JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن كمياً موت الخلايا البشرة في الضفادع مع chytridiomycosis استخدام أسلوبين. أولاً، نحن نستخدم المحطة الطرفية dUTP ترانسفيراز بوساطة نك نهاية الوسم (TUNEL) في الموقع علم الأنسجة لتحديد الاختلافات بين الحيوانات المصابة وغير مصاب سريرياً. ثانيا، نقوم تحليل السلاسل الزمنية للمبرمج على مدى الإصابة باستخدام تحليل بروتين caspase 3/7.

Abstract

البرمائيات تعاني من خسائر كبيرة في التنوع البيولوجي على الصعيد العالمي وهو أحد الأسباب الرئيسية تشيتريديوميكوسيس الأمراض المعدية. يحدث هذا المرض بسبب مسببات الأمراض الفطرية ديندروباتيديس باتراتشوتشيتريوم (Bd)، الذي يصيب ويعطل الضفدع البشرة؛ ومع ذلك، التغييرات المرضية لا صراحة تميزت. المبرمج (موت الخلايا المبرمج) يمكن أن يستخدمها مسببات الأمراض إلى تلف أنسجة المضيف، ولكن يمكن أيضا أن تكون إليه مضيف لمقاومة المرض لإزالة مسببات المرض. في هذه الدراسة، ونحن التحديد الكمي لموت الخلايا البشرة من الحيوانات المصابة وغير مصاب باستخدام فحوصات مختلفة اثنين: المحطة الطرفية dUTP ترانسفيراز بوساطة نك نهاية الوسم (TUNEL)، وكاسباسي 3/7. استخدام البطني، الظهرية، وأنسجة الجلد الفخذ في مقايسة TUNEL، نلاحظ خلية موت في خلايا البشرة في الموقع للحيوانات المصابة سريرياً ومقارنة موت الخلية مع الحيوانات مصابة باستخدام مجهر فلوري. من أجل تحديد كيفية تغيير مستويات المبرمج في البشرة على مدى الإصابة بإزالة عينات تو-نصيحة كل أسبوعين لمدة 8 أسابيع، واستخدام الإنزيم caspase 3/7 مع البروتينات المستخرجة لقياس النشاط داخل العينات. ثم أننا ربط النشاط caspase 3/7 مع التحميل العدوى. والرزن TUNEL مفيد للترجمة من خلية موت في الموقع، ولكن مكثفة باهظة التكلفة والوقت لكل عينة. والرزن caspase 3/7 بكفاءة للعينات ذات الأحجام الكبيرة والوقت طبعا التجارب. لأن الضفدع إصبع نصيحة خزعات صغيرة هناك غير استخراج محدود متاح لتوحيد نموذج عن طريق أساليب القياس الكمي البروتين، مثل فحص برادفورد. ولذلك، فإننا نقترح تقدير مساحة سطح الجلد من خلال تحليل الصور الفوتوغرافية خزعات أخمص القدمين تجنب المستهلكة مقتطفات من خلال توحيد عينة.

Introduction

البرمائيات هي تعاني حاليا من أحد أكبر خسائر التنوع البيولوجي العالمي من أي الأصناف الفقارية1. هو سبب رئيسي لهذه الانخفاضات chytridiomycosis الأمراض الجلدية القاتلة، الناجمة عن مسببات الأمراض الفطرية باتراتشوتشيتريوم dendrobatidis، دينار بحريني2. مسببات المرض سطحي يصيب البشرة، مما قد يؤدي إلى تعطيل وظيفة الجلد أسفر عن خسارة الكهرباء الشديدة والسكتة القلبية والموت3. المختلفة المحتملة المضيف آليات محصنة ضد دينار بحريني وتجري حاليا دراسة، مثل الببتيدات المضادة للميكروبات4،5، النباتات البكتيرية الجلدية6،7،مستقبلات الخلايا المناعية8 واللمفاويات النشاط9،10. ومع ذلك، قليلة هي الدراسات استكشاف ما إذا كان الموت المبرمج وخلية البشرة إليه محصنة ضد هذا الممرض القاتل.

قد يكون موت الخلايا، أما عن طريق المبرمج (موت الخلايا المبرمج) أو نخر (موت غير المبرمج)، في البشرة أمراض العدوى دينار بحريني . وتشير البحوث السابقة أن العدوى دينار بحريني قد حمل المبرمج لأنه لوحظ تعطل تقاطعات داخل الخلايا عندما يتعرض الجلد explants zoospore supernatants في المختبر11. بالإضافة إلى ذلك، التغيرات التنكسية البشرة في دينار بحريني-ولوحظت الضفادع المصابة باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني12،13. تحليلات ترانسكريبتوميك تشير إلى أن مسارات المبرمج أوبريجولاتيد في الجلد المصابة14، والخضوع سبلينوسيتيس البرمائية المبرمج عندما يتعرضون إلى سوبيرناتانتس دينار بحريني في المختبر15. وعلى الرغم من تزايد حجم الأدلة التي تشير إلى أنه يمكن أن يستحث دينار بحريني الخلية المبرمج والمضيف الموت في المختبر، دراسات في فيفو استكشاف أو التحديد الكمي للمبرمج تفتقر إلى الآليات من خلال تطور الإصابة. علاوة على ذلك، فإنه غير معروف إذا كان المضيف يستخدم المبرمج كاستراتيجية دفاعية محصنة لمكافحة العدوى دينار بحريني ، أو إذا كان المبرمج علم راض مرض.

في هذه الدراسة، ونحن تهدف إلى الكشف عن موت الخلايا البشرة والمبرمج في الحيوانات المصابة في فيفو استخدام أسلوبين: مقايسة البروتين caspase 3/7، ومحطة dUTP ترانسفيراز بوساطة نك نهاية الوسم (TUNEL) في الموقع المقايسة. كما يكشف فحص كل الجوانب المختلفة للخلية وفاة16، معا هذه الأساليب توفير فهم كامل للآليات التي تشارك في موت الخلايا، وضمان مقياس دقيق للأثر. يقد الإنزيم caspase 3/7 نشاط caspases المستجيب 3 و 7، الذي يتيح للتحديد الكمي لمسارات المبرمج الذاتية والخارجية على حد سواء. وفي المقابل، يكشف الإنزيم TUNEL تجزؤ الحمض النووي، الذي يحدث بسبب آليات موت الخلية بما في ذلك المبرمج ونخر بيروبتوسيس17. نحن نستخدم الإنزيم TUNEL للتحقيق في موقع موت الخلية داخل البشرة الحيوانات المصابة سريرياً ومصابة باستخدام ثلاثة أقسام مختلفة من الجلد: في دورسوم وفنتر والفخذ من كوروبوري بسيودوفريني. ويحدد هذا الأسلوب في موقع تشريحي لموت الخلايا، فضلا عن التمييز بين موقعها داخل طبقات البشرة محددة. ثم نستخدم الإنزيم caspase 3/7 لإجراء تحديد كمي سلسلة وقت المبرمج طوال 8 أسابيع عدوى في البينا فيريوكسي ليتوريا. نحن أخذ عينات نصيحة أخمص القدمين مرة كل أسبوعين من الحيوانات نفسها، وقادرة على ربط تحميل العدوى الممرض بنشاط caspase 3/7.

Protocol

جامعة جيمس كوك أقر أخلاقيات الحيوان في تطبيقات A1875 P. كوروبوري و A1897 و A2171 لام ف البينا.

1-الثروة الحيوانية والرصد

  1. بيت الحيوانات على حدة، وفي بيئة مناسبة لهذه الأنواع، مع مياه مناسبة، تغذية وتنظيف الجدول الزمني. فحص الحيوانات يوميا.
    1. استخدام الأفراد البالغين من المهددة كوروبوري بسيودوفريني (مقايسة TUNEL، القسم 4) و هدد البينا فيريوكسيي ليتوريا (مقايسة Caspase 3/7، القسم 5)، تبرع من الأسير تربية المرافق. الحفاظ على الحيوانات في 15-18 درجة مئوية، في موس والحصى الركيزة وضباب لهم يوميا بماء التناضح العكسي وتغذية 3 مرات أسبوعيا مع القناة الهضمية تحميل الصراصير.
  2. جمع البيانات في كل مرة كل أسبوعيا. مسحه الأفراد دينار بحريني كما هو موضح في "الخطوة 2، 1". تزن كل الحيوانات إلى ز 0.1 شارف استخدام مقياس، وقياس آنف للتنفيس عن طول (سفل) مم 0.01 أقرب استخدام مكابس الطلب الهاتفي.
  3. بعد التطعيم (على النحو المبين في الفرع 3)، تحقق من الحيوانات يوميا للأعراض الإكلينيكية للعدوى (سلاو الجلد غير النظامية، إينابيتينسي، احمرار الساق، واللامبالاة، أو تأخر رد الفعل الاستقامة) امتثالا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية الحيوان. Euthanize الحيوانات إذا كانت توجد علامات سريرية والاعتلال.
    1. Euthanize مع جرعة زائدة من ميثانيسولفوناتي تريكيني (MS222) (0.1% w/v MS222 على درجة الحموضة 6-7 مع بيكربونات الصوديوم في مياه الحنفية الذين تتراوح أعمارهم بين). تبقى الحيوانات في MS222 للحركة 10 دقيقة بعد كل توقف وهم عرض لا الاستجابة للمحفزات.

2-الاختبار للعدوى دينار بحريني

  1. مجهرية دينار بحريني
    1. مسحه كل الحيوانات مع مسحه رايون عقيمة جديدة (مسحه واحدة للحيوان الواحد). استخدم الأسلوب سوابينج التالية: خمس مرات على فنتر، خمس مرات على كل الفخذ، والجانب، وأطرافه. وهذا ما مجموعة 45 السكتات الدماغية.
    2. بلطف تدوير المسحة أثناء وبين السكتات الدماغية لضمان التقاط فعالة من الحمض النووي. قطع طرف مسحه إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى استخراج.
  2. استخراج الحمض النووي والتحليل قبكر
    1. استخراج الحمض النووي من مسحات بإضافة 50 ميليلتر من كاشف استخراج الحمض النووي المتاحة تجارياً مع 30-40 ملغ خرز والسليكا 0.5 مم. فاز حبة العينات في حبة الخافق خلية ديسروبتير بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة. في أعقاب خطوة الخافق حبة، الطرد المركزي العينات في 2,000 غ س ل 1 دقيقة.
    2. احتضان هذه العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، والسماح لتبرد. الطرد المركزي العينات في 5,000 س ز لمدة 3 دقائق، ثم نقل المادة طافية على أنابيب الطرد المركزي الصغرى الفردية 1.5 مل وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى قبكر.
    3. استخدام PCR الكمي (qPCR) بعد بويل et al. تحميل 200418 لتحليل العدوى. استخدام إجراء التعديلات التالية:
      1. تمييع الحمض النووي استخراج عينات 6:100 مع المياه مزدوجة. إضافة ميليلتر 0.7 من ألبومين المصل البقري (BSA) لكل بئر للمساعدة في منع تثبيط PCR. قم بتشغيل كل عينة في سينجليكاتي. في كل لوحة استخدام عنصر تحكم سلبية (أي قالب) وعنصر إيجابي مع سلسلة من المعايير تمييع لتقدير تحميل zoospore (العدوى).

3-التطعيم

  1. الثقافة دينار بحريني
    1. تعد الثقافة مرق بإضافة ز 16 من تريبتوني وز 2 من الجيلاتين هيدروليساتي ز 4 من اللاكتوز (تغل) إلى 1 لتر مياه. اﻷوتوكﻻف (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة) والسماح مرق لتبرد.
    2. تطعيم عزل دينار بحريني (في هذه الحالة، معزولة عن "ولاية نيو ساوث ويلز" عزل، أبيركرومبير-L.booroologensis-2009-LB1، الممر رقم 11) في مرق تغل وتنمو لمد 7 في 23 درجة مئوية، ثم نقل ثقافة مرق إلى لوحات أجار تغل.
    3. لجعل لوحات، إضافة ز 16 من تريبتوني ز 2 من الجيلاتين هيدروليساتي، 4 غرام من اللاكتوز (تغل) و 10 غم من أجار البكتريولوجية إلى 1 لتر من المياه والاوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة). مرة واحدة الخليط بارد ما يكفي للمس، ولكن قبل أن يتصلب، صب أجار تغل في 92 مم لوحات الثقافة القطر حيث تكون كاملة 1/4 إلى 1/3 وفي سلامة بيولوجية "الفئة الثانية" مجلس الوزراء.
    4. عندما قد وطدت أجار وتبريده تماما، تطعيم كل لوحة مع 0.5 مل من دينار بحريني من المرق السائل، وتنتشر بشكل متساو. تسمح دينار بحريني مرق خليط جاف على لوحة لحوالي 1 ح وثم ختم لوحات مع البارافين البلاستيك فيلم. احتضان لوحات أجار الجانب الأسفل في 23 درجة مئوية لمد 5-7.
  2. لوحات الفيضانات للحل تلقيح زوسبوري
    1. تحقق من حركية zoospore تحت مجهر خفيفة مقلوب لضمان استمرارية يوميا قبل التطعيم. عند الإصدار zoospore مرتفع، مع zoospores العديد من السباحة خارج سبورانجيا، الثقافة جاهزة للتطعيم.
    2. الفيضانات كل لوحة مع 3 مل من الذين تتراوح أعمارهم بين مياه الصنبور أو مياه الأحواض الاصطناعية، بصب الماء في اللوحة وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة للسماح زوسبوريس لإطلاق سراح في الماء. وبعد فترة الحضانة، صب تعليق zoospore في حاوية معقمة جديدة.
    3. تقدير تركيز zoospore اتباع إرشادات الشركة المصنعة باستخدام هايموسيتوميتير. بمجرد تركيز تعليق zoospore المعروف، تمييع التعليق بتركيز 1 × 106 زوسبوريس كل 3 مل بماء الصنبور أعمارهم.
  3. تلقيح الحيوانات
    1. تطعيم كل الحيوانات بصب 3 مل من مزيج العدوى عبر به فنتر19 في الحاويات الفردية 50 مل. تسمح العدوى الزائدة في تجميع إلى قاعدة الحاوية التطعيم. ترك كل الحيوانات في حاوية الفردية تلقيح عن 24 ساعة التأكد من الإصابة، وبعد تلقيح ح 24، يعود كل فرد إلى تيراريوم تطهيرها.
      1. تطهير صالح استخدام 13% حجم/حجم (v/v) التبييض تجارية حل20، شطف مرتين على الأقل بالماء، ثم السماح لتجف للا تقل عن 24 ساعة.
    2. دينار بحريني-السلبية الضوابط، صورية تطعيم الحيوانات باستخدام نفس الأساليب كما هو الحال في 3، 2-3-3، لكن الفيضانات دينار بحريني-لوحات أجار الحرة مع 5 مل ماء الصنبور عمره بدلاً من دينار بحريني تلقيح لوحات أجار.

4-TUNEL الإنزيم

  1. Euthanize الحيوانات التي تظهر عليهم علامات سريرية ل chytridiomycosis، كما هو موضح في الخطوة 1.3.1، وعدد متساو من دينار بحريني-السلبية مراقبة الحيوانات.
  2. تشريح الجلد (الظهرية، البطني، والفخذ) عينات من كل الحيوانات. إصلاح عينات الجلد ح 2 في 4% v/v الفوسفات مخزنة فورمالدهايد. قصيرة ويتفق تحديد الوقت يسمح الأنسجة لتكون ثابتة تماما، ولكنه يسمح أيضا لتلطيخ immunohistochemistry فعالة ودقيقة. ثم نقل إلى الإيثانول 80% حتى التضمين لتمزيقها.
  3. تضمين الجلد في شمع البارافين للتحضير النسيجي اتباع الأساليب القياسية21. باختصار، البروتوكول كما يلي:
    1. يذوي الأنسجة في سلسلة متدرجة من الإيثانول، وواضح الإيثانول مع زيلين نفط. تضمين الأنسجة في شمع البارافين، ووضع جميع الجلد ثلاث عينات لكل فرد في كتلة واحدة البارافين.
  4. قسم الجلد باستخدام مبضع عقب إعداد غذائها القياسي21. المقطع الأنسجة متسلسل في 5 ميكرومتر ومن ثم إلصاق الشرائح الزجاجية ماء. ضع أربع هيستوسيكشنز المسلسل كل نوع من أنواع البشرة كل شريحة. جعل الشرائح الثلاث للفرد مع أقسام الجلد التسلسلي، وتذكر أن كل شريحة بالأقسام الأربعة لكل الأنسجة الملصقة.
  5. وصمة عار الشرائح بالترتيب التالي:
    1. وصمة عار الشريحة الأولى مع توضع تليها ويوزين كونتيرستينينج (ح & ه). هذه الشريحة تصور موقع sporangia دينار بحريني داخل الجلد.
    2. وصمة عار الشريحة الثانية بعد مقايسة TUNEL متاحة تجارياً لإعداد غذائها واتبع إرشادات الشركة المصنعة، التي يرد وصفها أدناه.
      1. أولاً، ديبارافينيزي مقاطع الأنسجة في جرة كوبلين بالغسيل الشرائح مع ثلاثة تغييرات زيلين نفط لمدة 5 دقائق في المياه والصرف الصحي، واتبع مع اثنين من التغييرات من الإيثانول 100% لمدة 5 دقائق كل غسل. اتبع مع غسل واحد من الإيثانول 95% لمدة 3 دقائق ومن ثم الإيثانول 70% للحد الأدنى 3 إنهاء مع غسل واحد لبرنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
      2. بريتريت الأنسجة مع البروتين الطازج المخفف هضم إنزيم (بروتيناز ك بتركيز 20 ميكروغرام/مل مخففة في برنامج تلفزيوني)، وإضافة مباشرة إلى الشريحة. السماح لاحتضانها ل 15 دقيقة يغسل مع اثنين من التغييرات في برنامج تلفزيوني في جرة كوبلين لكل 2 دقيقة.
      3. انقر فوق إيقاف السائل الزائد وآرو في 3.0% بيروكسيد الهيدروجين في برنامج تلفزيوني في جرة كوبلين لمدة 2 دقيقة في غرفة درجة الحرارة. شطف مرتين مع برنامج تلفزيوني، لمدة خمس دقائق كل غسل.
      4. انقر فوق إيقاف السائل الزائد، ثم تطبيق 75 سم ميليلتر/52 التوازن المخزن المؤقت مباشرة على الأنسجة على الشريحة. احتضانها الصنبور س. 10 قبالة السائل الزائد حول القسم وتطبيق 55 ميكروليتر/5 سم2 إنزيم ترانفيراسي (TdT) ديوكسينوكليوتيديل محطة العمل. احتضان في دائرة هوميديفيد ح 1 في 37 درجة مئوية.
      5. بعد الاحتضان TdT، وضع الشريحة في جرة كوبلين العامل قوة توقف/يغسل المخزن المؤقت، تحرض لمدة 15 ثانية واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تغسل الشريحة بثلاثة تغييرات في برنامج تلفزيوني لمدة 1 دقيقة للمياه والصرف الصحي. انقر فوق إيقاف السائل الزائد.
      6. تطبيق المتقارن المضادة-ديجوكسيجينين (والرودامين) التي قد تم تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة للأنسجة, 65 سم 5 ميليلتر/2. احتضان في غرفة هوميديفيد لمدة 30 دقيقة في درجة الحرارة الغرفة وتجنب التعرض للضوء. يغسل مع أربعة تغييرات في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة للمياه والصرف الصحي. انقر فوق إيقاف السائل الزائد.
      7. الانتهاء من إضافة ميليلتر 15 من 0.5-1 ميكروغرام/مل DAPI (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي) في الشريحة المتوسطة المتصاعدة للشريحة، الذي يعمل بمثابة وصمة عار عداد. ثم تغطي كشف الغطاء وختم مع طلاء الأظافر أو الأسمنت المطاطي. السماح للشرائح لتجف في الظلام كما التحليل حساسة للضوء.
    3. الشريحة الثالثة وصمة عار هو الملون باستخدام مقايسة TUNEL وكونتيرستين DAPI، ولكن استخدامها كعنصر تحكم الإيجابية والسلبية لكل عينة.
      ملاحظة: من هيستوسيكشنز 4 على الشرائح التحكم، 2 أول replicates التحكم الإيجابي و 2 الماضي هي replicates المراقبة السلبية.
      1. لعناصر إيجابية، بدلاً من الخطوة 4.5.2.2، قبل التعامل مع الأنسجة مع المخزن المؤقت DN (30 ملم تريزما قاعدة، الرقم الهيدروجيني 7.2، 4 مم مجكل2، 0.1 مم ال دي دي تي) والسماح لاحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم حل الدناز أنا في DN المخزن المؤقت لتركيز نهائي من 0.1ug/مل، وتطبيقها مباشرة على الشريحة. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.  ثم أغسل الشريحة بالغسيل 5 dH2س لمدة 3 دقائق كل غسل. لطخة قبالة السائل الزائد. ثم استئناف TUNEL المقايسة وفقا لتوجيهات في قسم 4.5.2.3.
      2. لعناصر سلبية، لا تقم بإضافة إنزيم ترانفيراسي (TdT) ديوكسينوكليوتيديل المحطة الطرفية لتلك العينات (كما هو موضح في القسم 4.5.2.4).
  6. مراقبة الشرائح TUNEL فور الانتهاء من المقايسة.
    1. أخذ الصور بشكل عشوائي الفواصل على طول كل قسم الجلد في 200 X باستخدام مجهر فلوري، باستخدام عوامل التصفية لوصمة والرودامين على حد سواء، مما يكشف عن الخلايا أبوبتوتيك ويظهر الأحمر، و DAPI الذي يكشف عن جميع الأنوية ويظهر الأزرق، حيث تراكب يمكن أن تتولد خلايا. تأمين الخلايا على الأقل 100 هي تصوير كل قسم الجلد كل عينة. تخزين الشرائح في مربع مجهر مظلمة في-20 درجة مئوية.
    2. حساب عدد الخلايا (DAPI الأزرق الملون) كل صورة. كفالة يتم عد الخلايا على الأقل 100 كل قسم من الجلد. للوصول إلى خلايا 100، حساب كافة الخلايا الموجودة داخل الصورة. إذا كان أقل من الخلايا ثم 100 موجودة في صورة واحدة، عد صورة أخرى حتى يتم التوصل إلى خلايا على الأقل 100 كل قسم الجلد للحيوان الواحد.
    3. بعد ذلك، عد عدد الخلايا TUNEL إيجابية في نفس الصور (والرودامين الأحمر الملون). الخلايا TUNEL الإيجابية، التي تشير إلى المبرمج ولا نخر أو الخلفية، هي خلايا مفردة مع حواف الخلية واضحة (الأغشية سليمة مع لا تحلل). في بعض الأحيان تقليص الخلايا إلى الهيئات أبوبتوتيك النموذج.
    4. تحديد مجالات عدها في مقايسة TUNEL وتحليل المناطق المقابلة على ح & ه الملون هيستوسيكتيونس. تأكيد أن ح & ه الملون الأقسام تتوافق مع مواقع الإصابة دينار بحريني ، مما يضمن دينار بحريني-وتستخدم المواقع المصابة عند عد الخلايا أبوبتوتيك في مقايسة TUNEL.

5-كاسباسي 3/7 بالانزيم

  1. جمع نصائح إصبع من كل الحيوانات ( Bd-مكشوف و دينار بحريني-السلبية) مرة واحدة أسبوعيا خلال الأسبوع الثالث بعد التلقيح، ومرة كل أسبوعين حتى نهاية التجربة، ما يصل إلى 8 أصابع للفرد.
    1. قطع طرف إصبع القدم في الكتائب الثانية مع مقص التعقيم اللهب، ومكان في microtube 1.5 مل وتجمد فورا في-80 درجة مئوية.
  2. استخراج البروتينات من عينة إصبع المجمدة.
    1. وضع العينات في 100 ميكروليتر من عينة المخزن المؤقت (25 مم حبيس الرقم الهيدروجيني 7، 5 ملم مجكل2) مع اثنين حبات الفولاذ المقاوم للصدأ (3.2 ملم) في microtube ملولبة 1.5 مل. عينات من 4 دورات حبة 1 دقيقة بالضرب بأقصى سرعة (في الخافق حبة نفسها المستخدمة في الخطوة 1.2.1) تليها 3 دقيقة على الجليد. وبعد تحلل، الطرد المركزي العينات في 12,000 س ز و 4 درجة مئوية للمادة طافية جمع 5 كحد أدنى لاستخدام في المقايسة.
  3. قياس تركيز البروتين كل عينة باستخدام مقايسة برادفورد.
    1. في صفيحة جيدا 384، مزيج 10 ميليلتر من البروتين استخراج مع 10 ميليلتر من كاشف برادفورد، واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أداء كل عينة في التكرارات، جنبا إلى جنب مع سلسلة من 5 إضعاف جيش صرب البوسنة تمييع المعايير. قراءة امتصاص في 595 نانومتر على قارئ لوحة امتصاص.
  4. وبدلاً من ذلك، إذا كانت العينات نصيحة تو صغيرة جداً (تركيز البروتين قرب أدنى مستوى حسبما حددته المقايسة برادفورد في خطوة 4.3.1، أو إذا كانت الضفادع التي عينات تحت 3 ز إجمالي وزن)، توحيد عينات بتقدير سطح الجلد المنطقة باستخدام الصور، بدلاً من فحص برادفورد.
    1. قبل استخراج البروتينات من العينة للفحص كاسباسي، تصوير كل إصبع في 40 X التكبير باستخدام مجهر ضوء مقلوب.
    2. تحليل العينة أخمص القدمين باستخدام كمبيوتر التصوير البرمجيات، بتقدير مساحة إصبع القدم. القيام بذلك عن طريق رسم خط حول حافة القصاصة أخمص القدمين، ومجال تقدير البرمجيات التصوير داخل الشكل. ثم ضرب هذا المجال pi (3-14)، التي سوف التقريبي المساحة السطحية للعينة الجلد 3-ديمينشونال (كالطول × مساحة مقطعية (pi x قطر) يعطي مساحة السطح الخارجي للأنبوب).
  5. إجراء المقايسة caspase 3/7.
    1. في صفيحة 384 التﻷلؤ حسنا، إضافة 10 ميليلتر من كاشف caspase المتاحة تجارياً 3/7 و 10 ميليلتر لاستخراج البروتين. قم بتشغيل كل عينة في ثلاث نسخ.
    2. مزيج الكواشف التي تهز اللوحة ببطء على إينكوباتي س. 15 لوحة بعيداً عن الضوء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قياس التﻷلؤ باستخدام قارئ لوحة الإنارة.

النتائج

والرزن TUNEL

هناك المزيد من الخلايا TUNEL الإيجابية في الحيوانات المصابة مما في الحيوانات مصابة عنصر التحكم. الموقع في الموقع TUNEL إيجابية تختلف من الخلايا المصابة ومراقبة الحيوانات. في مراقبة الحيوانات، وكان هناك توزيعاً حتى TUNEL إيج...

Discussion

وبحثنا في المبرمج البشرة وموت الخلية كآلية محتملة لعلم الأمراض chytridiomycosis المرض القاتل أو إليه لمقاومة الأمراض في الأنواع عرضه دينار بحريني . قمنا باستخدام أسلوبين لتقييم موت الخلايا في البشرة والمقايسة TUNEL في الموقع خلية البشرة الموت تحليل، والمقايسة caspase 3/7 لرصد موت الخلايا الب?...

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

ونحن نشكر الأشخاص التالية أسماؤهم الذين ساعدوا بتربية وجمع البيانات: تيجتميير دال، جيم دي يونغ، هوكس J.، فوسين ك.، برسيفال س.، McWilliams م.، بيرتولا L.، م. ستيوارت، هارني أ. ونبيل ت.؛ ومرسيس م. للحصول على المساعدة مع تشريح. كما نود أن نشكر مكفادين م.، هارلو ص وحديقة تارونغا لرفع مستوى ل. ف. البينا، وزاي مارانتيلي لرفع كوروبوري P.. ونشكر باسمانس واو، ألف مارتل لإسداء المشورة بشأن فحوصات المبرمج، قسطنطين جيم، كلادنيك ألف وويب ر. للحصول على المساعدة مع الإنزيم TUNEL، واميتو ت. ووكر Weßels لمساعدة مع البروتوكول وطقم للمقايسة caspase 3/7. هذه المخطوطة والبروتوكول هو مقتبس من برانيلي وآخرون عام 2017 الأقران ي22.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
POLARstar OmegaBMG LabtechLuminescent plate reader
384 well flat clear bottom plateCorning3707
384 well low flange white flat bottom plateCorning3570
Agar Bacteriological (Oxoid)FisherOXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered FormalinFisher6764254
Lactose Broth (Oxoid)FisherOXCM0137B
Sodium BicarbonateFisherBP328-500
Tricane-S (MS-222)FisherNC0872873
TryptoneFisherBP1421-500
Bovine Serum AlbuminInvitrogen15561020
Sterile rayon swabMedical Wire & EquipmentMW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection KitMerck MilliporeS7165
Coomassie Bradford reagentPierce23200
Caspase Glo  3/7PromegaG8090
HEPES bufferSigma AldrichH0887-20ML
Magnesium chlorideSigma Aldrich1374248-1G
Gelatin hydrolysate EnzymaticSigma-AldrichG0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X)Thermo/Life20-012-043
PrepmanThermo/Life4318930
TaqMan Fast Advanced Master MixThermoFisher4444556
ParafilmBemisPM996
Clorox bleachClorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular GradeFisherBP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscopeCarl ZeissFlorescent microscope
3.2mm stainless steel beadsBioSpec11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		TaqmanIndividual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		TaqmanIndividual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′)TaqmanIndividual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR InstrumentsQiagenqPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5mlFisher02-681-372
Cell culture petri platesNunc263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mmBioSpec11079105Z

References

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
  4. Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
  5. Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
  6. Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
  7. Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
  8. Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
  9. Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
  10. Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
  11. Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
  12. Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
  13. Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
  14. Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
  15. Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
  16. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
  17. Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
  18. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
  19. Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
  20. Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
  21. Woods, A., Ellis, R. . Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).
  22. Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135 TUNEL

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved