JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو رصد سبيكتروفوتوميتريكالي البلازما عبر غشاء الإلكترون النقل الاستفادة من المتقبلين للإلكترون خارج الخلية وتحليل التفاعلات الانزيمية التي قد تحدث مع هذه متقبلون الإلكترون خارج الخلية.

Abstract

البلازما عبر غشاء الإلكترون النقل (تبميت) يلعب دوراً في حماية الخلايا من الإجهاد التخفيض داخل الخلايا، فضلا عن الحماية من الأضرار بالخلية للتأكسد. هذه العملية لنقل الإلكترونات من تأشيب داخل الخلية إلى خارج الخلية للتأكسد ليست محددة تحديداً جيدا. هنا نقدم فحوصات سبيكتروفوتوميتريك من ميوتوبيس C2C12 لرصد استخدام متقبلون الإلكترون خارج الخلية تبميت: تيترازوليوم للذوبان في الماء الملح-1 (WST-1) و 2, 6-ديتشلوروفينوليندوفينول (دبيب أو دسيب). من خلال الحد من هذه متقبلون الإلكترون، نحن قادرون على مراقبة هذه العملية في تحليل في الوقت الحقيقي. مع إضافة الإنزيمات مثل اسكوربات أوكسيديز (AO) وفائق أكسيد الفاءق (الأحمق) إلى فحوصات، يمكننا تحديد أي جزء من تبميت هو سبب إنتاج التصدير أو فائق أكسيد اسكوربات، على التوالي. بينما أبدى WST-1 تحقيق نتائج مستقرة مع خلفية منخفضة، دبيب كانت قادرة على أن تكون إعادة المؤكسد بعد إضافة AO والهيئة العامة للسدود، الذي تجلى بتحليل سبيكتروفوتوميتريك. يوضح هذا الأسلوب مقايسة سبيكتروفوتوميتريك في الوقت الحقيقي، وكذلك متعددة، سريعة مع مزايا أكثر من الأساليب الأخرى المستخدمة لرصد تبميت، مثل سيانيد (فيكن) وتخفيض فيريسيتوتشرومي ج.

Introduction

قدرة تنقية البلازما الأغشية للحد من المتقبلين للإلكترون أدى إلى ت ري أن غشاء البلازما على قدرات الكامنة الأكسدة1. رأيت سابقا في الفطريات والنباتات، والحيوانات، تبميت عملية مشتركة بين الكائنات الحية متعددة2،3،،من45. على وجه التحديد، هذه العملية قد تجلى في Saccharomyces cerevisiae، الجزرة الخلايا والكريات الحمراء، لمفاوية، osteosarcoma، وسرطان الجلد، الضامة، والهيكل العظمى والعضلات والعدلات2،3، 4 , 5 , 6 , 7-يشارك في عملية نقل الإلكترونات عبر غشاء البلازما لتقليل المؤكسدات خارج الخلية، تبميت في العديد من الوظائف الخلوية بما في ذلك: الخلية النمو5،8، بقاء الخلية9، الحديد استقلاب10، الخلية إشارات11،،من1213، والحماية من الأكسجين التفاعلية الأنواع12،،من1415. بسبب المشاركة تبميت في العديد من الوظائف الخلوية، قد تم الافتراض باختلال تبميت للمساهمة في تطوير بعض الظروف الصحية الخطيرة، بما في ذلك السرطان16،17من أمراض القلب والأوعية الدموية، والتمثيل الغذائي متلازمة18.

هناك عدة طرق لمراقبة نقل الإلكترونات عبر غشاء البلازما، ولكن الأسلوب الأكثر استخداماً لتقييم الحد المتقبلين الإلكترون خارج الخلية عن طريق فحوصات اللونية. متقبلون الإلكترون خارج الخلية استخداماً هي أملاح تيترازوليوم ودبيب وفيكن وفيريسيتوتشرومي ج19،20. الملح tetrazolium الأكثر استخداماً معروف ملح من الجيل الثاني ك WST-119. هذا المركب أسهل لاستخدامها في فحوصات قياس الألوان مقارنة بالجيل الأول tetrazolium أملاح نتيجة الفريقين المشبعة بالفلور أوكتين، التي تزيد من القابلية للذوبان في الماء،21. WST-1، بالاشتراك مع ميثوسولفاتي فينازيني-1-ميثوكس يقبلون الإلكترون المتوسطة (مبمس)، يتم تقليل في اثنين واحد إلكترون نقل الأحداث. هذا الحد يتغير شكل WST-1 المؤكسدة ضعيفة الملون إلى20،فورمازان أكثر كثافة، والأصفر22. وقد WST-1 معامل انقراض مولى عالية 37 × 103 م-1سم-1، مما أدى إلى مقايسة عالية حساسية21،22. دبيب كما يستخدم يقبلون إلكترون خارج الخلية لمراقبة تبميت. فقد ثبت أنه يمكن تخفيض دبيب اكستراسيلولارلي من تبميت دون المساعدة من وسيط إلكترون متقبلون23،24. بسبب انعدام متقبلون إلكترون الوسيطة، دبيب يمكن مباشرة الإلكترونات البيك آب من غشاء البلازما، وعلى عكس WST-124. مشابهة دبيب، ثبت فيكن أن تقلص اكستراسيلولارلي إلى فيروسيانيد من تبميت دون المساعدة من وسيط إلكترون متقبلون19،24. على عكس WST-1 ودبيب، قد فيكن معامل انقراض مولى منخفضة مما يؤدي إلى حساسية فحص السفلي9. آخر يقبلون الإلكترون خارج الخلية المستخدمة عادة لرصد تبميت هو فيريسيتوتشرومي جيم على غرار WST-1، فيريسيتوتشرومي ج الحد من الزيادات باستخدام يقبلون الإلكترون المتوسطة، مبمس22. رغم ذلك، خلافا WST-1 الأسلوب ج فيريسيتوتشرومي أقل حساسية بسبب خلفية عالية ومعامل انقراض مولى منخفضا22.

هنا نقدم طريقة للتحليل في الوقت الحقيقي من تبميت عن طريق فحوصات سبيكتروفوتوميتريك. تستخدم الأسلوب متقبلون الإلكترون خارج الخلية WST-1 ودبيب، كلا منهما لديها معامل انقراض مولى عالية رغم كونها أقل تكلفة مقارنة بأخرى يشيع استخدامها متقبلون الإلكترون خارج الخلية مثل ج فيريسيتوتشرومي. يمكننا الاستفادة من فينازيني ميثوسولفاتي (PMS) بدلاً من مبمس لديهم التركيب الكيميائي مماثلة والدورة الشهرية أقل تكلفة بكثير. مبمس الهيدروكسى مستقرة وهو سمة هامة لمجموعة تجاري يحتاج إلى حياة طويلة الجرف. بيد أننا جعل الدورة الشهرية طازجة لكل فحص، حيث الاستقرار لا ينبغي أن يكون مشكلة. ونقدم أيضا وسيلة لتقييم التفاعلات الانزيمية الممكنة (انظر الشكل 1) بين يقبلون الإلكترون خارج الخلية والأنزيمات التي يمكن استخدامها لوصف عملية تبميت كذلك. على وجه التحديد، تحديد الإنزيمات AO والهيئة العامة للسدود يمكن أن تستخدم أي جزء من تبميت بسبب النقل اسكوربات أو الإفراج عن فائق أكسيد خارج الخلية، هما الأساليب الشائعة للإلكترونات بنقلها عبر غشاء البلازما.

Protocol

ملاحظة: انظر الشكل 1 نظرة تخطيطية للخطوات الرئيسية.

1-مقايسة الحد WST-1

  1. تنمو، والتفريق بين الخلايا C2C12 ملتصقة باستخدام الخلية القياسية الثقافة الإجراءات7 في صفيحة 96-كذلك استخدام الصفوف A-f.
    1. استخدام وسيلة تمايز تتألف من المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع مصل الحصان 2% و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 0.1 مغ/مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    2. عند رصد مشاركة اسكوربات في تبميت، الملحق وسائط التمايز مع 100 حمض الأسكوربيك ميكرومتر. السماح للخلايا لاحتضان في التمييز بين وسائل الإعلام ل ~ 24-48 h.
  2. إعداد المخزون الحلول WST-1 والدورة الشهرية.
    1. لجعل أسهم 10 مم WST-1، حل ز 0.033 WST-1 (وزن الصيغة (مهاجم): 651.34 g/mol) في 5 مل فوسفات مخزنة المالحة (PBS). مخزن في 4 درجات مئوية.
    2. جعل مخزون 5 مم من الدورة الشهرية، حل 0.0023 ز من الدورة الشهرية (مهاجم: 306.34 g/mol) في 1.5 مل من منزوع ح2س (diH2س). تخزين في-20 درجة مئوية، وحماية من الضوء.
  3. إضافة 0.0108 ز الجلوكوز لتركيز نهائي من 5 مم إلى 11.4 مل من برنامج تلفزيوني أو حبيس مخزنة المالحة (ميزانيات؛ 20 مم حبيس الصوديوم الملح 140 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 2.5 مم MgSO4، 1 مم كاكل2). إضافة ميليلتر 480 ملم 10 WST-1 لتركيز نهائي من 400 ميكرون وميليلتر 48 مم 5 الدورة الشهرية لتركيز نهائي من 20 ميكرومتر.
  4. عند رصد مشاركة اسكوربات في تبميت، تقسيم الحل إلى اثنين 6 مل مختبرين. إلى قاسمة واحد، إضافة 6 ميليلتر من diH2س وإلى قاسمة الأخرى إضافة ميليلتر 6 2 كو/مل AO لتركيز نهائي 2 يو/مليلتر.
  5. عند رصد مشاركة دِيسمُوتاز في تبميت، تقسيم الحل إلى اثنين 6 مل مختبرين. قاسمة واحد، أضف ميليلتر 55 م 0.1 مشرف4 المخزن المؤقت وإضافة إلى قاسمة الأخرى ميليلتر 55 6.5 كو/مل الأحمق لتركيز نهائي من 60 يو/مليلتر.
  6. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. نضح وسائط الإعلام وإضافة 150 ميليلتر PBS. ثم نضح برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: يتم المقايسة مع خلايا مطلي، المرفق. وهكذا، لا يوجد الطرد المركزي أو استخدام التربسين في عملية الغسيل.
  7. إضافة 100 ميليلتر من WST-1 الحل (-) الهيئة العامة للسدود أو (-) AO لأعمدة 1-6 وإضافة 100 ميليلتر حل WST-1 (+) الهيئة العامة للسدود أو (+) أو إلى أعمدة 7-12 في لوحة 96-جيدا. استخدام الصفوف زاي وحاء كعناصر أساسية (أي، لرصد التغير في امتصاص في الكاشف وحدها في الآبار دون الخلايا).
  8. قياس امتصاص القيم باستخدام جهاز المطياف الضوئي كل 10 دقيقة ح 1 في 438 شمال البحر الأبيض المتوسط.
  9. بعد القراءة، نضح وسائط الإعلام وتغسل كل جيدا مع 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم نضح برنامج تلفزيوني.
  10. حساب التغير في امتصاص لكل بئر بطرح امتصاص الأولية لبئر من امتصاص في أي وقت لذلك جيدا. تصحيح هذا التغيير من أجل التغيير في امتصاص (أن وجدت) التي لوحظت في الآبار الخلفية (أي، الآبار مع الحل المقايسة ولكن أي من الخلايا).
  11. للتحليل، تطبيع البيانات امتصاص لقياس التحكم 60 دقيقة أو غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني أو ميزانيات وثم إجراء مقايسة (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك على بروتين.
  12. إضافة مستوى ألبومين المصل البقري (BSA) 2 مغ/مل (تتراوح بين 0.5-2 ميليلتر للمنحنى المعياري، تبعاً لدرجة التقاء الخلايا) إلى الآبار فارغة (الصفوف زاي وحاء)، ثم إضافة الكاشف اتفاق التعاون الأساسي لجميع الآبار.
  13. التحديد الكمي للبيانات عن طريق نمول WST-1 تخفيض كل ميكروغرام من البروتين. استخدام 37 مم-1 سم-1 22 كمعامل الانقراض WST-1 انخفاض في 438 شمال البحر الأبيض المتوسط.

2-دبيب مقايسة الحد

  1. تنمو، والتفريق بين الخلايا C2C12 ملتصقة بنفس إجراء الخطوة 1، 1.
  2. إعداد المخزون 10 مم دبيب الحل كما يلي. حل ز 0.029 من دبيب (مهاجم: 290.08 g/mol) في 10 مل من diH2O. تأكيد تركيز دبيب بقياس امتصاص 600 نيوتن متر مع جهاز المطياف الضوئي. استخدم 1 مم-1 سم-1 23 كمعامل الانقراض دبيب انخفاض 600 نانومتر. مخزن في 4 درجات مئوية.
  3. إضافة 0.0108 ز الجلوكوز لمل 11.880 من برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي من 5 ملم. إضافة ميليلتر 120 ملم 10 دبيب لتركيز نهائي من 100 ميكرومتر.
  4. عند رصد مشاركة اسكوربات في تبميت، تقسيم الحل إلى اثنين 6 مل مختبرين. إلى قاسمة واحد، إضافة 6 ميليلتر من diH2س وإلى قاسمة الأخرى إضافة ميليلتر 6 2 كو/مل AO لتركيز نهائي 2 يو/مليلتر.
  5. عند رصد مشاركة دِيسمُوتاز في تبميت، تقسيم الحل إلى اثنين 6 مل مختبرين. قاسمة واحد، أضف ميليلتر 55 م 0.1 مشرف4 المخزن المؤقت وإضافة إلى قاسمة الأخرى ميليلتر 55 6.5 كو/مل الأحمق لتركيز نهائي من 60 يو/مليلتر.
  6. نضح وسائط الإعلام وغسل الخلايا في 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميليلتر من دبيب الحل (-) الهيئة العامة للسدود أو (-) AO لأعمدة 1-6 وإضافة 100 ميليلتر من دبيب الحل (+) الهيئة العامة للسدود أو (+) أو إلى أعمدة 7-12 في لوحة 96-جيدا. استخدام الصفوف ز وإرادة ح كعناصر أساسية (أي، لرصد التغير في امتصاص في الكاشف وحدها في الآبار دون الخلايا).
  7. قياس امتصاص في 600 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي كل 10 دقيقة حاء 1 قياس التغير في امتصاص نسبة إلى عنصر التحكم في 60 دقيقة مشابهة للخطوات 1، 1، 9-13.

3-تحديد عما إذا المتقبلين للإلكترون المخفضة من ركائز AO أو أبله

  1. إلى 5.436 مل من برنامج تلفزيوني أو ميزانيات، إضافة ميليلتر 240 ملم 10 WST-1 لتركيز نهائي من 400 ميكرون وميليلتر 24 مم 5 الدورة الشهرية لتركيز نهائي من 20 ميكرومتر.
    1. دبيب، إضافة 60 ميليلتر من 10 مم دبيب، لتركيز نهائي من 100 ميكرومتر، لمل 5.940 من برنامج تلفزيوني أو ميزانيات.
  2. إضافة 100 ميليلتر لإيجاد حل لكل الخير في لوحة مسطحة القاع 96-جيدا في غياب الخلايا وقياس امتصاص في جهاز المطياف الضوئي في 438 شمال البحر الأبيض المتوسط، ل WST-1، أو 600 نانومتر، دبيب.
  3. إضافة 1 ميليلتر من اسكوربات 10 ملم إلى نصف الآبار لتركيز نهائي من 100 ميكرومتر. مراقبة امتصاص حتى أن يستقر.
  4. عند التثبيت، إضافة 1 ميليلتر من 200 يو/مليلتر AO لتركيز نهائي 2 يو/مليلتر لكل بئر أو إضافة 1 ميليلتر من 6 كو/mL الأحمق لتركيز نهائي من 60 يو/مليلتر لكل خير ورصد امتصاص ح 1.

النتائج

إحصاءات أجريت مع ANOVA مع التدابير المتكررة باستخدام البرمجيات الإحصائية RStudio25. يتم الإشارة إلى أحجام العينات في أساطير الرقم.

واستخدمت لرصد تبميت، ميوتوبيس C2C12 جنبا إلى جنب مع الإلكترون خارج الخلية المتقبلين، WST-1 ودبيب. AO واست...

Discussion

وقد قدمنا طريقتين لاستخدام متقبلون الإلكترون خارج الخلية، WST-1 ودبيب، في فحوصات سبيكتروفوتوميتريك لرصد تبميت في ميوتوبيس C2C12. مع نمو خطوط الخلايا في الإجراءات القياسية الثقافة وقارئ لوحة جهاز المطياف الضوئي، من الممكن رصد تبميت مع هذه متقبلون إلكترون في مقايسة ميكروسكوبية بسيطة. WST-1 الحد ...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونود أن أشكر بيل توماس، لين ماتاتهيل ومارك مانينو ونج باتل لتقديم الدعم التقني لهم. وأيد هذا العمل جائزة "الخدمة الصحية العامة في الولايات المتحدة" R15DK102122 من المعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي وأمراض الكلي (NIDDK) لجوناثان فيشر. محتوى المخطوطة هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية نيدك أو "المعاهد الوطنية للصحة".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
C2C12 myoblastsAmerican Type Culture Collection CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucoseSigmaD6046
Fetal Plex animal serum complexGemini Bio-Products 100-602
penicillin-streptomycinSigma516106
horse serumGibco Technologies16050-130
Dulbecco's phosphate buffered salineSigmaD8537
trypsin-EDTASigmaT4049
15 cm culture dishesTPP93150
96 well culture platesTPP92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
phenazine methosulfate SigmaP9625
L-ascorbic acidSigmaA5960
ascorbate oxidase SigmaA0157
superoxide dismutase SigmaS5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt ICN Biomedicals215011825
D-(+)-glucoseSigmaG7528
HEPES sodium saltSigmaH3784
sodium chlorideSigmaS7653
potassium chlorideFisher Scientific BP366
magnesium sulfate heptahydrateSigmaM5921
calcium chloride dihydrateSigmaC7902
potassium phosphateFisher Scientific BP363
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Powerwave X-I spectrophotometerBiotek Insturmentsdiscontinued 
Spectronic Genesys 5 SpectrophotometerThermo Scientific336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterileMidSci781602
Iron (II) chloride tetrahydrateSigma220299
Iron (II) sulfate heptahydrateSigma215422
hypoxanthineSigmaH9636
xanthine oxidaseSigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Insturmentsdiscontinued 

References

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234, 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. . . R: A language and environment for statistical computing. , (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135 WST 1 C2C12

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved