورا تجميد في مختبرين من 200 ميليلتر.

2-جل-seq كاسيت تلفيق

ملاحظة: وضعت جل seq أصلاً مع شرائط تستقيم (انظر الجدول للمواد لمزيد من المعلومات)؛ بيد أن هذا البروتوكول يمكن تكييفها للعمل مع أي كاسيت التفريد هلام القياسية.

1. تحضير هلام السلائف في ثلاثة أنابيب بلاستيكية منفصلة عن طريق إضافة الكواشف كما هو موضح أدناه في الجدول 1 . لا إضافة وكالة الأنباء الجزائرية أو تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) حتى توجه في الخطوات التالية. دوامة المكونات مزيج دقيق.

حشو جل السلائف		السلائف جل عالي الكثافة		السلائف جل منخفض الكثافة
40% T، 3.3%C الاكريلاميد بيساكريلاميدي الحل	1.6 مل	50% T، 5% C الاكريلاميد بيساكريلاميدي الحل	2.4 مل	40% T، 3.3%C الاكريلاميد بيساكريلاميدي الحل	0.6 مل
المياه.	10.2 مل	المياه.	مل 1.0	المياه.	4.8 مل
محلول السكروز (50% w/v)	2.6 مل	محلول السكروز (50% w/v)	0.6 مل
10 X تريس-بورات-يدتا	1.6 مل			10 X تريس-بورات-يدتا	0.6 مل
فوق كبريتات الأمونيوم (10% w/v)	104.0 ميليلتر	فوق كبريتات الأمونيوم (10% w/v)	ميليلتر 50.0	فوق كبريتات الأمونيوم (10% w/v)	ميليلتر 39.0
تيميد	ميليلتر 6.0	تيميد	ميليلتر 1.0	تيميد	2.2 ميليلتر
الحجم الإجمالي	مل 16.1	الحجم الإجمالي	مل 4.1	الحجم الإجمالي	مل 6.0

الجدول 1. هلام الكواشف التوليف. هلام polyacrylamide السلائف الكواشف كافية لتصنيع أشرطة الكاسيت 2.

2. الغاز دي الحلول مونومر هلام بإدخال إبرة من خلال عملية النداءات الموحدة للأنبوب وربط هذه الإبرة إلى خط فراغ بيت. غمر هذه الجمعية في مجموعة حمام الموجات فوق الصوتية إلى أعلى وانتظر حتى تتوقف فقاعات الخارجة من السائل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية (~ 60 ثانية/أنبوب).
   ملاحظة: نوعية الفراغ والطاقة للحوض بالموجات فوق الصوتية ليست حاسمة طالما يمكن رؤية الفقاعات الخارجة من الحل.
3. إضافة تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية حشو جل السلائف ودوامه بإيجاز. فورا إضافة 6 مل السلائف جل حشو لكل كاسيت جل قبل بيبيتينج الحل في الجزء العلوي من الكاسيت. استخدام ميكروبيبيتي 1 مل لإضافة السلائف تزايدات الستة لتجنب إراقة. الوقت الإجمالي لهذه الخطوة ينبغي أن يكون أقل من 3 دقائق.
4. ضمان السائل هو المستوى بوضع أشرطة الكاسيت تستقيم على مستوى جدول. ملء ما تبقى الكاسيت بماء منزوع، ويطرد. "الماصة؛" الماء، مرة أخرى باستخدام زيادات 1 مل، ببطء داخل مركز الكاسيت التقليل من الاختلاط. تسمح البوليمر لعلاج لمدة ساعة واحدة على الأقل، تصل بين عشية وضحاها.
5. بعد الشفاء من البوليمر، وقد عكس الأشرطة هلام عبر بالوعة إلى إزالة تراكب المياه. يمكن استخدام بندقية هواء المضغوط للطف جاف الواجهة التي تهب الهواء من خلال فتح الكاسيت أعلى من مسافة 6 بوصات.
6. إضافة تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية بالسلائف جل عالي الكثافة ودوامه بإيجاز. فورا إضافة ميليلتر 320 من السلائف عالي الكثافة للكاسيت، مرة أخرى باستخدام ماصة 1 مل. ضمان السائل بالتساوي المعاطف طبقة جل حشو بالتأرجح في الكاسيت ذهابا وإيابا حوالي 3 مرات. وينبغي أن تتخذ هذه الخطوة أقل من ثلاث دقائق.
7. ملء ما تبقى الكاسيت بماء منزوع، ويطرد. "الماصة؛" ببطء مع ماصة 1 مل داخل مركز الكاسيت التقليل من الاختلاط. تسمح البوليمر لعلاج لمدة خمسة عشر دقيقة على الأقل، ويفضل أن تكون ساعة.
8. ومرة أخرى، عكس الأشرطة جل لإزالة تراكب المياه. يمكن استخدام الهواء المضغوط الجاف بلطف للواجهة. إضافة تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية بالسلائف جل منخفضة الكثافة ودوامه بإيجاز. ملء ما تبقى الكاسيت (~1.65 مل) مع السلائف جل الكثافة على الفور وإدراج مشط هلام.
9. "الماصة؛" فائض الاحتياطي السلائف في الجزء العلوي من المشط كما أنه سيتم استيعابها خلال البلمرة. تسمح البوليمر لعلاج 4 ساعات على الأقل، يفضل أن يكون ذلك بين عشية وضحاها. ويمكن تخزين المواد الهلامية لمدة أسبوع أو أكثر في المخزن مؤقت لحمض تريس-بورات-الإيثيلين (يدتا) (TBE العازلة).

3-نموذج إعداد وعكس النسخ

1. بدءاً بتعليق للخلايا ذات الاهتمام، وتعمل في غطاء الاندفاق الصفحي بوليميريز سلسلة من ردود فعل (PCR)، استخدام هيموسيتوميتير أو عداد خلية تلقائي لحساب تركيز الخلية. تمييع الخلايا لتركيز خلايا 100 إلى 1000 كل ميليلتر في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
   ملاحظة: تم التحقق من هذا البروتوكول على نطاق من الخلايا بما في ذلك PC3 والحلة وخلايا الكبد الماوس.
2. استخدام الكواشف في التنس المحترفات كيت (انظر الجدول للمواد)، مزيج ميليلتر 19 من المخزن المؤقت لتحلل والأسهم 1 ميليلتر من رناسي مثبط لإعداد 10 X حل من رد فعل المخزن المؤقت. خلق مزيج رئيسي تحلل كافية التخزين التي تحتوي على 0.5 ميليلتر من رد فعل المخزن المؤقت وميليلتر 2.75 نوكلاس المياه مجاناً لكل عينة.
3. "الماصة؛" تعليق خلية صعودا وهبوطاً 5 مرات على إعادة تعليق الخلايا تمت تسويتها، وثم "الماصة؛" 1 ميليلتر من العينة في أنبوب حرة قطاع نوكلاس 200 ميليلتر للتعقيم بالأشعة فوق البنفسجية. كرر حسب الضرورة تبعاً لعدد العينات. تأكد من تضمين عنصر تحكم سلبية التي بيبيتينج ميليلتر 1 نوكلاس المياه مجاناً بدلاً من الخلايا لرد فعل واحد. بعد ذلك، إضافة 3.25 ميليلتر من تحلل مزيج الرئيسي لكل عينة ومزيج من بيبيتينج برفق صعودا وهبوطاً 5 مرات.
4. يسخن cycler حرارية (مع غطاء ساخن) إلى 72 درجة مئوية. إضافة 1 ميليلتر من التمهيدي RT و 1 ميليلتر من 20 ميكرومتر عشوائي هيكسامير مع محول اتحاد لاعبات التنس (5-آجكاجتجتات-كاكجكاجاجتاك-NNNNNN-3) لكل عينة. نحتفظ بأنبوب واحد على الأقل كعنصر إيجابي لإعداد مكتبة جدنا وإضافة 2 ميليلتر من الماء بدلاً من الإشعال.
   ملاحظة: هيكسامير عشوائي مع اتحاد لاعبات التنس محول اختياري وله تأثير ضئيل على تسلسل النتائج.
5. احتضان عينات في 72 درجة مئوية في cycler الحرارية مسخن لمدة 3 دقائق الخلايا. إزالة خلايا من cycler الحرارية ومكان على الجليد لمدة دقيقتين. تخزين عنصر التحكم الإيجابي في 4 درجات مئوية حتى الخطوة 5.
6. بينما يتم ليسينج الخلايا، إنشاء وحدة تخزين كافية من مزيج الرئيسي النسخ العكسي لجميع عينات الحمض النووي الريبي التي تحتوي على نسب كاشف التالية: 2 ميليلتر من أول حبلا العازلة، 0.5 ميليلتر من القالب التبديل اليغنوكليوتيد (TSO)، ميليلتر 0.25 من مثبط رناسي، و 1 ميليلتر من المنتسخة العكسية (100 يو/ميليلتر).
7. يسخن cycler الحرارية إلى 42 درجة مئوية. إضافة ميليلتر 3.75 من مزيج الرئيسي النسخ العكسي للعينات المتبقية، يصل حجم العينة الإجمالية إلى 10 ميليلتر. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات.
8. إجراء النسخ العكسي عن طريق وضع العينات فورا في cycler حرارية مسخن. تشغيل البرنامج التالي: 42 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 4 درجة مئوية إلى الأبد. وهذا نقطة توقف آمنة.

4-الفصل جل ونموذج الاسترداد

1. بعناية قم بتنظيف حجرة التفريد جل استخدام منتج إزالة الحمض النووي. تطبيق مل عدة من عامل التنظيف السائلة إلى مسح لينت المتاح مجاناً ومسح عبر جميع الأسطح للدائرة، ثم قم بملء الدائرة مع 0.5 نظيفة x TBE. لتحقيق أفضل النتائج، ضع الجهاز برمته في فرن نانومتر الأشعة فوق البنفسجية 254 crosslinking وتعقيم لمدة 15 دقيقة (15 مللي جول/سم²).
2. إدراج كاسيت جل seq في قاعة التفريد جل وتأمينه في مكانة. ببطء بإزالة المشط جل عن طريق سحب شكل مستقيم. تتحرك ببطء لتجنب تمزق الهلام أو التمزيق أي من الأسلحة.
3. حفظ العينات من الخطوة 3 على الجليد، نحتفظ بعينه واحدة على الأقل كعنصر إيجابي لكدنا مكتبة الجيل. تخزين عنصر التحكم هذا في 4 درجات مئوية حتى الخطوة 6. إضافة 2 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ للعينات المتبقية، ويصل الحجم الإجمالي إلى ميليلتر ~ 12. دقة خلط العينات التي بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات.
4. الجمع بين 1 ميليلتر سلم الحمض النووي 2 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ و 7 ميليلتر من الماء. "الماصة؛" هذا الخليط في حارة 1 من كاسيت seq هلام كعنصر تحكم التفريد. "الماصة؛" العينات المأخوذة من الخطوة السابقة في ممرات منفصلة للكاسيت جل seq. كن حذراً لمنع التلوث بين الآبار بإدراج الماصة الكامل في كل بئر وإزالتها استخدام فقط حركة رأسية.
5. استخدام هلام قياسية التفريد الكهربي، تطبيق مجال الكهربائي من 250 الخامس عبر الكاسيت جل seq لمدة 30 دقيقة لفصل جدنا من هجن كدنا/الجيش الملكي النيبالي. بمجرد فصل، إزالة كاسيت seq جل من قاعة التفريد جل وفتح نصفي الكاسيت بالتحديق الحواف مع أداة إلغاء.
6. استخدام مشرط، قطع الهلام في نصف أسفل طبقة عالية الكثافة. تجاهل في النصف الذي يحتوي على جل حشو بالتقاط بيدك القفاز. بلطف قشر هلام المتبقية قبالة الكاسيت بإلغاء ذلك مع مكشطة طلاء أو أداة أخرى مشابهة. وضع هذا القسم من الجل في طبق يحتوي على ~ 30 مل 0.5 x TBE مع 3 ميليلتر من جل وصمة عار.
7. تغطية الحاوية للتقليل من فوتوبليتشينج وامتصاص الجل بينما تهز الحاوية برفق لمدة 5 دقائق. ضع الجل في غلاف بلاستيكي وتأخذ صورة الأشعة فوق البنفسجية باستخدام نظام توثيق هلام (لمزيد من التفصيل انظر الرقم 13). تعرض ثاني 30 عادة ما تنتج صوراً واضحة. التحقق من حدوث الانفصال.
8. نقل الجل إلى ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية لتسهيل تصور الأحماض النووية. ارتداء نظارات الأشعة فوق البنفسجية المناسبة، تأكيد النتائج من نظام التوثيق هلام. ينبغي أن يكون جدنا يقع بداية الجل منخفضة الكثافة وكدنا في واجهة المناطق المنخفضة الكثافة وعالي الكثافة.
9. استخدام مشرط، قطع مناطق الجل تحتوي على جدنا وكدنا. يتم استرداد عينات أفضل بقطع 4 ملم 10 ملم قسم مستطيلة من جل؛ ومع ذلك، الهندسة الدقيقة سوف تعتمد على نظام التفريد جل المستخدمة. تذكر أن تقوم بقص حارة محملة بمراقبة سلبية أيضا.
10. وضع كل مقطع قصت جل في أنبوب قطاع باستخدام زوج من ملاقط نهاية غير حادة. يجب الحرص على عدم تطبيق الكثير من القوة أو الهلام سيتم تقسيم إلى أجزاء متعددة. أن هذا يحدث ببساطة التقاط كل قطعة وإضافة إلى الأنبوب.
11. طحن الهلام في كل أنبوبة استخدام تلميح ماصة (200 ميليلتر ماصة نصائح تعمل بشكل جيد) بتحريك طرف الماصة بطريقة دائرية على الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة نوكلاس المياه مجاناً (40 ميليلتر في عينات جدنا وميليلتر 80 في عينات كدنا) لكل أنبوبة قبل إزالة تلميح الماصة المستخدمة لطحن هلام للتقليل من فقدان عينة.
12. مكان القطاع أنابيب إلى خالط دوامة داخل حاضنة 37 درجة مئوية، ويهز لمدة 8-12 ساعة. وهذا يسمح الأحماض النووية لنزع فتيل من الجل وهو وقف طبيعية نقطة لهذا البروتوكول يوم متعدد.
13. "الماصة؛" العينات في صفيحة تصفية مش 8 ميكرومتر وتدور اللوحة في 2600 س ز لمدة 5 دقائق لسلالة من الشظايا هلام. أرفع لوحة تصفية مش بعيداً عن لوحة السكن و "الماصة؛" عينات المياه خالية من جل في أنبوب قطاع جديد 200 ميليلتر.
14. أضف 1 ميليلتر من البروتياز (0.9 الاتحاد الأفريقي/mL) لكل عينة تحتوي على جدنا، مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً، واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تليها من المنظمة حرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. هذه الخطوة الحاسمة لاستنفاد nucleosomes ويجعل جدنا موجوداً للخطوات اللاحقة من رد الفعل.
15. باستخدام إبرة قياس 18، كزة ثقوب في قبعات كل عينة أنابيب. وضع العينات في فاكوفوجي لتقليل حجم السائل. ينبغي خفض عينات جدنا إلى 5 ميليلتر وكدنا عينات خفضت إلى 10 ميليلتر.
16. اعتماداً على فاكوفوجي وعدد العينات، سوف تختلف الوقت التبخر الكلي بين 30 و 60 دقيقة. إذا كان حجم العينة تقل وحدة التخزين الهدف، ببساطة إضافة نوكلاس المياه مجاناً لزيادة حجم العينة.

5-إعداد مكتبة جدنا

1. باستخدام فلوروميتير أو تقنية مشابهة، قياس تركيز الحمض النووي في كل عينة جدنا من الخطوة 4، فضلا عن مراقبة إيجابية من الخطوة 3. لبروتوكول مفصلاً راجع دليل مرجع fluorometer. ¹⁴
2. تمييع هذه العينات إلى 0.2 نانوغرام/ميليلتر من الحمض النووي. تبعاً لنوع الخلية انطلاق ونوعية النتائج المطلوبة، قد لا يزال ينتج تركيزات أقل مكتبات قابلة للحياة. وسوف يلزم بعض التجريب؛ غير أن المؤلفين النجاح مع مكتبات منخفضة تصل إلى 0.1 نانوغرام/ميليلتر.
3. إكمال إعداد مكتبة جدنا باتباع البروتوكول حجم رد فعل نصف إعداد مكتبة في الخطوة 7.

6-كدنا إعداد المكتبة

1. بدءاً من 10 عينات كدنا ميليلتر ومراقبة إيجابية من الخطوة 4، إضافة ميليلتر 12.5 2 X qPCR ميكس 0.5 ميليلتر كدنا PCR التمهيدي والمياه خالية من نوكلاس 2 ميليلتر.
2. إجراء PCR في ثيرموسيكلير في الوقت الحقيقي استخدام بروتوكول التالية: بداية ساخنة في 95 درجة مئوية لمدة دقيقة 3، تليها دورات 20-30 من 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 65 درجة مئوية 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لحجم العينة الإجمالية 3 الحد الأدنى هو 25 ميليلتر. رصد رد فعل المنحنيات ووقف التضخيم قبل عشر ترك ردود فعل ه المرحلة الأسية (زيادة إشارة خطية مقابل عدد دورة) تفاديا للتحف بكر بسبب أوفيرامبليفيكيشن. لمزيد من المعلومات حول تجنب أوفيرامبليفيكيشن، انظر المقطع مناقشة هذه الورقة، فضلا عن الرقم 15.
3. وبعد التضخيم، تنظيف المنتج باستخدام الخرز التثبيت عكسها (سبري) المرحلة الصلبة يتبع البروتوكول في الخطوة 8. وبمجرد الانتهاء، تابع إلى الخطوة التالية.
4. باستخدام فلوروميتير أو تقنية مشابهة، قياس تركيز الحمض النووي في كل عينة كدنا، فضلا عن مراقبة إيجابية من الخطوة 4. تمييع العينات إذا لزم الأمر لاحتواء حوالي 0.2 نانوغرام/ميليلتر من الحمض النووي. لا يزال إنتاج تركيزات أقل بشكل طفيف مكتبات قابلة للحياة. بعض التجريب سيكون مطلوباً، إلا أن الكتاب كان النجاح مع مكتبات منخفضة تصل إلى 0.1 نانوغرام/ميليلتر.
5. خطوة اختيارية: تنفيذ فصل الكهربي قياسية polyacrylamide هلام على 1-2 ميليلتر لكل عمل المنتج qPCR للتحقق من صحة رد فعل الجيل مكتبة. ويرد في الشكل 4صورة عينة لنتيجة ناجحة. لبروتوكول مفصلة بشأن كيفية إجراء التفريد polyacrylamide هلام، انظر الرقم 16.
6. إكمال إعداد مكتبة كدنا باتباع عدة إعداد مكتبة رد فعل نصف حجم البروتوكول في الخطوة 7.

7-المكتبة إعداد مع نصف حجم ردود الفعل

1. إعداد مكتبة يتبع البروتوكول طقم إعداد المكتبة باستخدام نصف حجم ردود الفعل. ¹⁷ جميع الكواشف المشار إليها في هذا الجزء من البروتوكول من إعداد مكتبة كيت (انظر الجدول للمواد). ابدأ بالأشعة فوق البنفسجية تعقيم عدد كاف من قطاع أنابيب لعدد العينات بحيث تتم معالجتها.
2. القيام برد فعل ترانسبوساسي بإضافة 5 ميليلتر ترانسبوساسي العازلة لكل أنبوبة قطاع لاستخدامها في المقايسة. قم بإضافة 2.5 الدنا ميليلتر الإدخال في 0.2 نانوغرام/ميليلتر (0.5 نانوغرام المجموع) تليها ترانسبوساسي 2.5 ميليلتر. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات.
3. احتضان في 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم عقد في 10 درجة مئوية. بعد العينة يصل إلى 10 درجات مئوية، إزالته من ثيرموسيكلير وإضافة ترانسبوساسي ميليلتر 2.5 إيقاف المخزن المؤقت فورا لكل عينة. تبقى العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
4. إعداد رد فعل PCR لتضخيم العينة transpose تعامل بإضافة مكتبة ميليلتر 7.5 الإعدادية PCR ميكس، 2.5 ميليلتر من التمهيدي فهرس 1 وميليلتر 2.5 من التمهيدي فهرس 2. كبسولة تفجير هذه الملكية وهي موفر من قبل الشركة المصنعة لمجموعة إعداد المكتبة. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات.
   ملاحظة: تأكد من أن يتم استخدام تركيبات التمهيدي فريدة من نوعها لكل عينة. وهناك 12 مؤشر مختلفة 1 الإشعال والإشعال مؤشر مختلفة 2 8، مما يجعل من الممكن لتسمية فريد ما يصل إلى 96 من عينات مختلفة. اختر مجموعة فريدة من كبسولة تفجير لكل عينة.
5. إجراء PCR باستخدام البرنامج التالي في ثيرموسيكلير. هو حجم العينة 25 ميليلتر.
   72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق
   95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
   12 دورات:
   95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان
   72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
   55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
   72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
   يعقد في 10 درجة مئوية
6. تنظيف المكتبات المعدة باستخدام سبري الخرز يتبع البروتوكول في الخطوة 8. يجب التحقق من المكتبات استخدام التفريد هلام أو مقايسة مماثلة. الرجوع إلى دليل مجموعة أدوات إعداد المكتبة للحصول على تفاصيل حول كيفية التحقق من المكتبات. ¹⁷

8. مكتبة حبة التثبيت عكسها المرحلة الصلبة التنظيف

1. المرحلة الصلبة الخرز التثبيت عكسها (سبري) ينبغي أن تكون مخزنة في مختبرين 1.5 مل، وينبغي أن تكون جلبت إلى درجة حرارة الغرفة قبل كل استعمال. كما يوصي بإعداد جديدة من الإيثانول 80% لكل تجربة. الخطوات التالية هي أساس البروتوكول حبة سبري في دليل مجموعة اتحاد لاعبات التنس. ¹⁸
2. أضف 1 ميليلتر المخزن المؤقت تحلل مجموعة اتحاد لاعبات التنس لكل منتج PCR. دوامة الخرز سبري حتى بالتساوي مختلطة، ثم إضافة 50 ميليلتر من حبات سبري لكل عينة. مزيج من بيبيتينج العينة صعودا وهبوطاً 10 مرات وثم احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 دقائق.
3. باختصار تدور العينات لجمع السائل من الجانب من الأنابيب. وضع العينات في جهاز فصل مغناطيسي ~ 5 دقائق حتى يظهر السائل واضحة تماما.
4. في حين العينات على جهاز الفصل المغناطيسي، ببطء "الماصة؛" بعيداً عن المادة طافية وتجاهل-ينبغي الحرص على عدم الإخلال بحلقة الخرز على الأنبوب. بعد إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% لكل عينة دون الإخلال بالخرز. انتظر لمدة 30 ثانية، وبعد ذلك بعناية "الماصة؛" إيقاف المادة طافية. كرر هذه الخطوة (الإيثانول الغسيل) مرة واحدة.
5. تسمح العينات الجافة لمدة 30 ثانية-1 دقيقة. عدم الإفراط الجاف للعينات كالشظايا الكبيرة سوف تصبح ملزمة بشكل دائم الخرز.
   ملاحظة: يوصي بفترة وجيزة جافة ضمان إزالة جميع آثار الإيثانول. وينبغي أن تظل كميات نزرة من الإيثانول وراء أنها يمكن أن تمنع قليلاً ردود فعل المتلقين للمعلومات.
6. إزالة العينات من جهاز الفصل المغناطيسي وإضافة 15 ميليلتر من الماء لكل عينة الحمض النووي من الخرز الوت. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً، وضمان إزالة الخرز من الجانبين من الأنابيب. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. باختصار تدور العينات وثم وضعها على جهاز الفصل المغناطيسي ل ~ 1 دقيقة حتى يظهر الحل واضح.
7. في حين العينات على جهاز الفصل المغناطيسي، ببطء "الماصة؛" حتى المادة طافية وتحويلها إلى أنابيب نظيفة. أن الحرص على عدم تعكير حلقة الخرز في الأنبوب. تجاهل هذه الأنابيب مع الخرز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يمكن تصور الفصل المادي هجن جدنا وكدنا/الجيش الملكي النيبالي في الجهاز seq جل من خلال تصوير جل الفلورية؛ ويبين الشكل 3نتيجة ممثل. تظهر لوحة بالجهاز جل seq ملفقة؛ أضيفت إلى التمييز بين مناطق مختلفة جل اللون كاذبة. لوحة ب يظهر إغلاق أربع نسخ فصل الألوان المختلفة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وهناك العديد من الخطوات الهامة المرتبطة بتصنيع جهاز seq هلام، فضلا عن البروتوكول نفسه. أثناء التصنيع، ونحن نوصي بدءاً بسمك الطبقة المحددة لمختلف المناطق من الجل. قضينا قدرا كبيرا من الوقت في اختبار خيارات مختلفة من تلفيق والبروتوكول الموصوفة هنا ينتج أفضل الأجهزة لأشرطة الكاسيت المدرجة ف?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acrylamide Monomer	Sigma Aldrich	A8887-100G
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	Referred to in the text as 6X loading dye
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits	Kapa BioSystems	7959613001	Referred to in the text as 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma Aldrich	146072-100G	Also known as bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)	Illumina	FC-131-1024	Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)
Nuclease Free Water	Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)	Takara/Clontech	634888	Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)
Random hexamer with WTA adapter	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Surface Decontaminant	ThermoFisher Scientific	7010PK	Referred to in the text as DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Referred to in the text as gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18	Sigma Aldrich	Z192554	Any equivalent hardware is acceptable
Branson CPX series ultrasonic bath	Sigma Aldrich	Z769363	Any equivalent hardware is acceptable
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Any equivalent hardware is acceptable
Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size	Sigma Aldrich	CLS3374	Referred to in the text as 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	Any equivalent hardware is acceptable
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216	Any equivalent hardware is acceptable
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	Any equivalent hardware is acceptable
XCell SureLock Mini-Cell system	ThermoFisher Scientific	EI0001	Any equivalent hardware is acceptable
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195	Any equivalent hardware is acceptable
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Discontinued, any equivalent hardware is acceptable
Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	Referred to in the text as gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Referred to in the text as UV transilluminator
Ultrasonic Bath	Bransonic	1207K35	Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.