العميق "الجلد حقن كنموذج" "عدوى الجلد" المبيضات البيض "التحليل النسيجي"

Summary

هنا يمكننا وصف بروتوكول يسمح للتحليل النسيجي والجزيئية لعينات الجلد بعد الحقن داخل الأدمة المبيضات البيض . هذا البروتوكول يحافظ على السلامة الهيكلية للجلد ويسمح بإضفاء الطابع المحلي على الخلايا المناعية المقيم في الأنسجة أو المعينين حديثا، فضلا عن توزيع الممرض.

Abstract

الجلد هيئة موسعة جداً للجسم، وسبب هذا السطح كبيرة، يتعرض باستمرار للكائنات الحية الدقيقة. يمكن أن يؤدي تلف الجلد بسهولة للإصابة بالعدوى في الأدمة مما يؤدي بدوره إلى نشر مسببات الأمراض إلى مجرى الدم. فهم كيف يحارب الجهاز المناعي العدوى في مرحلة مبكرة جداً، وكيف المضيف يمكن القضاء على مسببات الأمراض خطوة هامة لتعيين القاعدة للتدخلات العلاجية في المستقبل. هنا يصف لنا نموذجا لعدوى المبيضات البيض التي يمكن تصور العمليات التي تحدث مبكرا أثناء عدوى، بما في ذلك عند الممرض اجتاز الحاجز الظهارية، فضلا عن الاستجابة المناعية وأثارت قبل المبيضة الغزو. استخدمنا هذا النموذج الإصابة لإجراء تحاليل نسيجية تظهر الخلايا المناعية التي اختراق الجلد، فضلا عن وجود وإضفاء الطابع المحلي على مسببات المرض. جمع عينات بعد العدوى يمكن معالجتها لاستخراج الحمض النووي الريبي.

Introduction

جسم الإنسان مغطى عددا كبيرا جداً من الكائنات الحية الدقيقة. سطح الجلد هو موئل البكتيريا تقريبا 1 مليون كل سنتيمتر مربع¹. ومع ذلك، لا يعكس هذا العدد، مجموعة كاملة من الكائنات المجهرية التي كولونيزيس الجلد. بالإضافة إلى البكتيريا، هو جسم الإنسان استعمر العديد من الأنواع الفطرية، بما في ذلك المبيضة، التي قادرة على البقاء على قيد الحياة في الأغشية المخاطية و الجلد المستوى²على حد سواء.

في السنوات الأخيرة، زادت النسبة المئوية للمصابين بالأمراض الفطرية هائلا. وهذا يرجع أساسا إلى ارتفاع عدد الأشخاص المناعة، أي، مرضى فيروس نقص المناعة البشرية والمرضى التي مرت بالعلاج الكيماوي أو الأدوية المثبطة للمناعة بعد زرع³. وفي مراقبة دراسة أجريت في الولايات المتحدة، أظهر ويسبلينغوف et al. أن 9.5% التهابات مجرى الدم في المستشفيات سببها المبيضات الأنواع⁴. بسبب زيادة حدوث الأمراض الفطرية، ولا سيما بسبب النسبة المئوية المرتفعة من المبيضات الأنواع التي تم العثور عليها أثناء التهابات مجرى الدم، فهم كيف يهرب هذا الممرض عنصر التحكم في الجهاز المناعي الغاية الهام.

المبيضة هو فطر ديمبرافيك الذي ينمو في مختلف الأشكال المورفولوجية مثل الخميرة، بلاستوسبوريس، بسيودوهيفاي، وخيوط فطرية تبعاً للظروف البيئية⁵. في شكله أصله، يظهر قدرته اختزاع أعلى المبيضة ولديه القدرة على اختراق ظهارة⁶.

وقد درست التهابات المبيضة باستخدام العديد من الطرق التجريبية. النموذج الأكثر شيوعاً للإصابة هو الحقن الوريدي من خميرة المبيضة ⁷. ومع ذلك، هذا النموذج لا تراعي جميع العمليات التي يحدث قبل تمكن الفطريات تنتشر في مجرى الدم. نموذج آخر يستفيد من قدرة المبيضة على غزو الظهارة. هذا الأسلوب، المعروف أيضا الرمل ورقة النموذجي⁸، وقد وضعته جاسبارى et al. في عام 1998⁹، ويتكون من استخدام ورق الرمل كشط الجلد، وبالتالي القضاء على الطبقة القرنية قبل تطبيق المبيضة. يسمح هذا الإجراء الفطريات لاختراق الظهارة، مما يتيح تحليل قدرات الغازية من مسببات هذا المرض. وأخيراً، قد استخدمت نماذج أخرى من الالتهابات المعوية¹⁰ والمسالك التنفسية¹¹ في دراسات مختلفة.

تشكيل الجرح (كما هو الحال في نموذج ورقة الرمال) يؤدي تفعيل مسارات عدة، بما في ذلك تجنيد الخلايا المناعية والتنشيط، بغية تعزيز عملية الشفاء¹². هذا يمكن تغيير أو قناع الاستجابة المناعية تحديداً أثارت ضد مسببات المرض، مما يؤدي إلى التباس النتائج.

هنا يصف لنا طريقة العدوى الجلدية التي تتجنب الجرح الأولى تشكيل وتنظيم دورات تعريفية لبيئة تحريضية القاعدية. للحفاظ على هيكل الظهارية سليمة، مباشرة حقن المبيضة في شكله أصله في ديرما العميق. على الرغم من أن حقنه واحدة يمكن أن تثير التهاب معتدل، مقدار التهاب محدودة ومقيدة بالمقارنة إلى تشكيل جرحا مفتوحاً كما هو الحال في نموذج ورقة الرمل. أن النهج الذي يصف لنا هنا يتيح دراسة الاستجابة المناعية الفطرية وانتشار مع تجنب البيئة التحريضية المفرطة والموجودة من قبل بسبب الأضرار الميكانيكية.

Protocol

جميع الإجراءات التي كانت وافقت تحت "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) وتعمل تحت إشراف وزارة "الموارد الحيوانية" في الأطفال في مستشفى (قوس) في مستشفى بوسطن "الأطفال" أو أقرها الإيطالية وزارة الصحة والمضطلع بها في إطار "اللجنة الرعاية المؤسسية الحيوان" في جامعة ميلانو-بيكوكا.

1. إعداد المبيضة

1. ثقافة البيض جيم، سلالة CAF3-1¹³في أنابيب تحتوي على الغنية المتوسطة (الخميرة استخراج ببتون الدكستروز (ييبد)، واستخراج الخميرة 1% (w/v)، 2% (w/v) من بكتو ببتون، الجلوكوز 2% (w/v)) وتستكمل مع أردين (50 مغ/لتر) عند 25 درجة مئوية. في ظل هذه الظروف، ينمو المبيضة كخميرة.
   ملاحظة: سلالات المبيضة أخرى يمكن استخدامها، مثل عزل السريرية المبيضة سلالة SC5314¹³. منذ أظهرنا مؤخرا أن عملية التقرحي هو الناجم عن تفعيل نظام المناعة الفطرية¹⁴، كل سلالة المبيضة الذي يحافظ على كل من مكونات جدار الخلية وهيكلها، نظرياً، فضلا عن ويمكن استخدام القدرة على إسقاطات أصله، تنشأ.
2. رصد الثقافة عن طريق العد تركيز الخلوي استخدام محلل عداد خلية.
3. حصاد الثقافة عندما يصل إلى تركيز من حوالي 8 × 10⁶ خلايا/مل. بدلاً من ذلك، استخدم جهاز المطياف الضوئي قياس OD₆₀₀.
   ملاحظة: عادة، قيمة OD₆₀₀ = 1 يتوافق مع تركيز خميرة 3 × 10⁷ خلايا/مل، ولكن ينصح بالمعايرة.
4. ريسوسبيند الثقافة في المتوسط ييبد-أردين، استخدام حبيس (50 ملم، ودرجة الحموضة 7.5) كعامل المخزن مؤقت واحتضان الثقافة في 37 درجة مئوية للحث على تشكيل خيوط فطرية. تحقق من تكوين أصله تحت مجهر في 100 X التكبير. تشكيل أصله ح 5 مرئية بعد استزراع في 37 درجة مئوية؛ ومع ذلك، استخدام الخلايا ح 16 بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية عندما تصل نسبة أصله إلى تقريبا 95% من مجموع الثقافة.
5. لإثراء التحضير في تركيز أصله، مختبرين للطرد المركزي للثقافة في 3,300 س ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في برنامج تلفزيوني العقيمة بتركيز 1 × 10⁸ خيوط فطرية مليلتر.

2-عمق الجلد حقن

1. 24 ساعة قبل الإجراء العدوى، تخدير الفئران مع حقن داخل الكيتامين (80-100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ)، ويحلق ثم الجناح الفئران باستخدام ماكينة كهربائية.
   ملاحظة: بعد أي إجراء ينطوي التخدير، مكان الفئران تحت مصباح تدفئة حتى أنهم استعادوا كفاءة.
2. بقية الفئران ل 24 ساعة لتجنب أي التهاب بسبب عملية الحلاقة.
3. 24 ساعة بعد إجراء الحلاقة، تخدير الفئران مع حقن داخل الكيتامين (80-100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ).
4. تحقق منعكس مخلب لضمان أن يتم تخديره الفئران عميق. تقييم منعكس مخلب معسر بحزم مخلب. إذا تحققت في التخدير، الحيوان لا يشعر بالألم ولا تتحرك.
5. حقن خيوط فطرية المبيضة في ديرما العميقة باستخدام حقنه الأنسولين 0.3 مل بإبرة 30 × 8 مم في وحدة تخزين نهائي 50 ميليلتر/الحقن، الموافق 5 × 10⁶ خيوط فطرية/الحقن.
   1. سحب جلد الجناح حلق مشدود استخدام اصبعين بغية إدخال وحدة التخزين مباشرة في ديرما العميق. أدخل الإبرة بزاوية من 10-15 درجة مئوية مع المجسم مشطوف الحواف الإبرة مواجهة.
   2. مع هذه الزاوية، سيتم حقن الممرض بعمق حوالي 300-500 ميكرون. لضمان الحقن تتم جيدا، التحقق من أن أشكال حجم حقن عثرة هو استيعاب بضع دقائق بعد الحقن.
      ملاحظة: تشكل عثرة بعد سيتم ضخ حوالي 1 سم². وهذا هو المجال الذي سيتم إزالة عند نقطة زمنية المعينة للتحليل الجزيئي أو النسيجي.
   3. للنقاط الزمنية أقل من 24 ساعة (مستحسن) علامة منطقة الإصابة بقلم ماركر، منذ عثرة شكلت مع الحقن استمرت لبضع دقائق، بعدها يتم امتصاصه. للنقاط الزمنية 24 ساعة أو أكثر، هذه الخطوة غير مطلوبة، لأنه سيكون أما من قرحة أو كيسه مرئية بوضوح.

3-عينة من جمع وإعداد لتلطيخ نسيجية

1. Euthanize الفئران وفقا للإجراءات المؤسسية.
2. استخدام الملقط الجراحي، سحب الجلد عند الحدود لحقن الموقع، قبل وضع علامة بقلم ماركر. باستخدام مقص جراحي، المكوس الموقع المصابة بقطع الجلد بعد السطر ملحوظ.
   ملاحظة: كن حذراً لفصل الجلد من الصفاق استخدام مقص نصيحة جولة.
3. تزج الجلد في قالب قاعدة المتاح مليئة بالقطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مركب، مع الجانب الداخلي من الجلد مواجهة. تجميد العينة في النتروجين السائل حتى يصبح أبيض المجمع. لا تدع النيتروجين السائل تغطية العينة قبل أنها مجمدة تماما، وهذا من شأنه أن يضر العينة.
   ملاحظة: تنبيه! خلال الخطوة 3.3، ارتداء درع وجه للحماية من النتروجين السائل.
4. إذا لم يتم استخدام العينات فورا لإعداد الشرائح، سرعة تخزينها في-80 درجة مئوية.
   ملاحظة: نماذج يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.

4-إعداد الشرائح

1. قص العينة في نصف إعداد الشرائح للأنسجة ابتداء من مركز العينة.
2. قص 5-ميكرومتر شرائح سميكة مع كريوستات.
   ملاحظة: لعينات الجلد، درجة حرارة كريوستات لا ينبغي أعلى من-25 درجة مئوية. درجة حرارة أعلى سيؤدي إلى ذوبان جزئي من ح-OCT و ولذلك لا تبقى العينات في الموقف الصحيح أثناء إجراء قطع.
3. استخدام شرائح المجهر مشحونة بشكل إيجابي إلى جمع الشرائح.
4. إذا لم يتم استخدام الشرائح التي تم جمعها بعد الإعداد، تخزينها في-20 درجة مئوية. عند هذه النقطة، يمكن تخزين الشرائح في-20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.

5-توضع & ويوزين تلطيخ

1. وصمة عار الشرائح بالانغماس في توضع في جيل لدقيقة 4 يغسل الشرائح في إدارة مياه الحنفية لمدة 5 دقائق.
2. وصمة الشرائح بالانغماس في الحل ثم Y للحد الأدنى 1 يغسل الشرائح في إدارة مياه الحنفية لأدنى 5 شطف الشرائح باستخدام الماء المقطر قبل المتابعة في البروتوكول.
3. يذوي بالانغماس في التسلسل التركيزات المتزايدة لحلول الإيثانول (50%، 70%، 80%، 95%، 100%). تزج الشرائح لمدة 15 ثانية في كل حل الإيثانول.
4. مسح الشرائح لمدة 2 دقيقة على الأقل بالانغماس في عامل تطهير غذائها.
5. جبل الشرائح باستخدام المتوسطة المتصاعدة وكشوف الغطاء.
6. الحصول على صور الشرائح مع الماسح ضوئي شريحة مجهر تكبير X 40.

6-حمض الدوري-Schiff (PAS) تلطيخ

1. إصلاح الشرائح مع الأسيتون % ≥99.5 في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 1 يغسل الشرائح في إدارة مياه الحنفية لمدة 1 دقيقة.
2. وصمة عار الشرائح بالانغماس في حل حامض الدوري (1 غ/دل) لأدنى 5 يغسل الشرائح في التغييرات 3 من الماء المقطر.
3. وصمة عار الشرائح بالانغماس في شيف لكاشف عن 15 دقيقة يغسل الشرائح في إدارة مياه الحنفية لمدة 5 دقائق.
4. وصمة عار الشرائح بالانغماس في توضع في جيل للحد الأدنى 5 يغسل الشرائح في إدارة مياه الحنفية لمدة 30 ثانية.
5. يذوي الشرائح بالانغماس في التغييرات 3 من الإيثانول 100%. تزج الشرائح لمدة 15 ثانية في كل مرة.
6. مسح الشرائح لمدة 2 دقيقة على الأقل بالانغماس في عامل تطهير غذائها.
7. جبل الشرائح باستخدام المتوسطة المتصاعدة وكشوف الغطاء.
8. الحصول على صور الشرائح مع الماسح ضوئي شريحة مجهر.

7-عينة من جمع وإعداد لاستخراج الحمض النووي الريبي

1. Euthanize الفئران وفقا للإجراءات المؤسسية. إزالة عينات الجلد كما هو الحال في الخطوة 3، 2.
2. تزج العينات في أنبوب المفاجئة-كاب 2 مل مع 1 مل كاشف لاستخراج ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم حمض جوانيدينيوم.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا ويمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية.
3. قطع العينة إلى قطع حوالي 0.2 سم² استخدام الملقط الجراحي.
   ملاحظة: تنبيه! معظم الكواشف لعزل الحمض النووي الريبي من السمية ومطفره. خطوات 7.3 و 7.4 يجب أن يتم تحت غطاء دخان.
4. تحطيم العينة مع طاحونة حبة بسرعة ذبذبات/s 20 عن 20 دقيقة بدلاً من ذلك، يمكن استخدام بوتر ميكانيكية.
5. فحص تجانس العينات الفعالة التي تبحث عن وجود أجزاء سليمة من الجلد. كرر هذه الخطوة إذا لم يتم تجانس العينات تماما.
6. الطرد المركزي هذه العينات في س 16,000 ز 1 دقيقة تبقى سوبيرناتانتس لاستخراج الحمض النووي الريبي وتجاهل بيليه. يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة الشعر والحطام التي يمكن أن تمنع استخراج الأعمدة.
7. المضي قدما في استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي الريبي تنقية الأعمدة¹⁴.
8. استخدام جهاز المطياف الضوئي تقييم تنقية الحمض النووي الريبي وتركيز. إذا لم يتم استخدام مقتطفات الحمض النووي الريبي فورا لإعداد كدنا، تخزين العينات في-80 درجة مئوية.

النتائج

عن طريق حقن الممرض مباشرة في ديرما العميقة، يظل مورفولوجية الأنسجة الهيكلية سليمة (الشكل 1A).

الحفاظ على سلامة الجلد الهيكلي يتيح الكشف عن الخلايا المناعية وعلى التعريب في الموقع الإصابة. التكبير أعلى هو مبين في

Discussion

هنا يمكننا وصف أسلوب الإصابة المبيضة لدراسة عملية التحريضية التي يتم تهيئتها عند مدخل الفطرية في ديرما العميق.

على الرغم من أن تكوين خراج الجلد حدث نادر نسبيا عند الإصابة المبيضة ¹⁵، حقن الفطر مباشرة في ديرما عميق يسمح ليس فقط دراسة تشكيل الخراج يحركه?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998