JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الجيل التالي التسلسل (خ ع) هو أداة قوية لتوصيف الجينوم محدود بنسبة الخطأ عالية من النظام الأساسي (~0.5–2.0%). يصف لنا أساليب عملنا لتصحيح خطأ في تسلسل التي تسمح لنا بتفادي نسبة الخطأ خ ع والكشف عن الطفرات في اليل البديل الكسور نادرة ك 0.0001.

Abstract

وأتاحت التقنيات التقليدية الجيل التالي التسلسل (خ ع) وصف الجينوم الهائلة لأكثر من عقد. على وجه التحديد، خ ع قد استخدمت لتحليل طيف الطفرات الاستنساخ في الأورام الخبيثة. على الرغم من أن أكثر فعالية من الأساليب التقليدية سانجر، خ ع صراعات مع تحديد طفرات نادرة الاستنساخ وسوبكلونال بسبب خطأ ارتفاع معدل ~0.5–2.0%. هكذا، القياسية خ ع قد حد كشف عن الطفرات التي > 0.02 اليل البديل الكسر (VAF). بينما أهمية سريرية للطفرات النادرة هذا في المرضى دون الأمراض المعروفة لا تزال غير واضحة، المرضى الذين يعالجون للوكيميا تحسنت كثيرا النتائج عندما يكون المرض المتبقية < 0.0001 بالتدفق الخلوي. وللتخفيف من هذه الخلفية أرتيفاكتوال من فئة الخدمات العامة الوطنية، وقد وضعت أساليب عديدة. هنا يصف لنا طريقة لتصحيح الخطأ الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي التسلسل (ECS)، الذي ينطوي على تمييز جزيئات فردية مع مؤشر عشوائية 16 شركة بريتيش بتروليوم لتصحيح الخطأ وفهرس خاصة بمريض bp 8 للإرسال المتعدد. لدينا طريقة يمكن كشف وتعقب الطفرات الاستنساخ في اليل البديل الكسور (فافس) هما أوامر من حجم أقل من حد الكشف من خ ع و ونادرة ك 0.0001 VAF.

Introduction

كما أننا العمر، والتعرض والمطفرات والأخطاء العشوائية خلال نتيجة انقسام الخلايا في تراكم الانحرافات الجسدية في الجينوم، وهذا وراء المرضية الأساسية للتحول الخبيث، والأمراض العصبية الإنمائية، طب الأطفال اضطرابات والشيخوخة العادية1،2. الطفرات الجسدية مع إمكانات القيادة المرض هي المؤشرات الحيوية التشخيصية وتشخيصية هامة للكشف المبكر ومخاطر الإدارة3،،من45. من أجل فهم أفضل كلونوجينيسيس الفسيولوجية، الذي سيتم إبلاغ السريرية والبحوث المقررات، والقياس الكمي الدقيق وتوصيف هذه الطفرات ذات أهمية أساسية. الجيل التالي التسلسل (خ ع) يستخدم حاليا لدراسة الطفرات الاستنساخ في عينات الحمض النووي غير المتجانسة؛ خ ع غير محدودة لتحديد الطفرات في > 0.02 اليل البديل الكسر (VAF) – نتيجة للخطأ الأصيل-معدل 0.5-2.0% من تسلسل منصات6،،من78. نتيجة لذلك تتبع دياجنوستيكالي وانذاريا متغيرات جسدية كبيرة في VAF السفلي لا يمكن تحقيقه باستخدام معيار خ ع.

في الآونة الأخيرة، تم وضع أساليب مختلفة بغية التحايل على معدل خ ع8،9،،من1011خطأ. هذه الأساليب تستخدم العلامات الجزيئية، التي تمكن من تصحيح الخطأ بعد التسلسل. كل جزيء أو جزء الجينوم في مكتبة التسلسل هو معلم مع عشوائي فريد الجزيئية المعرف (أومي) الخاصة بهذا الجزيء. UMIs مشيدة التباديل سلسلة من النيوكليوتيدات معشاة ذات شواهد (N 8 – 16). باركود الخاصة بالعينة ثانية أيضا إدماج سير العمل التي تمكن من مضاعفة عينات متعددة في نفس تسلسل خ ع تشغيل. [بكر] تضخيم تتم على مكتبة كلمات جزيئيا، وبعد ذلك يتم إرسال المكتبة للتسلسل. أثناء إعداد المكتبة، ومن المتوقع عرض عشوائياً للجزء الجينوم خلال التضخيم بكر وتسلسل8أخطاء. لإزالة الأخطاء تسلسل عشوائي، صنفت ما يلي تسلسل الخام وفقا أومي. القطع الأثرية من التسلسل غير المتوقع أن يكون حاضرا في كل القراءات مع أومي نفسه في نفس الموضع الجينوم بسبب الطبيعة العشوائية للمقدمة، بينما يتم تضخيمها البديل حقيقي إخلاص ومتسلسلة في كل القراءات التي تتقاسم أومي نفسه. النتائج الملموسة إزالة بيوينفورماتيكالي. وهنا، يمكننا وصف ثلاثة أساليب لتصحيح خطأ في تسلسل (ECS) الأمثل في المختبر للحمض النووي لتحديد المتغيرات النوكليوتيدات واحدة (سنفس) والإدراج الصغيرة-الحذف (إينديلس)، والجيش الملكي النيبالي لتسهيل التحديد الكمي للتعبير الجيني أدناه خ ع عتبة الخطأ.

ويصف الطريقة الأولى وسيلة للبحث عن الحدث جسدية نادرة باستخدام الجينات محددة صممها باحثون كبسولة تفجير. قبل إعداد المكتبة، ينبغي تصميم الباحثين كبسولة تفجير لاستهداف أجزاء الفائدة. كنا Primer3 ويب التطبيق (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). أمبليكونس من 200-250 شركة بريتيش بتروليوم مثالية لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كهذه الإرادة، مرة واحدة وقد أدرجت أميس، تولد تداخل يقرأ نهاية الاقتران مع نهاية الاقتران بي بي 150 على ما يلي. شروط التصميم التمهيدي المثلى لاستخدامها: الحد الأدنى للحجم التمهيدي = 19؛ الحجم الأمثل التمهيدي = 25؛ حجم الحد الأقصى التمهيدي = 30؛ الحد الأدنى Tm = 64 درجة مئوية؛ Tm الأمثل = 70 درجة مئوية؛ Tm الحد الأقصى = 74 درجة مئوية؛ الحد الأقصى للفرق Tm = 5 درجة مئوية؛ الحد الأدنى لمحتوى GC = 45؛ الحد الأقصى GC المحتوى = 80؛ عدد العودة = 20؛ نهاية الاستقرار الحد الأقصى 3 ' = 100.

في "الطريقة الثانية"، يصف لنا أسلوب الجمع بين البروتوكول ECS-الحمض النووي مع الكيمياء إيلومينا لمسح سنفس الاستنساخ ونادرة ك VAF 0.0001 باستخدام لوحات الجينات المتاحة تجارياً التي تشمل مئات أمبليكونس الصغيرة إينديلس. قد استخدمنا "تروست النقوي تسلسل لوحة" (إيلومينا) لتجربتنا وصمم فريق دولي موسع ليشمل جينات إضافية من مصلحة لطب الأمراض النقوي. وعرضت هذه اللوحات لا معرفات فريدة الجزيئية (أميس) التي من شأنها تسهيل تصحيح الخطأ، حيث أضاف لدينا استراتيجيتنا الخاصة محول لهذه اللوحات. ECS ينبغي أن تعمل جيدا على قدم المساواة مع أي من لوحات أخرى تهدف إلى إثراء للجينات المرتبطة بأمراض مختلفة. بعد عزل الحمض النووي والكمي اللاحقة من الأنسجة أو عينة من الفائدة، من المستحسن أن يكون مالا يقل عن 500 نانوغرام أسهم الحمض النووي للعينة الواحدة. نقوم بشكل روتيني مكتبة تسلسل واحد باستخدام 250 نانوغرام من الحمض النووي من أجل التقاط يفتت الجينوم فريدة من نوعها كثير ممكن المصب يقرأ إزالة الازدواجية وحساب VAF. يمكن إجراء في مكتبة تسلسل تكرار اختياري مع 250 المتبقية نانوغرام من الحمض النووي. نحن دائماً بذل مكتبتين نسخ متماثل كل عينة، ونحن نعتبر فقط تلك الأحداث كشف بشكل مستقل في كلا replicates كإيجابيات حقيقية. ونحن أيضا تنفيذ نموذج الجينوم الخاصة بموقف خطأ ثنائي الحد زيادة دقة البديل استدعاء4،13.

وأخيراً، يصف لنا طريقة اقتران ECS لتسلسل الحمض النووي الريبي لمحضر التحديد الكمي استخدام لوحات "قياسيق استهدف الجيش الملكي النيبالي" الجاهزة (Qiagen). أميس المطلوبة لإزالة الازدواجية وتصحيح الخطأ وقد أدرجت في المجموعات، والباحثين يمكن أن تجعل المكتبات اتباع توصيات الشركة المصنعة. بيوينفورماتيكالي، يمكنك متابعة الباحثين خط الأنابيب المبينة ل ECS-الحمض النووي، والتي سيتم شرحها بالتفصيل في قسم البروتوكول.

Protocol

1-تستهدف تصحيح خطأ في تسلسل للحمض النووي

  1. [بكر] تضخيم أجزاء الجينوم للفائدة.
    1. استخدام عالية دقة بوليميريز الحمض النووي لتضخيم أمبليكونس (جدول المواد، البند 1). تضخيم تفاعل PCR مع الشروط التالية في cycler حرارية: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية؛ 18-40 دورات من 10 s عند 98 درجة مئوية، 30 s في 66 ° C، و 30 ثانية في 72 درجة مئوية؛ 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية؛ عقد في 4 درجات مئوية.
    2. تنقية منتجات PCR مع حبات باراماجنيتيك (جدول المواد، البند 2). إضافة تفاعل PCR الخرز في نسبة 1: 1.8 (حجم تفاعل PCR: حبة وحدة التخزين) وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. الوت مع 20 ميليلتر ddH2o.
    3. قياس تركيز الحمض النووي (جدول المواد، البند 3) لتحديد التركيز النهائي للحمض النووي.
    4. تشغيل قاسمة للحمض النووي على 2% [اغروس] هلام (جدول المواد، البند 4) للتأكد من حجم أمبليكونس.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن اختيار الباحثين إجراء تحليل بيواناليزير على منتجات PCR لتحديد حجم تضخيم أجزاء الجينوم، فضلا عن تركيز المنتجات.
  2. تسلسل محول الصلب
    1. الحصول على محولات i7 (جدول المواد، البند 5). استخدامها كما أنها تقدم للخطوات اللاحقة.
    2. شراء محولات i5 16N تجارياً مع تسلسل اليغو التالية (مواد الجدول البند 6): أكاكتكتتكككتاكاكجاكجكتكتككجاتكت AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(N1:25252525)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1) (N1)
      ملاحظة: استبدال محولات i5 16N محولات i5 القياسية ومحولات مع سلسلة من 16 عشوائي النوكليوتيدات لتسهيل ECS.
    3. جعل الحل العامل محول i5 16N: ميليلتر 40 من 100 ميكرومتر 16N i5 محول الأسهم و 10 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات و 10 ميليلتر من محلول كلوريد الصوديوم ميكرومتر 500.
    4. الكوة ميليلتر 7.5 الحل العامل i5 إعدادها في الخطوة 1.2.3 في آبار PCR منفصلة.
    5. إضافة 5 ميليلتر من محول i7 عينة على حدة في آبار المقابلة.
    6. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم بارد من 1 درجة مئوية كل 30 ثانية إلى 4 درجات مئوية في cycler حرارية.
    7. عقد في 4 درجات مئوية.
  3. نهاية-إصلاح ودا-تراجع من المكتبات
    ملاحظة: بالتوازي مع محول الصلب، واحد يمكن إجراء الإصلاح نهاية وتراجع دا على أمبليكونس بكر من "الخطوة 1، 1". وبعد إتمام هذه الخطوات، يتم ربط محولات الملدنة من 1.2 خطوة إلى نهاية إصلاحه والذيل دا أمبليكونس بكر. بعد ربط محول، تم الانتهاء من بناء المكتبة ECS.
    1. تبدأ مع أقصى 1 ميكروغرام من ابتداء من الحمض النووي (الحد الأدنى ~ 200 نانوغرام)
    2. تنفيذ الإصلاح نهاية والذيل دا على أمبليكونس (جدول المواد، البند 7).
      1. إضافة ميليلتر 3.0 من نهاية إنزيم الإعدادية خليط و 6.5 ميليلتر من نهاية إصلاح المخزن المؤقت.
      2. احتضان هذا المزيج لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية، ثم لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية، وعقد في 4 درجات مئوية.
    3. إجراء عملية ربط على محولات الملدن (جدول المواد، البند 8).
      1. إضافة 2.5 ميليلتر من محولات الملدنة من الخطوة 2 و 15 ميليلتر من Mastermix ليجاسى بلانت/تا 1 ميليلتر من ربط محسن.
      2. احتضان هذا المزيج لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية، ثم لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. تنظيف المكتبات مع حبات مغناطيسية (مواد الجدول البند 2): إضافة رد فعل PCR الخرز في نسبة معدل 1: 0.75 (حجم تفاعل PCR: حجم حبة المغناطيسي):
      1. "الماصة؛" ميليلتر 62.6 الحل حبة المغناطيسي إلى 83.5 ميليلتر من منتجات PCR من الخطوة 1.2.7.
      2. نقل الخليط إلى أنبوب ملزمة منخفضة 1.5 مل.
      3. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً على الأقل 10 مرات.
      4. اترك الخليط الوقوف على درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      5. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسية. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو حتى المادة طافية واضح.
      6. إزالة المادة طافية.
      7. أغسل حبات مع 200 ميليلتر من الإيثانول 70%.
      8. احتضانها الإيثانول إزالة س. 30.
      9. كرر الخطوة يغسل الإيثانول مرة واحدة.
      10. أيردري الخرز.
      11. الوت مع 20 ميليلتر ddH2o.
        ملاحظة: هذا التعديل PCR كرد فعل لنسبة حبة المغناطيسي تفضيلي إزالة شظايا من الحمض النووي التي أقل من 200 شركة بريتيش بتروليوم.
  4. القياس الكمي الحبرية PCR الرقمية
    ملاحظة: يتطلب طفرة دقة القياس الكمي التقيد الصارم بعدد من الجزيئات التي يتم تحميلها على جهاز التسلسل لكل مكتبة. ولتحقيق ذلك، التحديد الكمي لعدد الجزيئات للمكتبات الفردية كل وحدة حجم تتم باستخدام منصة بكر (دبكر) QX200 التجميعية الرقمية – PCR الكمي خيار بديل. وبعد تحليل دبكر، سوف تحدد قراءات عدد جزيئات كل ميليلتر في مكتبة.
    1. تمييع ECS 1:1,000 المكتبات بتمييع تدريجيا بمقدار 10 في قطاع أنابيب PCR.
    2. إعداد mastermix التالية دبكر في أنبوب 1.5 مل: 10 ميليلتر من مزيج PCR (جدول المواد، البند 9)، 0.2 ميليلتر من P5 التمهيدي، ميليلتر 0.2 من التمهيدي P7، 5 ميليلتر ECS تنظيف المتابعة الناتج من الخطوة 1.4.1.، و 4.5 ميليلتر ddH2o.
    3. الكوة 20 ميليلتر من mastermix في كل عينة جيدا مع التأكد من أن هناك مضاعفات 8.
      1. الكوة ميليلتر 70 الحبرية توليد النفط (جدول المواد، البند 10) في كل آبار النفط. تغطية الكاسيت مع طوقا مطاط.
    4. جعل قطرات استخدام مولد الحبرية (جدول المواد، البند 11).
    5. استخدام ماصة متعددة القنوات، تحميل قطرات إنشاؤها في الخطوة 1.4.4 في لوحة بكر ضمان أن بيبيتينج العينة يتم ببطء على مدى 5 ثوان لتجنب قص الحمض النووي.
    6. تضخيم الإشارات في القطرات لدورات 40 في cycler حرارية استخدام الشروط التالية: 5 دقيقة عند 95 درجة مئوية؛ دورات 40 من 30 ثانية عند 95 درجة مئوية، 1 دقيقة في 63 درجة مئوية؛ 5 دقيقة في 4 درجات مئوية، 5 دقيقة عند 90 درجة مئوية؛ ثم اضغط على 4 درجة مئوية.
    7. إعداد الجهاز القارئ دبكر قالب الحبرية (جدول المواد، البند 11). ضمان مواصفات للمعلمات القياس الكمي المطلق واستخدام QX200 دبكر "إيفا غرين سوبيرميكس".
    8. بمجرد اكتمال التحليل دبكر، تأكد من تعيين عتبة الانقسام نفسه عبر كافة العينات.
    9. استخدام قراءات تركيز من القارئ الحبرية QX200، وقاسمه وحدة التخزين المناسبة لإدخال العدد المطلوب من الجزيئات في خطوة لاحقة.
  5. [بكر] تضخيم المكتبات للتسلسل
    1. إعداد mastermix التالية للعدد المطلوب من جزيئات من الخطوة 1.4.9: 25 ميليلتر من Q5 Mastermix (جدول المواد، البند 1)، 2.5 ميليلتر من التمهيدي P5 (10 ميكرومتر)، 2.5 ميليلتر من التمهيدي P7 (10 ميكرون)، X µL من الحمض النووي، 20-X ميليلتر ddH2o.
    2. تضخيم المكتبات من الخطوة 1.5.1 في cycler حرارية استخدام الشروط التالية: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية؛ دورات 20 10 s عند 98 درجة مئوية، 30 ثانية عند 63 درجة مئوية، 30 s عند 72 درجة مئوية؛ 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية؛ ثم اضغط على 4 درجة مئوية.
    3. تنظيف المكتبات مع حبات مغناطيسية (جدول المواد، البند 2): إضافة رد فعل PCR المغناطيسي الخرز في تعديل نسبة 1: 0.75 (حجم تفاعل PCR: حجم حبة المغناطيسية).
      1. "الماصة؛" ميليلتر 37.5 من حل حبة المغناطيسية في منتجات PCR 50 ميليلتر من الخطوة 1.5.2.
      2. نقل الخليط إلى أنبوب ملزمة منخفضة 1.5 مل.
      3. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً على الأقل 10 مرات.
      4. اترك الخليط الوقوف على درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      5. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسية. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو حتى المادة طافية واضح.
      6. إزالة المادة طافية.
      7. أغسل حبات مع 200 ميليلتر من الإيثانول 70%.
      8. احتضانها الإيثانول إزالة س. 30.
      9. كرر الخطوة يغسل الإيثانول مرة واحدة.
      10. أيردري الخرز.
      11. الوت مع 20 ميليلتر ddH2o.
    4. تشغيل قاسمة للحمض النووي على 2% [اغروس] هلام لتأكيد حجم أمبليكونس.
    5. قياس تركيز الحمض النووي (جدول المواد، البند 3) لتحديد تركيز المكتبات ECS منفصلة.
    6. تجمع المكتبات في المبالغ اكويمولار.
      ملاحظة: على سبيل المثال، الباحثون يمكن أن تجمع المكتبات ثمانية في مجموعة اكويمولار4 مع 4 مليون ابتداء من الجزيئات للتسلسل باستخدام منصة تسلسل الذي نواتج القراءات يصل إلى 400 مليون. متحفظ، يوصي باستخدام متوسط القراءات الخام عشرة لتصحيح الخطأ في الجزيئات. هذا سوف يستغرق ما يلي 360 مليون (جزيئات 4 مليون * مكتبات 8 * 10 ما يلي لتصحيح الخطأ). مع 4 مليون جزيئات فريدة في المكتبة، يمكن أن نتوقع الباحثين للحصول على توافق يعني نظرية قراءة تغطية x 7042 كل أمبليكون (أمبليكونس 4 مليون/568 من لوحة الجينات).
    7. قياس تركيز الحمض النووي (جدول المواد، البند 3) لتحديد تركيز المجمعة ECS مكتبة.
    8. تقدم المكتبة ECS مجمعة في ما يقرب من 4 نانومتر.
    9. توفير الإعدادات التسلسل التالي لمنصات التسلسل إيلومينا (ميسيق أو هيسيق أو نيكستسيق): 2 × 144 إقران في نهاية ما يلي: 8 دورات 1 الفهرس ودورات 16 2 الفهرس.

2. الجينات لوحات مع تصحيح خطأ في تسلسل الحمض النووي

  1. تهجين أوليجوس من لوحات الجينات
    ملاحظة: في هذه الخطوة، ستقوم أحد بناء المكتبات التسلسل باستخدام بروتوكول تروست إيلومينا أو تراسك تعديل إدراج أميس (جدول المواد، البند 17).
    1. هجن أوليجوس على الجينوم يفتت بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. استخدام 250 نانوغرام من الحمض النووي (أو أي المبلغ المطلوب لبدء المواد).
    2. إزالة غير منضم أوليجوس بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    3. إجراء عملية ربط التمديد بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
      ملاحظة: التعديلات على البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة تبدأ أدناه.
  2. إدراج محولات i5 و i7 عبر PCR
    1. إعداد PCR mastermix قبل بيبيتينج الكواشف التالية في أنبوب لحجم وحدة التخزين المناسبة: 37.5 ميليلتر من Q5 Mastermix (جدول المواد، البند 1)، ميليلتر 6 من 10 ميكرون 16N i5 محولات (مفصلة في أسلوب 1، الخطوة 1.2.2)، ميليلتر 6 محولات i7 (استخدام مختلف i7 محولات لعينات منفصلة للإرسال المتعدد)، و 22 ميليلتر من ربط تمديد الحل مع حبات من الخطوة 2.1.3.
      ملاحظة: يستبدل Q5 Mastermix mastermix بوليميريز المقدمة من إيلومينا. بوليميراز Q5 يستفيض يفتت الجينوم مع الإخلاص أعلى وأقل أخطاء إدخال.
    2. قم بتشغيل برنامج بكر على cycler حرارية باستخدام المعلمات التالية: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية، 4 – 6 دورات من 10 s عند 98 درجة مئوية، 30 s في 66 درجة مئوية، 30 s عند 72 درجة مئوية؛ 2 دقيقة في 72 درجة مئوية، وعقد بعد ذلك في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: عدد الدورات يعتمد على حجم الفريق. من تجربتنا، بكر 4-دورة غير كافية إذا كان الفريق جين 1,500 عن أزواج مختلفة من الجينات أوليجوس محددة، بينما يتطلب فريقا مع أزواج 500-600 من أوليجوس 6 دورات PCR.
    3. تنظيف PCR التفاعلات مع حبات مغناطيسية (جدول المواد، البند 2): إضافة رد فعل PCR الخرز المغناطيسية في تفاعل PCR 1 معدلة: 0.75 حبة المغناطيسية نسبة:
      1. "الماصة؛" 56.25 ميليلتر من حل حبة المغناطيسي إلى ميليلتر 75 من منتجات PCR من الخطوة 2.2.2.
      2. نقل الخليط إلى أنبوب ملزمة منخفضة 1.5 مل.
      3. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً على الأقل 10 مرات.
      4. اترك الخليط الوقوف على درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      5. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسية. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو حتى المادة طافية واضح.
      6. إزالة المادة طافية.
      7. أغسل حبات مع 200 ميليلتر من الإيثانول 70%.
      8. احتضانها الإيثانول إزالة س. 30.
      9. كرر الخطوة يغسل الإيثانول مرة واحدة.
      10. أيردري الخرز.
      11. الوت مع 20 ميليلتر ddH2o.
  3. التحديد الكمي للمكتبات باستخدام منصة دبكر QX200.
    1. اتبع الخطوة 1.4 في الطريقة الأولى.
      ملاحظة: تم تطبيع جزيئات 4 مليون كل نموذج مكتبة4 في النتيجة الممثل (الشكل 2) بغية الحصول على يعني نظرية الجزيئات 7,042 فريد المفهرسة (4 مليون مقسوماً على أوليجوس الخاصة بالجينات 568).
  4. تضخيم وتطبيع المكتبات للتسلسل.
    1. تضخيم العدد المطلوب من الجزيئات باستخدام mastermix التالية لبكر النهائية التي يبلغ مجموعها 50 ميليلتر: 25 ميليلتر من Mastermix س 5، 2 ميليلتر من P5 التمهيدي (1 ميكرومتر)، 2 ميليلتر من التمهيدي P7 (1 ميكرومتر)، و 21 ميليلتر من جزيئات الحمض النووي.
    2. قم بتشغيل برنامج بكر على cycler حرارية باستخدام المعلمة التالية: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية؛ دورات 16 10 s عند 98 درجة مئوية، 30 s في 66 درجة مئوية، 30 ثانية عند 72 درجة مئوية؛ 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية؛ ثم اضغط على 4 درجة مئوية.
    3. تنظيف المكتبات التسلسل باستخدام الخرز المغناطيسي (جدول المواد، البند 2): إضافة رد فعل PCR الخرز المغناطيسية في تفاعل PCR 1 معدلة: 0.75 حبة المغناطيسية نسبة:
      1. "الماصة؛" ميليلتر 37.5 من حل حبة المغناطيسية في منتجات PCR 50 ميليلتر من الخطوة 2.4.2.
      2. نقل الخليط إلى أنبوب ملزمة منخفضة 1.5 مل.
      3. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً على الأقل 10 مرات.
      4. اترك الخليط الوقوف على درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      5. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسية. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو حتى المادة طافية واضح.
      6. إزالة المادة طافية.
      7. أغسل حبات مع 200 ميليلتر من الإيثانول 70%.
      8. احتضانها الإيثانول إزالة س. 30.
      9. كرر الخطوة يغسل الإيثانول مرة واحدة.
      10. أيردري الخرز.
      11. الوت مع 20 ميليلتر ddH2o.
    4. تشغيل قاسمة للحمض النووي التيد (~ 3 ميليلتر) في 2% [اغروس] هلام للتأكد من حجم أمبليكونس.
    5. قياس تركيز الحمض النووي (جدول المواد، البند 3) لتحديد تركيز المكتبات ECS منفصلة.
    6. تجمع المكتبات في المبالغ اكويمولار. الرجوع إلى الخطوة الأسلوب 1 1.5.6. والمناقشة أيضا لمزيد من التفاصيل حول تجميع.
    7. تقدم المكتبة ECS مجمعة في ما يقرب من 4 نانومتر.
    8. توفير الإعدادات التسلسل التالي لمنصات التسلسل إيلومينا (ميسيق أو هيسيق أو نيكستسيق): 2 × 144 إقران في نهاية ما يلي: 8 دورات 1 الفهرس ودورات 16 2 الفهرس.
  5. ECS بيوينفورماتيك تجهيز وتحليل
    1. الحصول على ما يلي: ديمولتيبليكسيد عينة من التسلسل أو أداء demultiplexing من ما يلي تسلسل الخام في عينات مختلفة باستخدام محول i7 متواليات بيوينفورماتيكالي مع برنامج نصي مخصص.
    2. تقليم قبالة النيوكليوتيدات أولاً 30 لكل عملية قراءة ديمولتيبليكسيد لإزالة تسلسل اليغو من الفريق الجينات.
    3. قم بمحاذاة القراءات التي تتقاسم أميس نفسه ببعضها لتكوين أسر القراءة.
      ملاحظة: استخدام الباحثين أومي علم البرمجيات مثل ماجيري13 لاستخراج أسر القراءة. وسمح لا مسافة hamming ضمن تسلسل أومي في هذه التجربة زيادة خصوصية الأسلوب.
    4. تؤدي إزالة الازدواجية وتصحيح الأخطاء باستخدام الإجراءات التالية الموصى بها معلمات.
      1. إيه فايف استخدام قراءة قراءة أزواج في نفس الأسرة. ويوصي بحد أدنى من ثلاثة أزواج القراءة.
      2. مقارنة النوكليوتيدات في كل موقف عبر كل القراءات في نفس الأسرة القراءة، وتولد من النوكليوتيدات توافق آراء إذا كان هناك 90 في المائة على الأقل مدى التطابق بين القراءات النوكليوتيدات خاصة. استدعاء N إذا كان هناك أقل من الاتفاق 90% لموقف النوكليوتيدات.
      3. تجاهل ما يلي: توافق الآراء أن يكون > 10% العدد الإجمالي لتوافق النيوكليوتيدات التي تسمى كنون.
    5. محاذاة كل القراءات توافق المحتفظ بها محلياً للجينوم المرجعية البشرية أما hg19 أو hg38 باستخدام aligner(s) الباحث المفضل مثل Bowtie2 والتحالف.
    6. عملية مواءمة ما يلي مع مبيليوب باستخدام معلمات – BQ0 – د 10,000,000,000,000 لإزالة التغطية العتبات لضمان نتيجة تصادم سليم بغض النظر عن VAF.
    7. تصفية المواقف مع أقل من 1000 x توافق قراءة التغطية.
      ملاحظة: الباحث يحدد الحد الأدنى من التغطية لكل موقف النوكليوتيدات تعسفاً، من المستحسن أن يكون مالا يقل عن 500 x توافق قراءة التغطية لتحليل المتلقين للمعلومات.
    8. استخدام التوزيع ذي الحدين لاستدعاء المتغيرات النوكليوتيدات واحدة (بطانات) في البيانات المحتفظ بها من الخطوة 2.5.7 مع المعلمات التالية. إحصاء ثنائي الحد سيستند نموذج الجينوم الخاصة بموقف خطأ. على كل موقع جينومي نسق بشكل مستقل في جمع معدلات الخطأ لجميع العينات لأن موقف معين. التالية سبيل المثال:
      احتمال النوكليوتيدات الشخصية في موقف معين الجينوم، ف
      مجموع RF2 البديل مجموع إجمالي كات بوي
      = 26/255505
      = 0.000101759
      الاحتمال ثنائي الحد من البديل 24 كات بوي خارج 35911 كات بوي المجموع، ف(X ≥ س) في عينة K
      = 1-binomial(24, 35911, 0.000101759)
      = 2.26485E-13
      ملاحظة: لكل وظيفة الجينوم وتساءل، سيكون هناك ثلاثة تغييرات حيث أمكن (أيA > T، A > C، A > ز)، وتمثل كل منها كخلفية قطعة أثرية. يتم الاحتفاظ بالأحداث الجسدية التي تختلف اختلافاً كبيرا عن الخلفية بعد تصحيح بونفيروني. في المثال الموضح في الجدول 1، كان عدد الفحوص التي أجريت 11، ومن ثم تصحيح بونفيروني فقيمه ≤0.00454545 (0.05/11) هناك حاجة لاستدعاء حدث إحصائيا هامة.
    9. أحداث جسدية مطلوبة لتكون حاضرة في كلا replicates من نفس العينة؛ وبخلاف ذلك، تعتبرها المغلوطة.

figure-protocol-16264
الجدول 1: على سبيل المثال تبين الطريق إلى بناء نموذج خطأ خاص بموقف ثنائي الحد.

3. لتصحيح خطأ في تسلسل الحمض النووي الريبي

  1. بالإضافة إلى تقييم للطفرات على مستوى الحمض النووي، دمج ECS مع الأفرقة تسلسل الحمض النووي الريبي المستهدفة المختلفة للكشف عن نسخة وفرة نادرة أو انخفاض في مستوى الحمض النووي الريبي. عن طريق الجمع بين ECS مع فريقي تسلسل الحمض النووي الريبي Qiagen الجاهزة، أثبتنا الكمي الرقمي للتعبير الجيني للنصوص مع عدد قليل من عشر نسخ دون حاجة إلى تطبيع ضد جين التدبير المنزلي. قد أدمجت أميس المطلوبة لتصحيح الخطأ في الفريق.
    1. أداء مجموع استخراج الحمض النووي الريبي (جدول المواد، البند 20).
    2. القيام بإعداد مكتبة ECS-الجيش الملكي النيبالي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (جدول المواد، البند 19).
    3. تنفيذ خط أنابيب المعلوماتية الحيوية وفقا 2.5.1–2.5.6 خطوة. 2 الأسلوب المبين في المقطع السابق. بعد خطوة 2.5.6، يمثل العدد من تمت محاذاته إلى توافق في الآراء على ما يلي كل الجينات مستوى تعبير الجينات دون الحاجة إلى تطبيع طول الجينات.

النتائج

مع تسلسل Targeted Error-Corrected للحمض النووي، ونحن قد أدوا دليلاً على مبدأ التجربة تمييع المريض متحولة الحمض النووي في الحمض النووي التجاري. كان المريض طفرة في GATA1 (chrX:48650264، ج > ز) مع VAF الأصلي من 0.19. ونحن تبين في الشكل 1 بأن ECS الكمية إلى مستوى المضيفين لمتغير واحد النوكليوتيدات.

figure-results-445
رقم 1: سلسلة تمييع الهولندية GATA1 يدل على أن ECS الكمية إلى مستوى المضيفين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ونحن أيضا إظهار أن ECS-الحمض النووي يكشف موثوق نادرة الطفرات الاستنساخ في الجينات متكرر في الكبار النقوي الحاد اللوكيميا (مكافحة غسل الأموال) في الأشخاص كبار السن الأصحاء4. حصلنا على معطف بافي عينات من الأشخاص الأصحاء 20 في "الدراسة الصحية" الممرضة راهن ~ 10 سنوات تقريبا. قمنا بتطبيق البروتوكول لوحة ECS-الحمض النووي في هذه العينات. لهذه التجربة، تكييف "إيلومينا تروست النقوي تسلسل الفريق" الذي يتكون من أمبليكونس 568 (مزيد من المعلومات حول قائمة الجينات في https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html) والتسلسل مكتبات 80 من 20 فردا (2 مجموعات في نقاط زمنية مختلفة، replicates 2 للفرد الواحد الوقت أشر) باستخدام منصة نيكستسيق إيلومينا، التي ولدت في متوسط من 47.7 مليون نهاية إقران يقرأ وفي متوسط 3.4 مليون لتصحيح الخطأ توافق الآراء تسلسلات كل المكتبة4. وكانت تغطية النوكليوتيدات يعني كل مكتبة تقريبا 6,000 x (3.4 ملايين مقسوماً على 568). لكل عينة، ونحن بناء الشخصية خطأ موقف محدد استخدام مكتبات المتتابعة التي ليست من نفس العينة. ووجدنا 109 الطفرات الجسدية الاستنساخ التي كانت موجودة في كلا replicates نقطة الوقت مجموعة واحدة على الأقل. هذه الطفرات قد تتراوح بين 0.0003-0.1451 VAF. علينا تحديد الطفرات 21 مع تمثيلات الكونية المعروفة، والتحقق من صحة جميع الطفرات 21 في واحد أو اثنين جمع الوقت نقطة (نقاط) باستخدام دبكر (n = 34، رقم 2، مقتبس من الشباب et al. عام 20164).

figure-results-2314
رقم 2: تم التحقق من الطفرات التي حددها ECS عبر دبكر مع فافس متطابقة جداً. (n = 34، تعديل من الشباب et al. عام 20164). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

فيما يتعلق بمستوى التعبير تصحيح الخطأ باستخدام بروتوكول ECS-الجيش الملكي النيبالي، نحن تخصيص لوحة جينات استخدام الكيمياء قياسيق التي تتكون من جينات 416 المعروف أن تترافق مع السرطان المختلفة (مقتبس من لوحة قياسيق الترنسكربيتوم السرطان البشري)، ونحن تضخيم إكسون أعرب الأكثر شيوعاً من مورثة معينة (قائمة الجينات في 1 المواد التكميلية). نحن متسلسلة في المكتبات باستخدام منصة مسك إيلومينا في تنسيق نهاية الاقتران الذي أعطى في متوسط 8.3 مليون ما يلي: كل مكتبة، وتمكنا من التقاط متوسط 0.417 مليون توافق الآراء لتصحيح خطأ في تسلسل. نحن أظهر أن مستوى التعبير نسخة وفرة منخفضة (< نسخة 1,000 العد في 50 نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي) تم استنساخه بدرجة عالية بين replicates (n نقطة بيانات = 300، الشكل 3). التحقق من الصحة التي دبكر (ستة الجينات المحددة لدرجات متفاوتة من التعبير) أظهر أن مستوى التعبير للجينات قد تم القبض على بشكل صحيح بموجب البروتوكول ECS دون الحاجة إلى تطبيع.

figure-results-3751
الشكل 3: أعلى، علاقة متبادلة محضر التهم ECS-الجيش النيبالي الملكي بين replicates من نفس العينة (ن = 300)- أسفل، نسخة تم التحقق من التهم التي حددها ECS دبكر (n = 6). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

هنا، علينا أن نبدي مجموعة من البروتوكولات لتصحيح خطأ في تسلسل التي يمكن تنفيذها بسهولة لدراسة الطفرات مع فافس منخفضة في أمراض مختلفة. أهم عامل هو إدماج UMIs مع كل جزيء قبل التسلسل كما أنها تمكين تصحيح الأخطاء من الخام على ما يلي. الأساليب الموصوفة هنا السماح للباحثين لإدماج أميس مخصصة للوحات الجينات المتاحة تجارياً والمصممة الذاتية الخاصة بالجينات أوليجوس.

بروتوكول قياسي خ ع يحول دون الكشف عن الطفرات مع VAF أدناه % 2 بسبب معدل خطأ في تسلسل، وهذا يحد من تطبيق خ ع في دراسات حاسمة فيها الكشف عن المتغيرات نادرة. بالتحايل على نسبة الخطأ خ ع القياسية، تمكن ECS الحساسة بكشف هذه المتغيرات الخام. على سبيل المثال، الكشف عن الطفرات المسببة للمرض عندما تنشأ هذه الطفرات أولاً (بعد ذلك VAF منخفضة) لا بد من إبلاغ التدخل المبكر ل المرض14،15. في أبحاث سرطان الدم، الكشف عن بقايا الحد الأدنى المرض (الخلايا ليوكيميك المتبقية بعد العلاج) يبلغ خطر التقسيم الطبقي، ويمكن أن تستخدم لإبلاغ خيارات العلاج بطريقة لا يمكن تدفق ثنائي سيتوميتريك الأنصبة المقررة. وباﻹضافة إلى ذلك، ECS قابلاً للكشف عن الحمض النووي ورم المتداولة وتقييم إمكانات المنتشر في مرضى الأورام الصلبة بتقييم للوجود/الغياب، فضلا عن عبء البديل لبعض الطفرات التي هي الصفات المميزة للمرحلة الابتدائية ورم16.

كما هو موضح في الجدول 1، السلطة من استخدام نموذج خطأ خاص بالموقف القائم على التوزيع ذي الحدين لاستدعاء المتغيرات يعتمد اعتماداً كبيرا على عدد المكتبات متسلسلة، فضلا عن عمق التسلسل المستخدمة لبناء نموذج خطأ. زيادة متانة نموذج خطأ مع عدد أكبر من العينات وعمق التسلسل أكثر. من المستحسن استخدام عينات متسلسلة على الأقل 10 بمعدل تغطية القراءة لتصحيح خطأ x 3000 كل عينة لبناء ملف خطأ لكل عينة. النهج الخاصة بموقف مشابه ماجيري، ولكن بدلاً من استخدام معدل خطأ الكلي لجميع أنواع مختلفة استبدال ستة (A > ج/تي > G، A > G/T > C، A > ترينيداد وتوباغو/> أ، ج > A/G > تي، ج > ز/ز > ج ، ج > T/G > A)13، نحن نموذج استبدال كل بشكل مستقل في كل موقف. على سبيل المثال، بمعدل خطأ ج > تي في موضع الجينوم محدد يختلف عن موقف آخر. نهجنا أيضا يأخذ في الاعتبار تأثير دفعي تسلسل، استبدال قاعدة المعدل الملاحظ في تشغيل تسلسل واحد قد يكون مختلفاً عن آخر تشغيل. وبالتالي من المهم أن نموذج كل موقف لكل استبدال أنواع خاصة عندما يتم تجميع عينات من تشغيل تسلسل مختلفة بناء النموذج.

هو أحد الاعتبارات هامة عند تصميم تجربة ECS عتبة الكشف المطلوب. جمال خ ع الدراسات أن يمكن قياسه بسهولة من حيث الجينات/أهداف الاهتمام وعتبة الكشف (تمليها عمق التسلسل)، وعدد من الأفراد وتساءل. على سبيل المثال، إذا كان مهتما الباحثون للعثور على الطفرات النادرة في أمبليكونس اثنين مع عتبة الكشف عن 0.0001، أنها تجمع أقصى 75 عينات في تسلسل واحد تشغيل باستخدام الكيمياء V2 مسك فيها نواتج القراءات يصل إلى 15 مليون (أمبليكونس 2 * 10,000 جزيئات * 10 ما يلي لتصحيح الخطأ * عينات 75 = 15 مليون ما يلي تسلسل). يمكن أن تختلف الباحثين عدد جزيئات الخوض في تسلسل أو عدد العينات المجمعة في تسلسل واحد تشغيل لضبط عتبة الكشف. في دراساتنا، نحن تهدف إلى إيجاد الطفرات مع عتبة كشف من VAF 0.0001 (01:10، 000) باستخدام لوحة إيلومينا الجينات. ونحن نستخدم بشكل روتيني 250 نانوغرام من ابتداء من الحمض النووي لضمان أن يتم التقاط جزيئات كافية بغية تحقيق عتبة الكشف المذكور آنفا. يمكن اختيار الباحثين تبدأ بمبلغ أقل من الحمض النووي (50 نانوغرام ينصح) إذا كان الحد المطلوب الكشف عن > 0.001 VAF.

كما يتم إلحاق أميس على الفهارس i5، إعدادات تسلسل يجب أن يعدل وفقا لذلك. على سبيل المثال، استخدمنا 16 "ن أميس"، وإعدادات التسلسل 2 × 144 نهاية الاقتران على ما يلي: 8 دورات 1 الفهرس ودورات 16 فهرس 2 بدلاً من المعتاد 8 دورات الفهرس 2. الزيادة في مؤشر 2 دورة عوضت انخفاضا في العدد الإجمالي للدورات المخصصة لعلى ما يلي. في حالة اختيار الباحثين لاستخدام 12N أميس10،17، ينبغي تغيير الإعدادات إلى دورات 12 من الفهرس 2.

هذا أسلوب التسلسل القائم على أومي هو الأمثل لتصحيح أخطاء التسلسل. ويبقى دون المستوى الأمثل في التعامل مع بكر جاكبوتينج، وقضية لكل أسلوب المستندة إلى التضخيم. أجرينا جولات من تسلسل بعد والمعلوماتية الحيوية وظيفة التحقق من صحة استخدام دبكر، ونحن يصعب الكشف عن أي إيجابيات كاذبة بسبب جاكبوتينج بكر. ومع ذلك، من المستحسن أن الباحثين بإجراء التجارب باستخدام بوليميريز عالية الدقة لضمان أخطاء التضخيم منخفضة.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن نشكر المشاركين في دراسة الأورام مجموعة AAML1531 للأطفال والممرضات "دراسة الصحة" لمساهماتها في شكل عينات المرضى. تم تمويل هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة (UM1 CA186107، RO1 CA49449 و RO1 CA149445) وجامعة "معهد واشنطن اكتشاف" الأطفال ومستشفى (MC-ثانيا-2015-461) سانت لويس للأطفال ومؤسسة اللوكيميا ماثيوز سيث إيلي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Q5 High Fidelity Hot Start Master MixNew England BioLabsM0492S
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32854
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102
Truseq Custom Amplicon Index KitIlluminaFC-130-1003
UMI i5 adapter sequencesIntegrated DNA Technologies-
NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BioLabsE7442S
NEBNext Ultra II Ligation ModuleNew England BioLabsE7595S
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-Rad1864034
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreenBio-Rad1864005
QX200 Droplet Digital PCR SystemBio-Rad1864001
ddPCR 96-Well PlatesBio-Rad12001925
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet GeneratorBio-Rad1864008
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet GeneratorBio-Rad1863009
BioanalyzerAgilent GenomicsG2939BA
TapeStationAgilent GenomicsG2991AA
TruSight Myeloid Sequencing PanelIlluminaFC-130-1010
Bowtie 2Johns Hopkins University-
Customized QIAseq Targeted RNA PanelQiagen-
Rneasy Plus Mini Kit (50)Qiagen74134

References

  1. Hoang, M. L., et al. Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).
  2. O'Roak, B. J., et al. Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations. Nature. 485, 246-250 (2012).
  3. Young, A. L., et al. Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing. Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).
  4. Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. NatureCommunications. 7, 12484(2016).
  5. Patel, J. P., et al. Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).
  6. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).
  7. Kohlmann, A., et al. Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease. Leukemia. 28, 129-137 (2014).
  8. Luthra, R., et al. Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring. Haematologica. 99, 465-473 (2014).
  9. Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).
  10. Schmitt, M., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).
  11. Vander Heiden, J. A., et al. pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires. Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).
  12. Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).
  13. Shugay, M., et al. MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing. PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480(2017).
  14. Wong, T. N., et al. Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia. Nature. 518, 552-555 (2014).
  15. Krimmel, J. D., et al. Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).
  16. Phallen, J., et al. Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA. ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415(2017).
  17. Egorov, E. S., et al. Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers. The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved