نموذج فأر من التعب المركزي تعديله باستخدام أسلوب منصة متعددة

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لإدخال نموذج الفئران من التعب المركزي استخدام تعديل أسلوب منصة متعددة (ممبم).

Abstract

في هذه المقالة، قمنا بعرض نموذج الفئران من التعب المركزي استخدام تعديل أسلوب منصة متعددة (ممبم). تم تصميم مربع "منصة متعددة" كخزان لمياه مع المنصات الضيقة في الجزء السفلي. نموذج الفئران إلى الخزان ووقفت على المنصات ح 14 (18:00-08:00) يوميا لمدة 21 يوما على التوالي، مع مجموعة عنصر تحكم فارغاً للتباين. وأظهرت الفئران في المجموعة النموذجية في نهاية النمذجة، مظهر التعب واضحة. تقييم النموذج، أجرينا العديد من الاختبارات السلوكية، بما في ذلك فتح الحقل اختبار (الغفور)، مرتفعة الإضافة إلى المتاهة (EPM)، واختبار السباحة حصرية (ES). وأظهرت النتائج هذا القلق، وضعف الإدراك المكاني، أداء ضعف العضلات، وانخفض النشاط التطوعي المعروضة في نموذج الفئران تأكيد تشخيص التعب المركزي. كما أن التغيرات العصبية المركزية التحقق من النتيجة. وفي الختام، محاكاة النموذج بنجاح التعب المركزي، وقد تساعد الدراسة في المستقبل مع النموذج تكشف عن الآلية المرضية لهذا المرض.

Introduction

التعب هو أحد العوامل الرئيسية التي تهدد صحة الإنسان¹. في العقود الماضية، أثبتت البحوث المختلفة أن التعب آثار محيطيا لكن يحركها مركزياً، ويقترن دائماً مع الاضطرابات العاطفية والمعرفية. أول من اقترح فيزيولوجي الإيطالية Mosso ألف كلمة "التعب المركزي"². ومن يعرف عموما محدودة النشاط التطوعي وضعف الإدراك بسبب الخلل في انتقال دفعة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)³. بالمقارنة مع العضلات المحيطية والإرهاق، التعب المركزي يؤكد التغييرات في الجهاز العصبي المركزي، فضلا عن ما يترتب عليها من الاضطرابات النفسية/السلوكية، بما في ذلك الاكتئاب والقلق، وضعف الإدراك، وفقدان الذاكرة. دراسة واحدة تبين أن عوامل عديدة يمكن أن تحدث التعب المركزي، بين النشاط البدني المفرط والضغوط النفسية التي هي غنى جداً⁴. أما بالنسبة للآلية المرضية، شرح نظريات مثل فرضية المسار التربتوفان-كينورينيني⁵ التغييرات في مسارات معينة؛ ومع ذلك، إجراء دراسات أكثر تعمقاً لا يزال يتعين الكشف عن الارتباطات الوسطى-الطرفية من التعب المركزي.

كما الآلية الكامنة وراء التعب المركزي لا يزال غير واضح، نموذج حيوان فعال مهم جداً لإجراء مزيد من البحوث. نماذج التعب الموجودة هي معظمها الناجمة عن الإفراط في ممارسة، مثل المطاحن⁶ والسباحة محملة بوزن⁷، مع الاهتمام قليلاً بشأن العوامل النفسية. لمحاكاة أفضل وضع التعب المركزي، وضع مجموعتنا نموذج الفئران مع ممبم. خلال عملية النمذجة، تظل الفئران الدائمة على منصات الضيقة في المربع "منصة متعددة" لساعات طويلة بما في ذلك جزء من وقت النوم. تختلف عن نماذج الممارسة المفرطة، يستخدم طراز ممبم الحرمان من النوم الجزئي كعامل عقلية مع مراعاة الآلية المرضية المعقدة من التعب المركزي.

نموذج التقييم، نستخدم الاختبارات OFT و EPM لتحديد المزاج القلق والنشاط التطوعي. أجرى الاختبار دا لقياس أداء العضلات المحيطية. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نأخذ الدماغ في الفئران واكتشاف الدوبامين (DA)/السيروتونين (5-HT) المحتوى في كلا هيبوثالاموسيس مراعاة الاختلافات العصبي المركزي.

البروتوكول الواردة أدناه صمم للنموذج المركزي التعب الناجم عن النشاط البدني المتكرر وقلة النوم، محاكاة حالة شائعة في حياة الإنسان. ومع ذلك، بضبط المدة النموذجي، استخدامها في العديد من المجالات الأخرى، مثل في دراسات المراقبة والإجهاد النوم. في المستقبل للبحث، ونأمل أن هذا النموذج سوف تساعد في اكتشاف المزيد من التغييرات في الجهاز العصبي المركزي وعلاقتهم مع النظام الطرفية، وتكشف عن الآلية المرضية من التعب المركزي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم الإبقاء على جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية في التشريع الصيني على استخدام الأخلاقية، ورعاية الحيوانات المختبرية.

1-النمذجة قبل إعداد

1. إعداد مختبر
   1. تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل التجربة.
   2. التحكم في درجة حرارة المختبر 25 ± 3 درجة مئوية، والرطوبة النسبية حوالي 30%.
   3. قم بتشغيل مختبر الخفيفة الساعة 06:00 وإيقاف الساعة 18:00 إلى إنشاء دائرة ضوء/الظلام ح 12/12 ساعة.
2. منصة متعددة مربع البناء
   1. بناء دبابة بلاستيك معتم دون غطاء من 110 × 60 × 40 سم³.
   2. إصلاح خمسة عشر منصات دائرية (ح = 8 سم، د = 6.5 سم) في الجزء السفلي من الخزان، توزيع أي منظم في ثلاثة صفوف وأعمدة خمسة. ترك مساحة كافية بين كل منصة، تقريبا 10 سم بين الأعمدة و 13 سم بين الصفوف.
   3. تعيين منفذ للماء على الجانب الوحشي من الدبابة وتثبيت صنبور.
   4. جعل غطاء معاوضة سلك الحديد للخزان مع مربع أغذية معلقة على ذلك.
3. التجميع والجرذان السكن
   ملاحظة: يتم استخدام ويستار الذكور من 8 أسابيع من العمر، تزن حوالي 200-210 غ، في التجربة. تعيش الفئران في مجموعات خلال عملية النمذجة.
   1. عدد جذور ذيل الفئران بقلم ماركر.
   2. وزن الفئران واستبعاد الغاية الخفيفة أو الثقيلة منها، وتقسيم بقية عشوائياً إلى مجموعات النموذج وعنصر التحكم.
   3. وضع الفئران برفق في أقفاص نظيفة والسماح لها بتأقلم إلى المختبر لمدة 3 أيام على الأقل. توفير كمية كافية من المياه والإمدادات الغذائية.

2-النمذجة مع ممبم

ملاحظة: العملية تبدأ الساعة 18:00 وتنتهي الساعة 08:00 في اليوم التالي، لما مجموعة 14 ساعة يوميا، أكثر من 21 يوما. لتجنب عوامل التدخل، نفس الشخص المطلوب إجراء التجربة كاملة، بينما يرتدي معطف مختبر نفس. 10 ويستار المستخدمة في التجربة.

1. ضع الدبابة على سطح مستو، مثلاً، والكلمة. ثم ملء الخزان بحوالي 7 سم ماء الدافئ (25 ± 3 درجة مئوية)، حوالي 1 سم تحت منصة مسطحة.
2. إعداد ما يكفي من الطعام والشراب لجميع الفئران في الخزان لمدة يوم واحد. موضع مربع الغذاء العلف والماء وتعلقها على الغلاف.
   ملاحظة: تعلم بعض الفئران الذكية للراحة على مربع الأغذية. إذا كان الأمر كذلك، تدفع لهم مرة أخرى إلى الخزان.
3. تأخذ على الفئران المجموعة النموذجية للخروج من القفص والاستيلاء عليها من ذيله ووضعها برفق في الخزان. إطلاق جميع الفئران في المياه بدلاً من الأنظمة الأساسية لتحفيز خوفهم المياه. تأكد من أن كل الفئران يحصل على منصة للوقوف على، بينما تظل الفئران من السيطرة على المجموعة في اقفاصها الأصلية مع كافية من الغذاء والماء.
4. تغطية الخزان. رصد على الفئران لتجنب إصابة عرضية. إذا فأر يبقى في المياه لأكثر من 1 ح دون التسلق إلى ساحة، يستلم من الخزان وإزالته من الاختبار.
5. بعد ح 14، اتخاذ نموذج الفئران من الخزان وتجفيف الشعر بمجفف. إعادة وضع علامة ذيول الجرذان إذا يتلاشى. تعود الفئران إلى اقفاصها الأصلية وتزويدهم بالماء والغذاء الكافي.
6. مسح كل ركن من الدبابة. الارتقاء بجانب واحد من الدبابات وفتح صنبور أووتفلوو مياه الصرف الصحي.
7. تعقيم الخزان مع رذاذ إيثانول 75% وتعريضها لضوء الأشعة فوق البنفسجية.

3-نموذج التقييم: اختبار سلوكية

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الاختبارات في مختبر السلوكية. لا يسمح الضوضاء والضوء إضافية أثناء الاختبار لتجنب الاضطرابات. إذا كان ذلك ممكناً، استخدم نفس الشخص أو الأشخاص بإجراء كل اختبار. معطف داكن وقفازات مطلوبة من أجل الاعتراف بمقياس الرمادية في معالجة الصور. أداء مكتب التجارة المشروعة أولاً أنها أقل تأثير على سلوك الفئران.

1. الغفور
   1. فحص المسجل أكثر من "فتح مربع الحقل" للتأكد من أنه متصل بشكل صحيح على محطة العمل ويغطي كل زاوية من المربع. ضبط الإضاءة للقضاء على الظلال في المربع.
   2. نقل الفئران في المختبر السلوكية في اقفاصها الأصلية. تسمح لهم بتأقلم على الأقل 1 ساعة قبل الاختبار.
   3. تنظيف وتعقيم المربع مع الإيثانول 75% التأكد من أنه لا يوجد براز أو رائحة غادر من التجربة السابقة.
   4. إزالة فأر من القفص بظهرها، ووضعها برفق في المنطقة الوسطى من المربع. الأسلحة تراجع بسرعة من مربع حتى لا يؤدي إلى وقف إطلاق النار.
   5. إدخال رقم للفئران وبدء التسجيل. عد وسجل تواتر الأنشطة الرأسي للفئران، بما في ذلك تربية والتسلق.
   6. بعد 5 دقائق، إيقاف التسجيل وأخذ الفأر من خارج منطقة الجزاء، وإعادته إلى القفص.
   7. كرر الخطوات 3.1.3-3.1.6 حتى الانتهاء من جميع الفئران الاختبار.
2. EPM
   1. الخطوات الاختيار المسبق والتأقلم أما بالنسبة لمكتب التجارة المشروعة (الخطوات 3.1.1-3.1.2).
   2. إزالة فأر من القفص بظهرها، ووضعها برفق على الجزء مفرق من اثنين من الأسلحة. الأرض الفئران نحو الذراع اليسرى مفتوحة ويغادر بسرعة حتى لا تتعرض لوقف إطلاق النار.
   3. إدخال رقم للفئران وبدء التسجيل. عد وسجل تواتر مداخل الذراع مختلفة. إذا تخلت الفئران خارج المتاهة في الاختبار، استلامه وإرساله مرة أخرى إلى المتاهة. تسجيل معلومات مفصلة لتحليل البيانات.
   4. بعد 5 دقائق، إيقاف تسجيل وتأخذ الفئران خارجاً، وإعادته إلى القفص.
   5. إزالة البراز ومسح المتاهة مع الإيثانول 75% للقضاء على رائحة فأر السابقة.
   6. كرر الخطوات 3.2.2-3.2.5 حتى الانتهاء من جميع الفئران الاختبار.
3. اختبار ES
   1. ملء خزان السباحة (70 × 30 × 110 سم³) مع 80 سم الماء الدافئ (25 ± 3 درجة مئوية).
      ملاحظة: إذا لم يكن هناك الحرارة في الدبابة، درجة حرارة الماء يجب تعيين حوالي 37 درجة مئوية، ومماثلة لدرجة حرارة الجسم في الفئران. إذا لم يكن الأمر كذلك، ضبطه على درجة حرارة الغرفة للحفاظ على ثابت.
   2. جعل حمولة لكل الفئران مع دبوس باقات وربط ذلك بلطف على جذوره الذيل. الحمولة تزن 10% الوزن في الفئران.
   3. الاستيلاء على فأر من ذيله ورميها في خزان السباحة. إذا التلملم الفئران أو التشبث بالجدار، تفصل لهم وتدفع لهم العودة إلى المياه.
   4. بدء التوقيت الذي يتجلى في هذه اللحظة عندما يتم وضع الفئران في المياه وتوقيت التوقف عند ذلك استنفاد، كالفشل في النضال خارج الماء بالفم والأنف تحت الماء لأكثر من 10 ق.
      ملاحظة: في بعض الأحيان، الانهاك والغرق يحدث فجأة. من المؤكد أن يكون المجربون كافية لتسجيل وحفظ الحيوان في نفس الوقت.
   5. إزالة الفئران استنفدت من المياه دون مقاطعة الآخرين. على الشعر الجاف وإعادة وضع علامة أعدادهم وإعادتهم إلى القفص.
   6. تغيير المياه في الخزان بعد انتهاء مجموعة واحدة. بعد الانتهاء من جميع الفئران، إفراغ خزان السباحة، وتنظيف وتعقيم أنه مع الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية.

4-نموذج التقييم: الكشف العصبي المركزي

1. تخدير الفئران بحقن داخل البريتوني من 10% كلورال هيدرات (3 مل/كغ) حتى وفاقد الوعي.
2. قطع رأس الفئران.
3. إجراء شق طولي على طول الخط بعد الآنسي وفتح الجمجمة لكلا الجانبين وكشف الدماغ. اقلب في الجمجمة وإزالة الدماغ، ووضع الدماغ على وجود حقيبة الجليد.
4. فصل وإزالة ما تحت المهاد، وهي منطقة على شكل الماس في الجزء المركزي من قاعدة الدماغ له حدود واضحة مع الأنسجة المحيطة. وضعه في أنبوب عقيم وتجميدها بالنيتروجين السائل. تخزين جميع العينات في ثلاجة-80 درجة مئوية.
5. الكشف عن مضمون دا و 5-HT في تحت المهاد باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك])⁸.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يصف لنا نموذج الفئران من التعب المركزي باستخدام ممبم. وتنقسم ويستار 24 عشوائياً إلى مجموعة المراقبة والمجموعة النموذجية، مع 12 من الفئران في كل مجموعة. تم تصميم الجهاز النموذجي كخزان لمياه مع المنصات الضيقة في الجزء السفلي (الشكل 1). نموذج الفئران الوقوف عل?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ممبم هي مصممة أصلاً للنوم الحرمان⁹. الفئران هي المطلقة في خزان لمياه مع المنصات الثابتة في الجزء السفلي. بدافع الخوف الغريزي من المياه، الفئران يظل قائما على المنصات والنوم لا يحدث. وتبين الدراسة أن ساعات مختلفة من الحرمان من النوم يؤدي إلى مختلف التغيرات في سلوك الفئران والم?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
multiple platform sleep deprivation water tank	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		110cm x 60cm x 40cm. There are 15 plastic small platforms at the bottom. The small platform is 6.5cm in diameter and 8cm high
Wistar rats	Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Company	license number SYXK (Beijing) 2016-0011	Use 32 Wistar healthy male rats ,8 week old (200-210 g)
Agilent 1100LC high performance liquid chromatograph	Agilent	G1379A, G1311A, G1313A , G1316A	G1379A, G1311A type chromatographic pump, G1313A automatic sampler, G1316A column temperature box
DECADE II SDC electrochemical detector	Dutch ANTEC company		glassy carbon electrode, Ag/AgCl reference electrode, workstations (Clarity CHS)
Biofuge Stratos high-speed refrigeration centrifuge	HERAEUS
VCX130 ultrasonic fracturing instrument	SONICS
ACS-ZEAS electronic scale	Phos technology development, Beijing.		The weight of the weighing rats can be accurate to 0.1g.
Open Field Box	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		wooden box of open field  100 cm by 100 cm x 40 cm, inside wall and bottom as the gray.The bottom is divided into 25 equal area squares, each of which is 20cm x 20cm, and the 16 grids along the outer wall are the external ones, and the other 9 grids are central.The camera is mounted above the median.
Elevated Plus-maze	Beijing zhongshi dechuang technology development co. LTD.		The open arms and close  arms of the cross are composed of 30cm x 5cm x 15cm, and the central area is 5cm x 5cm, with a camera mounted above the center and 45cm high.
rat swimming bucket.	Zhenhua biological instrument equipment co., LTD. Anhui,China.		The volume of plastic drum is 70cm x 30cm x 110cm, which is used for swimming in rats.
Thermometer	Shiya instrument co., LTD., changzhou,China.		Control water temperature
Small water pump	Xincheng technology co., LTD., chengdu,China.		Used for water tank and swimming behavior.
Ethovition3.0 behavioral software.	Nuldus,Netherlands		Measurement analysis of rat behavior videos.