توليف للأنابيب النانوية الكربونية متعددة الجدران تعديل مع جسيمات فضة نانوية وتقييم الخصائص السامة للخلايا والأنشطة المضادة للبكتيريا

Summary

في هذه الدراسة، تم تصنيعه المواد النانوية الميكروبات أكسدة الحمضية للأنابيب النانوية الكربونية مولتيواليد وترسب جسيمات فضة نانوية التخفيض اللاحقة. تم إجراء الاختبارات الميكروبات النشاط وسيتوتوكسيسيتي مع المواد متناهية الصغر كإعداد.

Abstract

في هذه الدراسة، يعاملون الأنابيب النانوية الكربونية متعددة الجدران (MWCNTs) مع حل مائي من حامض الكبريتيك تشكيل مجموعة وظيفية المستندة إلى الأوكسجين. موكنتس الفضي أعدها ترسب الفضة محلول مائي من إنيو₃ في موكنتس المؤكسدة من التخفيض. نظراً للون فريد تجويدها، لم يكن ممكناً تطبيقها إلى الحد الأدنى من تركيز المثبطة أو سمية المتقدرية فحوصات لتقييم الخصائص السمية والمضادة للبكتيريا، نظراً لأنها سوف تتداخل مع فحوصات. وقيست بمنطقة تثبيط وتركيز جراثيم الحد الأدنى ل Ag-موكنتس ولايف/الميت وفحوصات تريبان الأزرق المستخدمة لقياس الخصائص السمية والمضادة للبكتيريا دون أن تتدخل مع لون تجويدها.

Introduction

الهدف النهائي من هذه الدراسة هو جعل المواد النانوية المضادة للبكتيريا الصديقة للبيئة التي يمكن أن تمنع نمو البكتيريا هذا النموذج الأغشية الحيوية. هذه المواد المضادة للبكتيريا النانوية لديها القدرة على التغلب على مشاكل المقاومة السمية والمضادات الحيوية المستخدمة عادة المواد الكيميائية أو المضادات الحيوية مركبات كيميائية. بيوفيلم هو رطب خارج الخلية البوليمرية مادة (EPS) التي تتكون من السكريات والبروتينات والأحماض النووية والدهون^1،2. منع تسلل المؤثرات الخارجية الأغشية الحيوية ويساعد البكتيريا تنمو بقوة^3،4. الأغشية الحيوية يسبب رائحة والأمراض المعدية المزمنة^5،6. ميثيلوباكتيريوم spp.، على سبيل المثال، ينمو بالتمسك بأماكن دائماً توجد فيها مياه أو حيث من الصعب التأكد من القضاء على البكتيريا بصورة مستمرة، مثل المبادلات الحرارية لتكييف الهواء، وغرف الاستحمام، والأجهزة الطبية. هذه الأنواع من الأغشية الحيوية يسبب رائحة والأمراض المعدية المزمنة^5،6.

عادة، يتم استخدام المواد الكيميائية أو المضادات الحيوية مركبات كيميائية تمنع نمو البكتيريا التي تشكل الأغشية الحيوية. ظهور البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية، والشواغل المتعلقة بالسلامة في فيفو المواد الكيميائية تدفع الحاجة إلى تطوير مواد جديدة لمنع تكوين الأغشية الحيوية وتمنع نمو البكتيريا.

في هذه الدراسة، يتم توليفها المواد النانوية الميكروبات خالية من المقاومة للمضادات الحيوية وسمية. فضة عبارة عن مادة مضادات الميكروبات معروفة جيدا، والتطورات الأخيرة في علم وتكنولوجيا النانو قد أدت إلى نشطة للبحث في آثار جسيمات نانوية معدنية^7،8مضادات الميكروبات. وأفادت الدراسات الأخيرة أن صغر الحجم وارتفاع نسبة السطح إلى الحجم جسيمات نانوية يسفر عن زيادة نشاط البكتيريا^9،،من¹⁰¹¹.

المواد النانوية المعروضة هنا الجمع بين جسيمات فضة نانوية مع زيادة خصائص مضادة للميكروبات والأنابيب النانوية الكربونية مع نسبة العرض إلى الارتفاع عالية، مما يؤدي إلى زيادة المساحة السطحية لوحدة التخزين. مركب أنابيب نانوية الكربون نانوحبيبات الفضة ملفقة معارض كبير خصائص مضادة للميكروبات والحد الأدنى من السمية للخلايا البشرية والحيوانية. العمليات التركيبية في الدراسات السابقة استخدام عوامل خفض الخطرة مثل₄نأبه، ميثلامين، ديميثيلفورماميدي، والهيدرازين. العملية معقدة وخطيرة، وتستغرق وقتاً طويلاً. العملية التركيبية ذكرت هنا يستخدم الإيثانول كعامل تخفيض درجة كبيرة أقل خطورة.

وقيست بمنطقة تثبيط وتركيز جراثيم الدنيا (أم بي سي) Ag-موكنتس؛ يعيش الميت وفحوصات تريبان الأزرق استخدمت لقياس سمية وخصائص مضادة للجراثيم. لم تجر بسبب اللون غير عادية للأنابيب النانوية الكربونية التي ستكون قد تدخلت فحوصات تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) وفحوصات السمية الميتوكوندريا (MTT). وأخيراً، تقرر تركيز الحد الأدنى لمنع نمو ميثيلوباكتيريوم spp. دون التأثير على خلايا الثدييات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. أكسدة موكنت

1. قياس 30-50 مغ موكنت إلى قنينة 50 مل. أضف ببطء 8 مل ح₂حتى₄: HNO الحل₃ (تركيز 90 في المائة الأولى، المجلد 3:1/المجلد) ماصة مع نصائح ماصة 1 مل.
   تنبيه: يجب أن تجري هذه العملية التحضيرية في غطاء الأبخرة كيميائية.
   1. تسمح 30 دقيقة لرد فعل الطاردة للحرارة لإكمال.
2. Sonicate الحل في 60-80 درجة مئوية و 160 ث عن ح 1 حتى موكنت يستقر أسفل القنينة.
   تنبيه: منسوب المياه في سونيكاتور ينبغي أن يكون أقل من الجزء العلوي من قنينة حيث أن الماء سيدخل لا القنينة.
3. نقل الحل إلى أنبوب الطرد مركزي.
   1. مع ميكروبيبيتي، بإضافة 30 مل ماء المقطر دروبويسي إلى الحل موكنت-COOH.
      تنبيه: رد فعل الطاردة للحرارة قوي يحدث أثناء إضافة الماء المقطر. أضف ماء مقطر ببطء، وإتاحة الوقت للتبريد.
4. الطرد المركزي الحل موكنت-COOH في 12,000 س ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
   تنبيه: عندما تعمل الطرد مركزي، ضمان النابذة تظل متوازنة عن طريق وضع أنبوب مع نفس الوزن مقابل أنبوب عينة.
5. إزالة المادة طافية ماصة ونصيحة ماصة 1 مل. إضافة 5 مل إيثانول مع ماصة ونصيحة ماصة 1 مل. شطف جدران القنينة مع الإيثانول بيبيتيد إضافية. الطرد المركزي الحل في 12,000 س ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
   1. تحديد درجة الحموضة من المادة طافية مع ورقة الأس الهيدروجيني. تكرار الغسيل وسينتريفوجينج حتى يصبح الرقم الهيدروجيني طافية محايدة.
6. قم بإزالة كافة المادة طافية. أضف 1 مل ماء المقطر التعجيل وتفريق موكنت-COOH بالتساوي في الحل. فريزيدري الحل عند-60 درجة مئوية تحت الفراغ حتى الجاف.

2-الفضة نانوحبيبات ترسب على موكنتس

1. ضع 10 مغ من موكنت-COOH في أنبوب 50 مل مخروطية وتمييع مع 30 مل ماء المقطر. Sonicate الحل في 60 درجة مئوية و 160 ث عن ح 1.
2. ضع 6 مل من 0.1 إنيو ن₃ في أنبوب 50 مل مخروطية وتمييع مع 18 مل ماء المقطر. Sonicate الحل في 60 درجة مئوية و 160 ث عن ح 1.
   تنبيه: إضافة إنيو₃ ما يتناسب مع الكتلة الإجمالية موكنتس أن الكتلة الإجمالية لحج لا تتجاوز 20 في المائة.
3. إضافة الحل₃ إنيو دروبويسي لحل موكنتس مع ماصة ونصيحة ماصة 1 مل بينما سونيكاتينج الخليط في 60 درجة مئوية و 160 W. سونيكاتينج متابعة ح 1 بعد إضافة إنيو₃.
4. الطرد المركزي الحل في 12,000 س ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وإزالة المادة طافية. الطرد المركزي في الحل وإزالة المادة طافية مرتين إضافية.
5. أضف 1 مل ماء المقطر إلى خليط موكنتس Ag، وتفريق متسرعا بالتساوي في الحل. إضافة 5 مل إيثانول، والسماح برد فعل على المضي قدما في درجة حرارة الغرفة ح 1.
6. الطرد المركزي الحل في 12,000 س ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وإزالة المادة طافية.
7. تحديد درجة الحموضة من المادة طافية مع ورقة الأس الهيدروجيني. تكرار الغسيل وسينتريفوجينج حتى طاف الأس الهيدروجيني المحايدة.
8. أضف 1 مل ماء المقطر إلى موكنتس Ag، وتفريق بالتساوي في الحل. فريزيدري الحل في-70 درجة مئوية تحت الفراغ ح 24.

3-منطقة تثبيط اختبار

1. مزيج 18.12 ز لاجار R2A و 1 لتر من الماء المقطر في قارورة. تعقيم المخلوط في اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
2. السماح هلام لتبرد في درجة حرارة الغرفة. وضع 10 مل جل في أطباق بتري قبل تصلب إعداد متوسطة الصلبة.
3. المكان 100 ميليلتر من البكتيريا في المتوسط الصلبة. تنتشر البكتيريا في المتوسطة الصلبة باستخدام الناشرة.
   تنبيه: يجب أن تجري هذا الإجراء بغطاء الأبخرة كيميائية مضاءة بمصباح الكحول.
4. احتضان الأطباق عند 30 درجة مئوية ح 48.
5. ز 3.12 مزيج من مرق R2A مع 1 لتر ماء المقطر في قارورة. تعقيم المخلوط في اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
6. نقل المستعمرات نمت إلى متوسطة سائل باستخدام إبرة وحلقة واحتضان في حاضنة في 180 لفة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
7. سجل القيمة OD (الكثافة البصرية) التي كانت الأشعة فوق البنفسجية في 600 نانومتر على أساس كل ساعة لقياس النمو الجرثومي.
   ملاحظة: R2A أجار استخدمت في هذا الاختبار، بدلاً من أجار مولر هينتون القياسية، لأن R2A أجار المفضل لنمو ميثيلوباكتيريوم spp.
8. المكان 10 مل من استعداد R2A أجار في طبق بتري إعداد أجار السفلي.
   1. مزيج ز 3.12 من مرق R2A وز 8 من أجار مع 1 لتر ماء المقطر. تعقيم الخليط في اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمل 15 دقيقة 10 مكان هذا جل في أجار السفلي.
9. تحميل 50 ميليلتر من حل موكنتس Ag على قرص ورقة عقيمة مع ميكروبيبيتي.
   1. الجاف وتعقيم العينة موكنتس Ag في فراغ غرفة تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة مدة 30 دقيقة.
10. عينة مكان Ag-موكنتس في أجار.
11. احتضان لوحة أجار عند 30 درجة مئوية ح 48.
12. قياس منطقة تثبيط¹².
    ملاحظة: يتم تضمين إرشادات للبرمجيات المستخدمة في المراجع.

4-مضاد الاختبار

1. كرر الخطوات من 3.1 إلى 3.7 بإعداد ثقافة البكتيرية.
2. في التطوير التنظيمي كحد أقصى، تطعيم 100 ميليلتر من البكتيريا إلى 3 مل متوسطة السائلة الطازجة مع تلميح ماصة صغيرة ماصة و 100 ميليلتر.
3. إعداد خمسة 50 ميليلتر عينات من الحل التحكم في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل. أضف الأمر التالي إلى كل أنبوبة: 1) الميثانول؛ 2) 1000 ميكروغرام/مل موكنت-COOH؛ 3) 50 ميكروغرام/مل Ag-موكنتس؛ 4) Ag ميكروغرام/مل 40-موموكنتس؛ 5) Ag ميكروغرام/مل 30-موكنتس.
4. احتضان في 180 لفة في الدقيقة و 30 درجة مئوية حتى عنصر التحكم نشطاً بشكل أقصى كما يحددها كانت الأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح أعلاه.
5. قياس قيمة التطوير التنظيمي لكل عينة وحساب تركيز هيئة التصنيع العسكري. قيمة OD ارتباطاً مباشرا بعدد الخلايا البكتيرية في المرق عينة.
6. انتشار البكتيريا المستزرعة على وسيلة متينة مع الناشرة.
7. احتضان الطبق عند 30 درجة مئوية ح 48.
8. عد المستعمرات البكتيرية وقيم التدبير زيمبابوي لتحديد النشاط المضاد للبكتيريا¹².
   ملاحظة: يتم تضمين إرشادات للبرمجيات المستخدمة في المراجع.

5-إمكانية الفحص

1. بعد إزالة الخلايا الثقافة من حاضنة، شفط المتوسطة ويغسل ثلاث مرات مع يغسل dropwise مل 5 من برنامج تلفزيوني.
2. إضافة 1 مل من التربسين-يدتا في برنامج تلفزيوني للخلية غسلها والشفط بعد 1 دقيقة.
   1. اضغط على اللوحة لإزالة الخلايا عالقة.
3. إضافة 5 مل دميم (المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو) ثم قم بإزالة الخلايا. الطرد المركزي هذه العينات في 200 غ س لمدة 3 دقائق وإزالة المادة طافية.
   1. أضف 1 مل دببس ومزيج.
   2. حساب عدد الخلايا في 10 ميليلتر من الحل مع جهاز عد الخلايا تلقائية.
      ملاحظة: يتم تضمين إرشادات لالة عد الخلايا المستخدمة في المراجع¹³.
4. مكان 1 × 10⁵ من الخلايا AML12 كل بئر في صفيحة ستة-كذلك يتضمن الحل دميم. المتوسط تحتوي على مصل بقرى الجنين 10% (v/v)، والمضادات الحيوية العقيمة 1%.
5. احتضان لوحة ح 8-12 في 37 درجة مئوية في بيئة هواء 95%₂CO 5%.
6. شفط المادة طافية من الآبار مع المضخة.
   1. قم بإضافة كل عينة تتألف من عنصر التحكم والمتحف-[دمس] (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) 30-40 ميكروغرام/مل موكنت Ag إلى 1 مل دميم.
   2. احتضان عند 37 درجة مئوية في بيئة جوية 95%₂CO 5% ح 8.
7. إزالة عينات طافية ويغسل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
8. أضف 1 مل من استعداد يعيش الميت كيت (20 ميليلتر من 2 مم اتهد-1 مع 5 ميليلتر من كالسين 4 ملم صباحا في [دمس] في 10 مل من برنامج تلفزيوني) دروبويسي للخلية.
9. احتضان في room temperature لمدة 30-45 دقيقة أو 37 درجة مئوية لأدنى 10 fluorescence التدبير مع الفحص المجهري fluorescence القياسية 100 X أو 300 X.

6-تريبان الأزرق بالانزيم

1. إعداد العينات وفقا للخطوات 5.1 من خلال 5.6.2 أعلاه.
2. إزالة المادة طافية.
3. أغسل لوحة مع 1 مل 1 x DPBS وصب.
4. أضف 1 مل التربسين لوحة واحتضان لمدة 3 دقائق لفصل الخلايا من الثقافة. استخدام خلية الثقافة المتوسطة ليغسل لوحة وجمع الخلايا. مكان تجمع الخلايا في أنبوب 15 مل.
5. الطرد المركزي أنبوب 200 × g و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
6. تجاهل المادة طافية. أضف 1 مل متوسطة جديدة إلى الخلية بيليه وإعادة تفريق الخلايا.
7. إضافة 10 ميليلتر من تريبان الأزرق مع 10 ميليلتر من الخلايا المتفرقة وحساب الخلايا مع جهاز عد الخلايا تلقائية.
   ملاحظة: يتم تضمين إرشادات لالة عد الخلايا المستخدمة في المراجع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تأكيد نقل صور "المجهر الإلكتروني" (TEM) تشكيل MWCNTs Ag (الشكل 1A و 1B). وأكد على توليف ناجحة التغيير في تهمة السطحية. تم حساب حجم الجسيمات Ag أودعت في موكنتس (الشكل 1). وكان حجم الجسيمات المتوسط حوالي 3.83 شمال البحر الأبيض المتوسط. ويبين

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا، نحن تقرير طريقة بسيطة لإعداد موكنتس بجسيمات نانوية Ag المودعة. يوضح هذا نانوماتيريال المحتوية على الفضة النشاط المضاد للبكتيريا كبيرة وإمكانات الحد الأدنى لامتصاص جسيمات فضة نانوية غير المنضبط في الجسم. نظهر أن 30 ميكروغرام/مل من موكنتس Ag المركب مستوى فعال من النشاط المضاد للبكتيريا ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 N silver nitrate	SIGMA-ALDRICH	1090811000
Carbon nanotube, multi-walled	Tokyo Chemical Industry Co., LTD	308068-56-6
R2A agar	MBcell	MB-R1129
R2A broth	MBcell	MB-R2230
Methylobacterium spp.	KCTC	12618	from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
LIVE/DEAD Cell imaging Kit	ThermoFisher SCIENTIFIC	R37601
AML12			from Chungnam University, Dajeon, Korea
human PBMC	ATCC	PCS-800-011
TEM	JEOL	JEM-2100F
XRD	Rigaku	D/MAX 2500	Cu K photon source (40kV, 100mA)
JuLI Br	NanoEnTek	JULI-BRSC