سقالة كهربائياً موصلة تعدل وتسليم الخلايا الجذعية

Summary

يصف هذا البروتوكول تلفيق نظام الثقافة الخلية للسماح بزرع الخلايا الجذعية في سقالة البوليمرات موصلة للتحفيز الكهربائي في المختبر وزرع اللاحقة في فيفو من السقالة الخلايا الجذعية المصنف باستخدام تقنية كسبها.

Abstract

العلاج بالخلايا الجذعية وبرز بالسكتة دماغية مثيرة العلاجية، ولكن أسلوب التسليم الأمثل لا يزال غير واضح. بينما استخدمت تقنية microinjection لعقود تسليم الخلايا الجذعية في نماذج السكتة الدماغية، وهذا الأسلوب يحد الافتقار إلى القدرة على التعامل مع الخلايا الجذعية قبل الحقن. تفاصيل هذه الورقة طريقة استخدام سقالة البوليمرات موصلة كهربائياً لإيصال الخلايا الجذعية. التحفيز الكهربائي للخلايا الجذعية باستخدام سقالة البوليمرات موصلة يغير الجينات للخلايا الجذعية تشارك في بقاء الخلية والاستجابة الالتهابية، وإعادة عرض متشابك. بعد preconditioning الكهربائية، يتم زرع الخلايا الجذعية على السقالة إينتراكرانيالي في نموذج الفئران انسداد شريان دماغي الأوسط البعيدة. توضح هذه المقالة تقنية قوية للتلاعب بالخلايا الجذعية عبر سقالة البوليمرات موصلة هذا البروتوكول وإنشاء أداة جديدة لزيادة تطوير العلاج القائم على الخلايا الجذعية.

Introduction

السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي الثاني للوفاة في العالم، والسبب الخامس للوفيات في الولايات المتحدة. على الرغم من هذه معدلات الوفيات المرتفعة، تظل علاجات للسكتة الدماغية الاسترداد حاليا تحديا مع لا خيارات قابلة للتطبيق الطبية المتاحة حاليا¹. يوجد حاليا حوالي 300 من التجارب السريرية التي تتعامل مع السكتات الدماغية، منها 40 فقط استخدام الخلايا الجذعية. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا الجذعية العلاج تأثيراً مفيداً على السكتة الدماغية إصلاح^2،3. وقد أظهرت Paracrine عوامل مثل عامل نيوروتروفيك المستمدة من المخ (BDNF) وثرومبوسبوندين-1 (ثبس-1) أطلق سراحهم من الخلايا المزروعة السلف العصبية البشرية (هنبكس) تحسين استرداد الفنية من خلال الآليات المرتبطة بزيادة في المشبك تشكيل والأوعية والتفريع الجذعية والإسقاطات محواري الجديدة، فضلا عن تحوير المناعي^4،،من⁵⁶. ومع ذلك، أساليب التسليم الأمثل للخلايا الجذعية لا تزال بعيدة المنال.

إنجاز نجاح الخلايا الجذعية للدماغ لا يزال يمثل تحديا. حاليا، قد أدخلت المائية القابلة للحقن ونظم السقالات البوليمرية لتسليم الخلايا الجذعية. هذه طرق التسليم حماية الخلايا الجذعية من خلال زرع، فضلا عن توفر الحماية من بيئة ما بعد السكتة الدماغية قاسية بما في ذلك استجابة للمضيف التحريضية وظروف التاكسج^7،،من^{89 , 10}-ومع ذلك، المواد الأكثر استخداماً خاملة، مما يحد من استخدام التعديل المستمر (أي, التحفيز الكهربائي) من الخلايا¹¹. التحفيز الكهربائي هو أحد الرموز التي يؤثر التمايز، وأيون قناة الكثافة، وثمرة نورت من الخلايا الجذعية البالغة¹². مقارنة بالبوليمرات الخاملة، ويمكن أن تحمل البوليمرات الموصلة السماح الحالي للتحفيز الكهربائي والتلاعب بالخلايا الجذعية². ومع ذلك، لا تزال غير كاملة هو استكشاف الآلية الدقيقة التي ينظم التحفيز الكهربائي نيوروتروفيك عامل الإصدار (أي، بدنف وثبس-1).

في هذا البروتوكول، يصف لنا الخطوات اللازمة لبناء نظام ثقافة خلية يتكون من السقالة البوليمرات الموصلة، بوليبيرولي (بي)، الذي يسمح للتحفيز الكهربائي في المختبر . بسبب الطريقة التي مختلق في منظومة الثقافة الخلية، غرس اللاحقة من السقالة المصنف الخلايا الجذعية على القشرة المحيطة--احتشاء الممكنة. لهذا النظام، ونحن كهربائياً مسبق الخلايا الجذعية على السقالة لفترة زمنية قصيرة قبل غرس. في أعقاب التحفيز الكهربائي، هو نجاح مزروع سقالة البوليمرات الموصلة تحمل الخلايا إينتراكرانيالي باستخدام أسلوب مينيملي.

Protocol

وقد أقر جميع الخلايا الجذعية والحيوان إجراءات لجنة "الرقابة أبحاث الخلايا الجذعية" في جامعة ستانفورد و "الفريق" جامعة ستانفورد الإداري في "مختبر رعاية الحيوان" (سكرو-616 وأبلاك-31909).

1-النقش من الزجاج إيتو

1. تحضير أكسيد إنديوم قصدير (إيتو)-الشريحة الزجاجية المغطاة بوضع عامل إخفاء الجانب موصلة من الزجاج.
   ملاحظة: يمكن استخدام الأشرطة التجارية الأكثر شفافية كعامل تقنيع.
   1. إزالة قناع الزائدة باستخدام شفرة، تاركاً فقط بالشكل المرغوب من التصميم النهائي إيتو غطت على الزجاج.
2. الجمع بين 5% (v/v) من حمض النتريك و 45% (v/v) من HCl في كوب زجاج داخل غطاء دخان لإعداد الحل النقش.
   1. استخدم لوحة الساخن ومقياس حرارة لضمان المحافظة على درجة حرارة النقش الحل عند 70 درجة مئوية.
3. بمجرد حل الحفر تصل إلى 70 درجة مئوية، ضع الشريحة الزجاجية إيتو ملثمين في المحلول لمدة دقيقتين لإزالة طبقة إيتو الزائدة.
   ملاحظة: إخفاء الشريط يحمي طبقة إيتو من التعرض لحمض الحل.
4. إزالة الشريحة من الحل وشطفه مع منزوع (دي) ح₂o.
5. بعناية إزالة قناع وقياس مقاومة استخدام متعدد للتأكد من أن إيتو المتبقية سليمة. قراءات منطقة محفوراً المرجوة ينبغي أن تكون Ω حوالي 0.

2-إعداد الحل بيرول

1. في زجاجة زجاج 1000 مل، حل 70 غ من الصوديوم دوديسيلبينزينيسولفونيت (نادبس) في 600 مل ح دي₂o.
2. حالما يتم حل في نادبس، إضافة 14 مل من بيرول 0.2 M و 386 مل ح دي₂س إلى الحل.
3. تغطية الحل مع رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 درجات مئوية.

3-الطلي من بوليبيرولي على الزجاج إيتو

1. الحارة الحل بيرول إلى درجة حرارة الغرفة حتى نادبس هو ريديسولفيد تماما.
   ملاحظة: هذا يستغرق حوالي 15 إلى 20 دقيقة.
2. صب 25 مل الحل بيرول في كوب.
3. الاتصال الزجاج إيتو محفوراً متعدد وغمر الشريحة إلى الحل بيرول.
   1. التأكد من أن تواجه الجانب مع 0 Ω المقاومة تجاه مسرى إشارة شبكة البلاتين.
4. تطبيق تيار كهربائي الشروع في الطلي من بي على سطح إيتو استخدام متعدد (الحالية التي تسيطر على 3 mA/سم² لمدة 4 ساعات).
5. إزالة الزجاج إيتو من متعدد ويغسل مطلي-بي في دي ح₂س لإزالة السطح المتبقية.
6. فصل لوحة بي مطلي من الزجاج إيتو باستخدام شفرة حلاقة بلطف.
   1. تخزين لوحة بي في درجة حرارة الغرفة.

4-إعداد بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)

1. باستخدام ملعقة وطبق تزن، مزيج ز 18 عامل أساسي مع ز 2 عامل التجفيف وصب الخليط في قوالب الزجاج اثنين 10 × 8 سم.
2. إزالة الفقاعات من قوالب استخدام فراغ غرفة لمدة 15-20 دقيقة.
3. مكان القوالب في فرن 70 درجة مئوية ح 3.
4. عندما يبرد، استخدام ملعقة مسطحة لإزالة PDMS من القوالب.

5-تصنيع الدائرة الكهربائية التحفيز في المختبر

1. اﻷوتوكﻻف بلوحات معدنية (وكسل، 2.5 سم × 12.5 سم) وتدفق صمامات على 120 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
2. استخدام شريحة دائرة كقالب، قطع قطعتين من PDMS.
   ملاحظة: قطعة واحدة من PDMS بمثابة محيط الدائرة الخلية مع القواطع المربعات المجاورة اثنين من داخل قاعة الخلية. PDMS قطعة أخرى من مخطط تفصيلي محيط الدائرة.
   1. قطع الداخل الدائرة الخلية حيث تكون مربعة على شكل ويطابق الشكل دائرة الخلية. ضمان مستطيلة الشكل العام لكل قطعة من PDMS ويتطابق مع الشريحة الدائرة.
3. طبقة المواد كالآتي من الأسفل إلى الأعلى: (1) معدنية لوحة، (2) PDMS (بدون القواطع)، لوحة (3) بي (عمودي PDMS)، (4) PDMS (مع القواطع) والدائرة (5) الخلية.
4. المشبك الجهاز معا فور محاذاته تماما.
5. قص قطعتين 60 سم من الأسلاك المعدنية واستخدام اللصق الفضي لإرفاق سلك واحد لكل نهاية من لوحة بي أن يبرز من خارج الدائرة. التأكد من أن الأسلاك طويلة بما يكفي تمتد من الجهاز إلى خارج حاضنة.
6. متى يشفي لصق الفضة، تعزز وختم الاتصال سلك مع الإيبوكسي.
   1. سجل المقاومة استخدام متعدد للتأكد من أن الحقل التطبيقي هو نفسه في كل دائرة.
   2. لغرس، إزالة الأسلاك؛ أونكلامب الدوائر الخلية و PDMS ومن ثم لهم منفصلة من السقالة موصلة. بعد السقالات مزروع هو حوالي 1 مم × 3 مم × 0.25 مم.

6-طلاء "الخلايا السلف" البشرية العصبية (هنبكس) في بي

1. تعقيم الدوائر المجتمعة تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعتين.
   1. بعد 1 ساعة، تدوير تجميع الدوائر 90°.
2. بعد التعقيم، معطف سطح بي في الجزء السفلي من الدائرة مع 800 ميليلتر من الركازة طلاء والسماح للركيزة ترسيخ على لوحة بي في حاضنة في 37 درجة مئوية في 5% CO₂ ح 1.
3. بعد 1 ساعة، إزالة المادة طافية من الدوائر وشطف بلطف مع مل 1 ملغ + دببس + Ca في البئر.
   ملاحظة: تجنب غسل سطح بي قوة كما سيؤدي هذا مفرزة الركازة طلاء.
4. استخدام وسائط خلية جديدة، ننأى ميكانيكيا بالخلايا المزروعة للاستخدام مع الدوائر من صفيحة زراعة الأنسجة مع بيبيتينج لطيف.
   ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا روافد 90-100% عند الانفصال.
5. جمع الكريات هنبك استخدام الطرد المركزي في 8000 x ز لمدة 5 دقائق.
6. استخدام هيموسيتوميتير، عد وريسوسبيند الخلايا في وحدة تخزين من 100,000 الخلايا/سم².
7. لوحة 100,000 الخلايا في كل دائرة جيدا (100,000 الخلايا/سم² في 1 مل من وسائل الإعلام).
8. عودة الدوائر إلى حاضنة في 37 درجة مئوية في 5% CO_2-

7-الكهربائية تحفيز هنبكس

1. يوم واحد بعد زرع الخلايا في الدوائر، واستخدام مولد الموجي لتطبيق التحفيز الكهربائي للخلايا.
2. قبل التحفيز، قم بإزالة الوسائط القديمة من كل دائرة أيضا، وتجديد مع 800 ميليلتر من وسائط جديدة.
3. بعد أن يتم تغيير وسائط الإعلام، مكان الدوائر مرة أخرى إلى الحاضنة، وتمديد الأسلاك خارج الحاضنة، وإرفاقها بمولد الموجي
4. تطبيق التحفيز على الخلايا مع إشارة موجه مربعة في mV ±400 مع 100 هرتز ح 1.
5. بعد التحفيز، وإزالة الأسلاك واحتضان الدوائر ليوم آخر في حاضنة في 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
6. إجراء التحليل البيولوجي اللاحقة بما في ذلك بقاء الخلية والكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرة-PCR) يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.

8- في فيفو غرس بي

1. تنفيذ نماذج السكتة الدماغية انسداد الشريان الدماغي الأوسط البعيدة (dMCA) على خلية T-قصور الكبار عارية ذكور الفئران (± 230 المعاهد الوطنية للصحة-دعايتهم ز 30) كما هو موضح سابقا². تنفيذ غرس أسبوع بوست-dMCA الانسداد.
2. يوم واحد قبل الجراحة، إعطاء الأمبيسلّين (1 ملغ/مل) على الفئران في مياههم القفص.
3. تخدير الفئران في الدائرة التعريفي استخدام 0.5-3% ملغ/كغ من isoflurane تدار عن طريق الاستنشاق.
4. تأكيد أنيسثيتيزيشن الفئران بالافتقار إلى أخمص القدمين قرصه استجابة منعكس.
   1. وبينما الحيوان تحت التخدير، مواصلة رصد لها غشاء لون ونمط التنفس ودرجة حرارة المستقيم كل 15 دقيقة.
5. حالما يتم التأكد من أنيسثيتيزيشن تطبيق الدموع الاصطناعية في عيون الفئران لمنع جفاف.
6. ضمان المحافظة على الأسلوب العقيم خلال هذا الإجراء باستخدام قفازات معقمة وثني جراحية معقمة¹³. تبقى الأدوات الجراحية المعقمة داخل حقل عقيمة.
7. بينما الفأر تحت التخدير، حفر كرانيكتومي فوق قشرة الأيسر. فتح في بلده دوراً.
   1. إزالة الأم الجافية من الدماغ باستخدام إبرة رقيقة الجزئي جراحية.
8. زرع السقالات موصلة من النظام في المختبر على قشرة الفئران.
   ملاحظة: لتجاربنا، نحن مزروع السقالات في المختبر يوم 3 بعد الطلاء هنبك.
   1. مكان الزرع أساسا على قشرة penumbral الآنسي للآفة السكتة الدماغية.
9. بعد أن يتم وضع السقالة، ضع سورجيسيل على عملية الزرع لمنع الحركة مع إغلاق الجلد.
10. خياطة الجرح أغلقت وتحت الجلد حقن الفئران البوبرينورفين ريال في جرعة من 1 مغ/كغ لإدارة الألم المرتبطة بجراحه ستيريوتاكسيك وانسداد dMCA.
11. وضع الفئران في قفص انتعاش كما أنه يستعيد وعيه.
    1. لا تترك الحيوان غير المراقب في حين أنها فاقد الوعي.
    2. لا تضع هذا الحيوان مع الآخرين حتى أنه اكتسب كامل وعيه.
12. مراقبة الحيوانات يوميا لعلامات ألم بما في ذلك فقدان وزن الجسم، كمية نقص الغذاء والمياه، معطف الاستمالة/غير مهذب انخفاض، انخفضت زيادة النشاط العفوي، الموقف الشاذ، التخييم الجفاف/الجلد، العيون الغارقة، الاختباء، تشويه الذات، التنفس السريع، فتح الفم في التنفس، والوخز، ويرتجف، والزلزال وحناجرهم.
    1. مراقبة الحيوانات يوميا حتى أنه يبدو أن هذه هي الأكل والشرب، والاستمالة، واكتساب الوزن؛ واسبوعيا ثم بعد زيادة الوزن.
13. يوثانيزيشن المبكر عن طريق استنشاق أول أكسيد الكربون₂ وتأكيد ثانوية من يوثانيزيشن (بما يكفل عدم أحياء الحيوان جراء استنشاقهم₂ CO وظيفة لإمدادات الأوكسجين العادي) سوف يحدث لأي الحيوان الذي يظهر بأن عدم تناول الطعام، الشرب و زيادة الوزن بعد العملية الجراحية الأولى؛ يظهر في الألم؛ أو يبدو غير قادر على إكمال الاختبارات السلوكية بسبب أكبر من المتوقع العجز القشرة الحركية.

النتائج

التخطيطي هو مبين في الشكل 1 يمثل سير العمل الإجمالي للتحفيز الكهربائي هنبكس وتطبيقاتها المحتملة من المتلقين للمعلومات. قيد الحالية في العلاج بالخلايا الجذعية أن الخلايا الجذعية معرضون لبيئة ما بعد زرع قاسية بما في ذلك الالتهاب والشروط السكتة. تحد هذه ال?...

Discussion

تزايد الأدلة أظهرت الوعد بالخلايا الجذعية كعلاج السكتة دماغية رواية. وادي هذا الوعد جهدا كبيرا للنهوض بعلاجات الخلايا الجذعية للسرير مع التجارب السريرية الجارية أو المستكملة على الأقل 40. أمراض السكتة الدماغية يقدم اضطراب عصبي فريد الذي يفسح المجال للعلاج بالخلايا الجذعية لأنه بعد إهانة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-Basic	Invitrogen	CTP0261	20 ng/mL for working media
Matrigel	Corning	cb40234a	1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL)	EMD Millipore	LIF1010	10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg	Fisherbrand	NC0162601
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical	Fisherbrand	SA95
ITO Glass	Delta Technologies	CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate	Sigma	289957-1KG
Pyrrole	Sigma	131709-500ML	Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers	Thermo Sci Nuc	125658	Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1"	McMaster-Carr	1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G	Electron Microscopy Sciences	1264214	Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red	Genesse	25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit	Aruna Biomedical	ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit	Aruna Biomedical	hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD	McMaster-Carr	5330K22
Multimeter	Keysight	E3641A
Wavefoam generator	Keysight	33210A-10MHz
Pt meshes	Sigma-Aldrich	298107-425MG	Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher Scientific	L3224
BDNF	Thermo Fisher Scientific	Hs02718934_s1
THBS1	Thermo Fisher Scientific	Hs00962908_m1
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106
QIAshredder (250)	Qiagen	79656
RNase-Free DNase Set (50)	QIAGEN	79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns	BIORAD	1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats	NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture	eSutures.com	683G
Isoflurane	Henry Schein	29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat	Ethicon	1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat	Stoelting	51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves	Fisherbrand	19-063-130
Sterile Drape	Medline	DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades	Fisherbrand	53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300	Fisherbrand	17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4484642
Frazier Micro Dissecting Hook	Harvard Apparatus	52-2706