JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن الحاضرين هنا تطبيق لتقنية مناعية قياسية (كفسي الملون OT--أنا انتشار) تهدف إلى رصد سرعة توليد اللمفاويات T السامة للخلايا بوساطة adjuvant (CTL) المجراة في. هذا تقدير سريع لقدرات CTL مفيد لتطوير لقاحات وقائية ضد العوامل الممرضة داخل الخلايا، فضلا عن لقاحات السرطان العلاجية.

Abstract

تقييم لقاحات الوحدة الفرعية الحديثة يكشف عن أن جيل تحييد الأجسام المضادة مهم لكنه غير كاف لتحديد adjuvant. ولذلك، هناك حاجة ماسة في المواد المساعدة مع قدرات المناعية تنشيطية كل خلطيه والخلوية التي تكون قادرة على تعزيز استجابات الخلايا الليمفاوية (CTL) T السامة للخلايا. وهكذا، رصد المؤمنين من المرشحين adjuvant حمل الصليب-فتيلة وتعزز بعد إنشاء CTL يمثل خطوة حاسمة في تطوير اللقاحات. هنا نقدم طلبا لأسلوب يستخدم سيينفيكل على حدة (OT--أنا) خلايا T لرصد الصليب-عرض نموذج مستضد ovalbumin (OVA) في فيفو حضور المرشحين adjuvant مختلفة. ويمثل هذا الأسلوب إجراء اختبار سريع لتحديد المواد المساعدة مع قدرات فتيلة عبر أفضل. انتشار CD8+ تي الخلايا هي إشارة أثمن من فتيلة الصليب وهو أيضا يعتبر ربط العرض التقديمي عبر المستحثة adjuvant. ويمكن تقييم هذه الميزة في مختلف أجهزة المناعة مثل العقد الليمفاوية والطحال. مدى جيل CTL يمكن أيضا رصدها، مما يعطي أفكاراً حول طبيعة محلية (استنزاف العقدة الليمفاوية أساسا) أو استجابة على نطاق المنظومة (العقد الليمفاوية البعيدة و/أو الطحال). يسمح هذا الأسلوب أيضا العديد من التعديلات لاختبار العقاقير التي يمكن أن تمنع محددة العرض التقديمي عبر مسارات، ويوفر أيضا إمكانية استخدامها في سلالات مختلفة من الفئران التقليدية والمعدلة وراثيا. وباختصار، ستكون مفيدة لمختبرات اللقاحات في الصناعة أو في الأوساط الأكاديمية أن تطوير أو تعديل المواد الكيميائية لبحوث اللقاحات وتطوير التطبيق الذي نحن الحاضرين هنا.

Introduction

السامة للخلايا تي اللمفاويات (CTL) حمل اللقاحات هي التدخلات العلاجية الرئيسية التي تم وضعها لمكافحة أنواع معينة من السرطان1. CTL أيضا هامة للقاحات وقائية ضد العوامل الممرضة داخل الخلية2. وعلاوة على ذلك، CTL هي إحدى آليات الدفاع المناعي القليلة نشطة وظيفيا في السكان خطر مثل الولدان3،4 منهم تعتمد أيضا على CTL لمكافحة العدوى الحياة المبكرة5. وفي هذا الصدد، اللقاحات ضد الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) التي تم تطويرها مع أخرى الأعشاب التي لا تثير استجابات CTL (الشب) أدت إلى فشل كامل اللقاح مما يؤدي إلى مضاعفات خطيرة على الإصابات في الرضع6. يمكن عكس هذه الآثار السلبية للتطعيم من CD8+ استجابة الخلية تي7. وقد أثبتنا سابقا أن السيتوكينات الرئيسي (النوع الأول من تداخلين) حظيت ببعض مشجعا من الانترفيرون الجينات (اللدغة) يضع ضروريان للردود CTL التي تولدها هذه المواد8، في جزء منه عن طريق قياس انتشار ت-أنا تي الخلايا بعد التطعيم، واستخدام هذه النتائج كما لوحظ قدر من CTL يحفز القدرات في تمديد مواعيد التطعيم9. قياس انتشار OT--أنا CD8+ تي الخلايا في ماوس المتلقية C57BL/6 نوع البرية (WT) بصبغ إستر (CFSE) سوكسينيميديل كاربوكسيفلوريسسين التخفيف تقدير قدرة adjuvant لقاح لتوليد قوي الصليب-فتيلة سيينفيكل، (الببتيد المناعية المهيمنة من أوفالبومين، البويضات). أشكال مختلفة من هذه التقنية تستخدم على نطاق واسع لتقييم انتشار OT-أنا CD8+ وخلايا CD4 بعد التمديد الثاني+ تي الخلايا. على سبيل المثال، قد استخدمت في غياب السيتوكينات مختارة (كو الفئران) أو لقياس فعالية لقاح بعد استدعاء مستضد في وزن الحيوانات. نحن وضع بروتوكول قصيرة (التجربة 4 أيام) الذي بعد نقل السلبي الملون كفسي OT-أنا CD8+ تي الخلايا، تحصين (الليبي) تحت الجلد تتكون من جرعة واحدة من 50 ميكروغرام البويضات خالية من الذيفان وتستكمل مع اختبار المواد المساعدة ويدار (الشكل 1). متابعة نتائج 48 ساعة بعد التطعيم يوفر دليلاً موثوق بها من قدرة adjuvant على توليد استجابات CTL. بهذه الاستراتيجية، من الممكن لتقييم فاعلية الاستجابة المناعية المحلية في العقدة الليمفاوية تجفيف بعد التحصين، فضلا عن مدى الاستجابة بقياس نشاط CTL في الطحال (أو العقد الليمفاوية البعيدة).

Protocol

وكانت جميع الفئران المستخدمة في هذه الدراسة من الخلفية C57BL/6. وأبقى كل الحيوانات تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض. جميع التجارب التي أجريت وفقا لمعياري لقانون حماية الحيوانات الألمانية (تيرشج بجبل. أنا S 1105؛ 25.05.1998) ووافقت عليها "اللجنة ساكسونيا السفلي" في "أخلاقيات التجارب الحيوانية" ومكتب الدولة (انخفاض ساكسونيا الدولة مكتب لحماية المستهلك وسلامة الأغذية)، تحت رقم تصريح 33.4-42502-04-13/1281 و 162280.

1. كفسي تلطيخ من OT--أنا تي الخلايا ونقل التبني

ملاحظة: OT--أنا الفئران هي ترانسجينيكالي التي تم إنشاؤها من الحيوانات التي تعبر عن مستقبلات خلية تي (تكر) مع α ثابت وسلاسل β معا تعترف الببتيد المناعية المهيمنة من البويضات، سيينفيكل10،11. كنتيجة لذلك، قد هذه الفئران عدد كبير إلى حد كبير من CD8 الخاصة سيينفيكل+ تي الخلايا (97%)12 عند مقارنة بالفئران العادية أو تلقيح البويضات (≤ 1 ٪)13.

  1. عزل CD8 يمكن تتبعها الخلايا+ ر من ت-أنا الفئران التعبير عن اليل خاصة اللمفاويات T Thy1 (Thy1.1):
    1. Euthanize OT 6-9 أسابيع من العمر--أنا الفئران باستنشاق أول أكسيد الكربون2 متبوعاً بخلع عنق الرحم14. تشريح الطحال والغدد الليمفاوية الرئيسية (أزواج الاربية وابطي وعنق الرحم فقط) بقطع الجلد مع المقص الجراحي، فصل الجلد من الجسم بالمساعدة من كماشة الجراحية والملقط ووضعها في أطباق بتري (60 × 15 ملم) التي تحتوي على كل 100 ميكرومتر المسامية مش كأس للإفراج عن طحن وخلايا الأنسجة.
    2. المحافظة على أطباق بتري (مع كوب واحد مش كل) في 3-5 مل من إكمال ربمي المتوسطة (RPMI 1640، 10% v/v FCS، 100 البنسلين U/mL، ستربتوميسين 50 ميكروغرام/مل) أبقى على الجليد.
    3. الهريس الأجهزة مع المساعدة من المكبس المحاقن أو صك مماثل عقيمة (قطع السابقة غير مطلوبة) وجمع تعليق وحيد الخلية الناتجة في أنابيب الطرد المركزي 15 مل.
    4. الطرد المركزي من تعليق خلية في 300 غرام x لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية. تغسل الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة بالطرد المركزي وفي الكريات الحمراء من الطحال بإعادة تعليق بيليه في 1 مل/الطحال من كلوريد الأمونيوم المخزن المؤقت (ACK العازلة، متوفرة تجارياً). احتضان الخلايا لمدة 1.5 دقيقة على الجليد وبعد ذلك تغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة بالطرد المركزي (كما فعلت من قبل).
    5. إعادة تعليق بيليه في الأنبوب نفسه في 1 مل من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.2) التي تحتوي على 5% الجنين البقري مصل للعزل المغناطيسي.
  2. لإجراء العزل المغناطيسي، تابع إلى الانتقاء السلبي من CD8+ تي نشر البروتوكولات15أو الخلايا باستخدام مجموعة أدوات عزل مغناطيسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. القيام بتلوين كفسي، العد الأول عدد CD8+ تي الخلايا التي تم الحصول عليها من الأراضي المحتلة--أنا الفئران باستخدام عداد الآلي خلية (عداد الجسيمات). 1-5 × 107 خلايا/مل في وحدة تخزين مل 1-5 مع 5 ميكرومتر كفسي في برنامج تلفزيوني لمدة 7 دقائق على 37 درجة مئوية، ومحمية من الضوء في أنبوب صقر 15 مل وصمة.
  4. إخماد تلطيخ كفسي بإضافة نفس الحجم (1:1) من مصل الدم البقري الجنين إلى الخلايا، واحتضان لهم لمدة دقيقة 7 إضافية عند 37 درجة مئوية محمية من الضوء. تغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني مرتين.
  5. عد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية. تعيين عدد الخلايا إلى 3-5 × 107 خلايا/مل من برنامج تلفزيوني من أجل حقن 3-5 × 106 خلايا/الماوس في 100 ميليلتر عن طريق الوريد (رابعا) عن طريق الوريد الذيل.
  6. لإجراء حقن الوريد الذيل، شل الفئران في ريسترينيرس المناسبة. الحارة بمنطقة الظهر وذيل الفئران بالحقن باستخدام مصباح الضوء الأحمر، وضعت بين 20 إلى 25 سم بعيداً عن الفئران لمدة 1-3 دقيقة للسماح للذيل المنطلق توسع الأوعية.
    ملاحظة: وهذا يساعد على سهولة كشف الوريد والإدارة تعليق خلية.
  7. ضمان (باليد توضع بين الفئران والمصباح) أنه ليس جداً الساخنة للفئران وعندما الأوردة الذيل تكون مرئية بوضوح، المضي قدما بالحقن. حقن الخلايا في الوريد الذيل الأفقي أو الظهرية استخدام حقنه 1 مل مع إبرة قياس 2516.

2-التحصين (خالية من إندو البويضات +/-Adjuvant)

  1. مكان الفئران زرعها مع OT-الخلايا (الخطوة 1، 7، الشكل 1) في تشكيل غرفة تخدير، وإدارة إيسوفلوراني في الأكسجين آلة تخدير14.
  2. عندما يكون الماوس نائماً تماما تحت التخدير، إخراجه من الدائرة ويحلق فرو الماوس على المنطقة على مدى السطحية عضلة (الأفقي أسفل الظهر) باستخدام جهاز تشذيب شعر كهربائية، من أجل القيام حقن نظيفة مع عرض جيد لمجال التطبيق.
  3. حقن 50 ميليلتر من اللقاح، الليبي في منطقة حلق باستخدام إبرة قياس 25.

3-عزل الخلايا الليمفاوية وتلطيخ لتحليل التدفق الخلوي

  1. عزل الخلايا الليمفاوية وسبلينوسيتيس
    1. Euthanize الفئران جرى تطعيمهم باستنشاق2 CO متبوعاً بخلع عنق الرحم.
    2. استخراج البعيدة وتجفيف الغدد الليمفاوية والطحال ووضعها في أطباق بتري منفصلة تحتوي على 100 ميكرومتر المسامية مش كوب للإفراج عن طحن وخلايا الأنسجة. اتبع الخطوات 1.1.2 من خلال 1.1.3.
    3. صب المادة طافية بعد الطرد المركزي، وإعادة تعليق الكريات خلية في نفس الحجم من بقايا PBS (ما يقارب 100 ميليلتر).
  2. تلوين لتحليل التدفق الخلوي
    1. في أنبوب الطرد 15 مل إعداد مزيج رئيسي الذي يحتوي على الأجسام المضادة المصبوغة في تركيزات المبينة في الجدول 1، وهكذا تسفر عن علامة x 2 تتركز ميكس المصبوغة. إعداد حجم ما يكفي من مزيج الرئيسي أن يكون 100 ميليلتر كل عينة. مزيج الخلايا ومزيج الرئيسي 1:1، واحتضان أنه عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم المصبوغة النهائية كل عينة 200 ميليلتر (100 ميليلتر من الخلية بيليه + 100 ميليلتر من جسم ميكس الرئيسي).
    2. تغسل الخلايا مرتين بالطرد المركزي كما هو موضح في 1.1.3، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني، مرتين.
    3. تعليق إعادة الخلايا الملون في 0.5-1 مل من برنامج تلفزيوني لاقتناء ونقل التعليق لأنابيب تدفق سيتوميتير. دائماً الاحتفاظ بعينات على الجليد ومحمية من الضوء.

4-التدفق الخلوي

  1. دائماً ما قبل تصفية عينات الخلايا باستخدام مرشحات 70-100 ميكرومتر.
  2. إعداد عناصر تحكم مفردة المصبوغة التعويض فلوروفوريس بالتفصيل في الجدول 1 (الخرز أو الخلايا).
    ملاحظة: ينبغي أن يؤديها في سيتوميتير أو تحليل البرمجيات17،،من1819 التعويض وتطبيقها على جميع العينات.
  3. اتبع هذه الاستراتيجية النابضة هو مبين في الشكل 2. بإيجاز، بوابة السكان في الارتفاع مبعثر الأمام مقابل منطقة المبعثر إلى الأمام (الشكل 2A)، ومرة أخرى الجانب مبعثر واسعة مقابل الجانب مبعثر المنطقة (منطقة أفريقيا جنوب الصحراء، الشكل 2) بغية استبعاد doublets.
  4. بوابة السكان من الشكل 2B بالتآمر BV 650 (السيارات-الأسفار) مقابل فيتك (CFSE) من أجل تميز كفسي الحقيقي الملون الخلايا من الخلايا السيارات-الفلورسنت عالية. وتشمل الخرز أو خلايا ملطخة بجسم مترافق إلى 650 بي إلى ضوابط التعويض. يستخدم هذه الأرض (الشكل 2) من 650 بي مقابل فيتك للبوابة في الأراضي المحتلة--أنا كفسي الملون الخلايا.
  5. بوابة السكان من الشكل 2 ج Pe-Cy7 (Thy1.1-CD90.1-) مقابل APC (CD8) لتمييز الخلايا المشتقة من المانحين مقابل الفئران المستفيدة.
    ملاحظة: الخلايا المستمدة من OT--أنا الفئران المانحة هي Thy1.1+ (CD90.1)، بينما تكون الخلايا المستمدة من الفئران (C57BL/6، المتلقي) WT Thy1.2+ (CD90.2) (الشكل 2D). لدى بعض المختبرات OT--أنا الفئران في خلفية Thy1.2 ووزن (C57BL/6) في Thy1.1. وفي هذه الحالة يجب عليك استخدام جسم مضاد ضد Thy1.2 للعبارات--أنا خلية النابضة.
  6. إعادة بوابة CD8 الخلايا+ من السكان Thy1.1+ بالتآمر على بوابة تضم 450 BV (CD4) مقابل APC (CD8) (الشكل 2E).
  7. عرض السكان بوابات في 2E الشكل باستخدام عرض الرسم بياني CD8+ الخلايا تظهر كفسي (فيتك، قناة 530/15-الليزر الأزرق-)، بوابة السكان انتشرت بكثافة من 102 تصل إلى المستوى حيث السكان تحكم غير المجزأة هي (كثافة ~ 105، اعتماداً على كفاءة تلطيخ كفسي وإعداد cytometer تدفق التيار الكهربائي) (الشكل 2 واو).
  8. جعل بوابة إضافية (غير معروضة في الشكل 2) رسم فيتك مقابل L/D علامة (450/20 قناة والليزر الأشعة فوق البنفسجية) بغية تقييم الخلايا الميتة بالتوازي مع تقييم الانتشار.
  9. الحصول على مالا يقل عن 5000 الأحداث لعناصر التحكم التعويض ومن العينات في سيتوميتير تدفق أحداث 10.000 (البوابة الإلكترونية، الشكل 2). تشغيل في سيتوميتير في التدفق المنخفض أو المتوسط (لا تتجاوز معدلات التدفق من أحداث 20.000/s).

النتائج

من أجل اختبار علاجات استخدام مجموعة مختلفة من المواد المساندة (ADJ1 و ADJ2)، قمنا بتقييم قدرة توليد CTL بقياس انتشار العبارات المنقولة أدوبتيفيلي--أنا CD8+ تي الخلايا بالتدفق الخلوي (الشكل 2). لهذا، نحن سابقا الملون الخلايا المعزولة من استنزاف الليمفاوية وا...

Discussion

اللقاحات الحديثة هي من الناحية المثالية متميزة composedof مستضد المنقي والمواد المساعدة، مع إمكانية إضافة نظام توصيل مثل الدهنية أو جسيمات شبيهة بالفيروس، وجسيمات نانوية أو ناقلات حية. أحد جوانب رئيسية عند تصميم لقاح أن تختار adjuvant الصحيح وفقا للاحتياجات السريرية. يمكن أن يتضمن جزء من النطاق ?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن مدينون للمساعدين التقنيين لدينا: Bröder شين وحاء شكارليت، الذين ساعدونا خلال الإجراءات التجريبية. تم تمويل هذا العمل جزئيا بمنح الاتحاد الأوروبي (يونيب، والعقد رقم 601738، و TRANSVAC2، العقد رقم 730964)، ومنحة "رابطة هلمهولتز" (هاي-IDR). لم لا تؤثر مصادر تمويل البحوث تصميم وتوليد مخطوطة أو المقرر تقديمها للنشر.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BD LSR Fortessa Cell AnalyzerBDSpecial OrderFlow Cytometer
CFSEMolecular ProbesC34554Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation KitBiolegend480007Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitationMolecular ProbesL23105Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7eBioscience25-0900-82antibody
APC anti-mouse CD8a AntibodyBioLegend100712antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4BD740007antibody
Z2 coulter Particle count and Size AnalyzerBeckman Coulter9914591DACell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg)Hyglos(Germany)321000Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylonCorning352360Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample VialsBeckman Coulter899366014Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2)Harlan (Rossdorf, Germany)Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)Harlan (Rossdorf, Germany)Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubesFischer (Corning)14-959-5Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubesFischer (Corning)05-527-90Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL)Fischer (Gibco)20-012-027Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp)Dirk Rossmann GmbH (Germany)405096Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane)Abbott Laboratories (USA)5260.04-05.Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 AbsorberParkland ScientificV3000PKIsoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 mediumGibco (distributed by ThermoFischer)11-875-093Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)Gibco (distributed by ThermoFischer)15-140-148Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco)Gibco (distributed by ThermoFischer)10082147Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml)Gibco (distributed by ThermoFischer)A1049201Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri DishesNunc (distributed by ThermoFischer)15034060 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump FilterCellTrics (Sysmex)04-004-2317CellTrics® 50 μm, sterile

References

  1. Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
  2. Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
  3. Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
  4. Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
  5. Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
  6. Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
  7. Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
  8. Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
  9. Ebensen, T., et al. Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
  10. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  11. Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
  12. Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
  13. Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
  14. Otto, K., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 555-569 (2004).
  15. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).
  16. Shimizu, S., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).
  17. Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
  18. Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -. H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, 109-134 (2012).
  19. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
  20. Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
  21. Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
  22. Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).
  23. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
  24. Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. , 79-85 (2009).
  25. Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
  26. Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
  27. O'Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
  28. Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
  29. Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
  30. Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
  31. Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136 adjuvant CD8 OT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved