JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذه الورقة، ونحن مناقشة الاستعدادات المخ الثلاثة المستخدمة لتسجيل المشبك التصحيح خلية كله للدراسة على حلبة ريتينوتيكتال من الضفادع الصغيرة ليفيس النمو . ويساهم كل إعداد، بمزاياه الخاصة، المقاييس التجريبية من شرغوف النمو كنموذج لدراسة وظيفة الدوائر العصبية.

Abstract

حلبة ريتينوتيكتال شرغوف النمو ، تتألف من خلايا العقدة الشبكية (رجكس) في العين التي تشكل synapses مباشرة على الخلايا العصبية في الألياف البصرية تيكتوم، نموذج شعبية لدراسة الدوائر العصبية كيفية تجميع ذاتي. القدرة على القيام بكل خلية تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية تيكتال، وتسجيل الاستجابات التي أثارت حكومة كمبوديا الملكية، أما في فيفو أو استخدام إعداد كامل للعقل، وقد ولدت مجموعة كبيرة من البيانات العالية الاستبانة حول الآليات الكامنة وراء العادي ، وغير طبيعي، تشكيل الدائرة والدالة. هنا ونحن تصف كيفية تنفيذ في فيفو الإعداد، إعداد كامل الدماغ الأصلي، وأكثر مؤخرا بوضع إعداد شريحة الدماغ الأفقية للحصول على تسجيلات المشبك التصحيح كل خلية من الخلايا العصبية تيكتال. إعداد كل مزايا فريدة من نوعها التجريبية. ويمكن الإعداد في فيفو تسجيل استجابة الخلايا العصبية تيكتال المباشر للمنبهات البصرية المسقطة على العين. إعداد كامل الدماغ تسمح لحكومة كمبوديا الملكية محاور عصبية لتفعيلها على نحو شديد، وإعداد شريحة الدماغ الأفقي يسمح التسجيل من عبر كل الطبقات تكتم.

Introduction

حلبة ريتينوتيكتال هو العنصر الرئيسي في النظام المرئي البرمائية. أنها تتألف من رجكس في العين، والمشروع على محاور عصبية تكتم الألياف البصرية حيث تشكل الاتصالات متشابك مع الخلايا العصبية تيكتال بوستسينابتيك. حلبة ريتينوتيكتال شرغوف النمو نموذج إنمائي شعبية لدراسة تشكيل الدوائر العصبية ووظيفة. وهناك العديد من سمات هذا شرغوف ريتينوتيكتال الدائرة التي تجعل من نموذج تجريبي قوية1،2،3. سمة رئيسية واحدة، والتركيز في هذه المقالة، هو القدرة على القيام بتسجيلات المشبك التصحيح كل خلية من الخلايا العصبية تيكتال، في فيفو أو استخدام إعداد كامل للعقل. مع منصة الكهربية لتجهيزه مع مكبر للصوت التي تدعم الجهد والحالية-المشبك تسجيل وسائط، تسمح تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية الكهربية العصبية تتسم بدقة عالية. نتيجة لذلك قدمت تسجيلات المشبك التصحيح كل خلية من الخلايا العصبية تيكتال عبر المراحل الرئيسية لتشكيل الدائرة ريتينوتيكتال فهم مفصل وشامل لتنمية واللدونه الجوهرية4،5 , 6 , 7 و متشابك8،9،،من1011 خصائص. الجمع بين الخلية كله التصحيح المشبك العصبية تيكتال التسجيلات، يعزز القدرة على التعبير عن الجينات أو مورفولينوس من الفائدة في هذه الخلايا العصبية12، وأسلوب لتقييم سلوك الإرشادية البصرية عن طريق اختبار إبطال بصرية ثابتة13 تحديد الصلات بين الجزيئات، ووظيفة الدائرة، والسلوك.

من المهم ملاحظة أن نوع عالية الدقة البيانات التي يحصل عليها من تسجيلات المشبك التصحيح خلية كاملة لا يمكن استخدام أحدث النهج التصوير مثل مؤشر الكالسيوم الوراثية GCaMP6، لأنه على الرغم من أن استخدام مؤشرات الكالسيوم تصاريح التصوير الكالسيوم ديناميات عبر عدد كبير من السكان من الخلايا العصبية في نفس الوقت، هناك لا مباشرة أو طريقة واضحة أن المعلمات الكهربائية محددة يمكن الحصول على قياس fluorescence دلتا في سوماتى، ولا توجد طريقة للجهد المشبك العصبية لقياس علاقات الجهد الحالي. وضوح هذه نهجين متميزين والتسجيلات الكهربية وتصوير الكالسيوم، تمتلك القوة غير متداخلة وتوليد أنواع مختلفة من البيانات. هكذا فإن أفضل نهج يعتمد على مسألة تجريبية محددة يجري تناولها.

هنا، يمكننا وصف لدينا طريقة للحصول على تسجيلات المشبك التصحيح خلية كاملة من الخلايا العصبية تكتم الألياف البصرية شرغوف استخدام في فيفو إعداد، الإعداد الكامل للعقل، وأحدث تعديل لإعداد كامل الدماغ التي تم تطويرها في لدينا مختبر14 . في مقطع النتائج الممثل، نبدي مزايا التجريبية لكل إعداد وأنواع مختلفة من البيانات التي يمكن الحصول عليها. حدود ونقاط القوة في التحضيرات المختلفة، فضلا عن نصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، يتم تضمين في جزء المناقشة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة وايومنغ. وتنفذ جميع الإجراءات، بما في ذلك التسجيلات الكهربية، في درجة حرارة الغرفة، حوالي 23 درجة مئوية. جميع الأساليب الموصوفة هنا هي الأمثل لتسجيل تيكتال الخلايا العصبية من الضفادع الصغيرة بين مرحلة النمو 42 و 49 (نظموا وفقا نيووكوب وإبر15).

1. إعداد في فيفو

  1. تخدير شرغوف.
    1. ضع شرغوف في طبق بتري صغيرة التي تحتوي على الحل شتاينبرغ بنسبة 0.01 في المائة MS-222 لمدة 5 دقائق تقريبا.
      ملاحظة: هو مرض التصلب العصبي المتعدد-222 الملقب "تريكايني" الأسماك والبرمائيات مخدر المشتركة. الضفادع الصغيرة تربى في الحل شتاينبرغ في ملم: 0.067 بوكل، 0.034 Ca (لا3)2•4H2س،4•7H مجسو 0.0832س، 5.8 كلوريد الصوديوم، حبيس 4.9.
    2. ضمان شرغوف شدة فظاعتها (غير المستجيبة ولم يعد سباحة) قبل المتابعة إلى الخطوة 2.
  2. تأمين شرغوف أنيسثيتيزيد إلى كتلة سيليكون مغمورة في الطابق طبق تشريح/تسجيل.
    1. استخدام ماصة نقل المتاح لنقل شرغوف أنايسثيتيزيد إلى طبق تشريح/تسجيل الذي يحتوي على تسجيل خارجية حل (115 مم لكلوريد الصوديوم، 2 مم بوكل، 3 مم من كاكل2، 3 مم من مجكل2، 5 ملم حبيس، 1 مم جلوكوز؛ ضبط الأس الهيدروجيني باستخدام 7.25 10 N من هيدروكسيد الصوديوم، موسم الاسموليه 255).
      1. للتقليل من العضلات العفوية الاختلاجة، إضافة مانع مستقبلات أستيل، توبوكوراريني (100 ميكرومتر) إلى الحل الخارجي. (عادة ما يتم ذلك باستخدام ماصة ميليلتر 200 لإضافة 100 ميليلتر من مخزون tubocurarine 10 ملم إلى 10 مل من محلول خارجي).
    2. باستخدام دبابيس الحشرات، تأمين شرغوف، الجانب الظهرية، إلى كتلة مغمورة من سيليكون الاستومر (مثل سيلجارد 184، انظر الجدول المواد لمزيد من التفاصيل)، التي قد تم لصقها على الكلمة طبق تشريح.
      ملاحظة: وضع الدبابيس الحرجة: وضعها على أي من جانبي الدماغ، والذيلية بما فيه الكفاية لتجنب التخوزق محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية الزبائ هذا المشروع من العين وأدخل في الدماغ فقط عرفت تكتم الألياف البصرية (الشكل 1أ).
  3. فيليه الدماغ على طول خط الوسط.
    1. للحصول على رؤية واضحة للمخ، إزالة الجلد تغمر الدماغ بجعل شق سطحية على طول خط الوسط باستخدام إبرة معقمة 25-ز.
    2. فيليه الدماغ على طول نفس المحور خط الوسط بإدخال الإبرة في الأنبوب العصبي وسحب بلطف إلى الأعلى (دورسالي) مثل هذا أن هو نظيفة قص الجزء الظهرية من الأنبوب (قطعت) مع ترك الكلمة لوحة سليمة (الشكل 1ب).
      ملاحظة: من المهم أن تترك لوحة الكلمة للأنبوب العصبي سليمة لأن المدخلات الحسية الزبائ أدخل تيكتوم عن طريق لوحة الكلمة.
  4. إزالة الغشاء البطين الشفاف الذي يغطي الخلايا العصبية تيكتال.
    1. تحريك الطبق تسجيل لتلاعب الكهربية واستخدام تلميح ماصة زجاج المكسور لإزالة الغشاء البطين تغمر الهيئات الخلايا العصبية تيكتال. كسر التلميح باستخفاف سحبه عبر ممسحة مهمة حساسة.
    2. المسمار الماصة في حامل ماصة وخفضه وصولاً إلى تكتم الألياف البصرية عبر ميكرومانيبولاتور.
    3. استخدام ماصة كسر قشر الغشاء البطين بعيداً عن تكتم.
      ملاحظة: ليس من الضروري إزالة الغشاء من تكتم كامل؛ نافذة صغيرة سوف تكفي وتوفير إمكانية الوصول إلى الكثير من الخلايا العصبية.
  5. الحصول على خلية كاملة تسجيلات المشبك التصحيح.
    ملاحظة: هذا النهج من هذه النقطة إلى الأمام مماثل للقيام بتسجيلات المشبك التصحيح خلية كاملة من شرائح المخ الماوس كما هو موضح في سيغيف، et al. 16 (الشكل 1ج).
  6. تسجيل الاستجابات العصبية تيكتال لفلاش كامل مجال الضوء المسقط على شبكية العين.
    1. للمشروع ومضة حقل بكامل من الضوء على شبكية العين، ضع ألياف بصرية المجاورة للعين شرغوف. في الجانب الآخر من الألياف البصرية هو الصمام تمشيا مع مقاوم متغير الذي يسمح للإنارة الخفيفة السيطرة عليها. تشغيل الصمام بإخراج مكبر للصوت الرقمي. وبهذه الطريقة، سجلت ومضات من كثافات مختلفة من الضوء يمكن أن يكون الحقل بالكامل (الشكل 4أ).

2-الجامعة الدماغ إعداد

  1. نفذ الخطوات 1.1 إلى 1.3.
    ملاحظة: ليست هناك حاجة توبوكوراريني في حل خارجي لهذا الإعداد.
  2. عزل في الدماغ.
    1. استخدام إبرة 25-ز بقطع hindbrain (الشكل 2أ).
    2. لعزل الدماغ كله من شرغوف، بلطف تشغيل الإبرة تحت الدماغ، وفي اتجاه والذيلية إلى روسترال قطع جميع الأنسجة الضامة الأفقي والبطني والألياف العصبية.
  3. تأمين الدماغ لكتلة من سيليكون الاستومر.
    1. بمجرد إطلاق سراح تماما، تأمين الدماغ لكتلة من سيليكون الاستومر بوضع دبوس واحد عن طريق واحد من المصابيح شمي وطرف آخر عن طريق hindbrain (الشكل 2ب). هذا هو التكوين الأمثل لتسجيل من الخلايا العصبية تيكتال.
  4. تحريك الطبق يحتوي على إعداد الدماغ كله المثبتة من نطاق تشريح لتلاعب الكهربية. إزالة الغشاء البطين استخدام ماصة زجاج المكسور كما هو موضح في الخطوة 1، 4.
  5. مكان قطبين قطب تحفيز على chiasm البصرية (حيث عبر مساحات إكسون من كل عين في midbrain) لتفعيل محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية مباشرة.
    1. ضع ثنائي القطب الكهربائي محفزة روسترال، وتقريبا المتاخمة، البطين المتوسطة الكبيرة. ويقع chiasm البصرية روسترال فورا إلى البطين المتوسطة الكبيرة (الشكل 2ب).
      1. بلطف أقل مسرى حفز إلى أسفل إلى chiasm البصرية مثل أن يتم تشكيل دنت صغيرة في الأنسجة. ثنائي القطب الكهربائي تحركها مشجعا نبض الذي يسمح لقوة التحفيز للتحكم بدقة.
  6. إجراء تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية (الشكل 2ج) كما وصفها سيغيف، et al. 16

3-إعداد شريحة الدماغ أفقي

  1. تنفيذ الخطوات من 2.1 إلى 2.3.
  2. استخدام شفرة حلاقة للمكوس الرابع الأكثر الأفقي (أي في فيفو يتوافق مع الرابعة الأكثر الظهرية) من جانب واحد لواحد تكتم الألياف البصرية. يتم إجراء هذا الخفض موازية للطائرة روسترال والذيلية كما هو موضح في الشكل 3ألف.
  3. إعادة تثبيت الدماغ إلى جانب الاستومر السيليكون مع شرائح الجانب مواجهة (حيث أنه يمكن يمكن الوصول إليها مباشرة سوماتى ونيوروبيل للتسجيل) وسطح البطين من الدماغ التي تواجه بعيداً عن كتلة سيليكون الاستومر (الشكل 3 ب) (حيث أنه يمكن وضعها قطب كهربائي بين قطبين على chiasm البصرية).
  4. تنفيذ المشبك التصحيح خلية كامل أو تسجيل المحتملة قدم محلي (الشكل 3ج) كما هو موضح سيغيف، et al. 16

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لتسجيل استجابات أثارت الضوء المسقط ومضة حقل بكامل من الضوء على شبكية العين بينما يتم تسجيل الاستجابة الناتجة من الخلايا العصبية تيكتال الفردية (الشكل 4أ). هذا البروتوكول خاص مصمم لقياس كل رد من العصبية على ضوء تحول على ("على" استجابة) وثم إيقاف تشغ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

جميع الأساليب الموصوفة في هذا العمل هي الأمثل لتسجيل تيكتال الخلايا العصبية من الضفادع الصغيرة بين مرحلة النمو 42 و 49 (نظموا وفقا نيووكوب وإبر15). بمرحلة 42، الضفادع الصغيرة كبيرة بما فيه الكفاية والمتقدمة بما فيه الكفاية حتى أنه يمكن وضع دبابيس الحشرات على أي من جانبي الدماغ لل?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يدعم منح المعاهد الوطنية للصحة أمانة اتفاقية بازل نحاس 1P20GM121310-01.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Stemi Stereo 508Zeiss495009-0006-000 Dissecting microscope
MS-222 "Tricane"FinquelARF5GAmphibian general anesthetic
Sodium Chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-3Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Potassium Chloride (KCl)Fisher ScientificP217-500Used to prepare Stienberg's solution and external solution
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGUsed to prepare Stienberg's solution and external solution
Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O)Sigma-Aldrich237124-500GUsed to prepare Stienberg's solution  
Magnesium Sulfate (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04Used to prepare Steinberg's solution
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GUsed to prepare external recording solution
Magnesium Chloride (MgCl2)J.T. Baker2444-01Used to prepare external recording solution
D-glucose AnhydrousMallinckrodt Chemicals6066-04Used to prepare external recording solution
Tubocurarine hydrochloride pentahydrateSigmaT2379Nicotinic acetylcholine receptor antagonist
Insect PinsFine Science Tools26002-100.1mm diameter stainless steel pins
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corning761028Preweighed monomer and curing agent kit
Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mmFisher ScientificAS4052Small petri dishes
PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)BD305122Syringe needles
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe BD309659Disposable, sterile syringes
Borosilicate pipette glassSutter InstrumentBF150-86-10HPPulled to desired specifications using pipette pulling machine
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter InstrumentsP-97Fabricates micropipettes for electrophysiology recording
Kimwipes Kimtech wipesKimberly-Clark34120Delicate task lint-free wipers
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7BMolecular Devices1-CV-7BCurrent clamp and voltage clamp headstage
MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop ControllerSutter InstrumentMP-285/TControl for headstage on electrophysiology rig
Fiber-Coupled LED (Green)ThorlabsM530F2Fiber optic cable paired with green LED
Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter)FHC30207Bipolar stimulating electrode
ISO-Flex StimulatorA.M.P.I. (Israel) Contact manufacturerFlexible stimulus isolator
Axon Instruments 700B Multipatch AmplifierMolecular Devices2500-0157Amplifier for voltage- and current-clamp recording 
Digidata 1322A digitizerMolecular Devices2500-135Data acquisition system for electrophysiology recording
Axio Examiner.A1Zeiss491404-0001-000 Microscope for electrophysiology
Micro-g Lab TableTMC63-533Air table for electrophysiology microscope
Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bitDellD06D001Computer running electrophysiology software
c2400 CCD cameraHamamatsu70826-5Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging
7 O'Clock Super Platinum Stainless RazorbladesGilletteCMM01049Platinum-coated stainless razor blades
Transfer PipetsFisher Scientific13-711-7MDisposable Polyethylene transfer pipets

References

  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
  2. Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
  3. Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
  4. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
  5. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
  6. Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351(2015).
  7. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
  8. Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
  9. Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
  10. Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
  11. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  12. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705(2008).
  13. Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  14. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
  16. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).
  17. Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
  18. Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
  19. Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
  20. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved