اتباع نهج موائع جزيئية المستندة إلى الحبرية والتضخيم ميكروسفيري-بكر للحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل أمبليكونس

Summary

هذا العمل يوفر طريقة لتصنيع الأنظمة الأساسية المستندة إلى الحبرية موائع جزيئية وتطبيق polyacrylamide الجزئي المجالات الخرز الصغير للتضخيم بكر ميكروسفيري. طريقة PCR ميكروسفيري يجعل من الممكن الحصول على أمبليكونس الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل دون فصل الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل.

Abstract

ميكروفلويديكس المستندة إلى الحبرية تمكين موثوق بها إنتاج متجانسة الجزئي المجالات الخرز الصغير في قناة موائع جزيئية، وتوفير المساحة الخاضعة للرقابة ومورفولوجية ميكروسفيري التي تم الحصول عليها. ميكروسفيري كوبوليميريزيد مع تحقيقا أكريديتي-الحمض النووي كانت مختلقة بنجاح. يمكن استخدام أساليب مختلفة مثل اللامتكافئ بكر والهضم [ااكسونوكلس] وعزله على المغلفة ستريبتافيدين المغناطيسي الخرز لتوليف الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل (سدنا). ومع ذلك، هذه الأساليب لا يمكن أن كفاءة استخدام كميات كبيرة من ssDNA تنقية عالية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول ميكروسفيري-بكر بالتفصيل كيف سدنى يمكن أن تكون كفاءة تضخيم وفصلها عن دسدنا ببساطة عن طريق بيبيتينج من أنبوب تفاعل PCR. يمكن تطبيق تضخيم ssDNA الكواشف المحتملة لمصفوفة دنا والحمض النووي-سيليكس (تطور منهجي من يغاندس بتخصيب أسي) العمليات.

Introduction

واحد--الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (سدنى) على نطاق واسع واعتبرت كعنصر التعرف جزيئي (مخاطر) بسبب خصائصه الجوهرية للحمض النووي DNA التهجين^1،2. يمكن أن يؤدي تطوير النظم الاصطناعية ssDNA للتطبيقات البيولوجية مثل الحمض النووي [ميكروارس]³، أوليجوثيرابيوتيكس، والتشخيص، والاستشعار الجزيئية متكاملة تستند إلى تفاعلات مكملة^4،5.

وحتى الآن، جزيئات البوليمر ميكرومتر-مقياس تم بنجاح أثبتت استخدام أجهزة موائع جزيئية. العديد من التقنيات موائع جزيئية قد ثبت أن تكون قوية لإنتاج عالية متجانسة الجزئي المجالات الخرز الصغير على التدفق المستمر في^6،البيئة microchannel⁷.

في دراسة لي et al. وذكر ⁸، منصة المستندة إلى الحبرية موائع جزيئية لتوليف موائع جزيئية كوبوليميريزابل اليغو-ميكروسفيري وسدنا التضخيم. منهاج موائع جزيئية تتكون من طبقتين PDMS (بولي دايمثيل سيلوكسان): جزء العلوي مع شبكة قناة موائع جزيئية لتوليد ميكروسفيري ومن أسفل جزء مسطح. وهذه تتألف من ثلاثة أنواع من قنوات فلويديك PDMS: 1) تدفق تركز القناة لتوليد الحبرية و 2) قناة السربنتين لخلط الحلين 3) قناة بلمرة متسلسل للتصلب ميكروسفيري. حالما يتم إدخال تدفقين قابلة للامتزاج في قناة فلويديك PDMS واحدة، يمكن أن يجبر التدفقات من خلال هيكل الفوهة الضيقة. سلوك تدفق مثل الهندسة القناة، ومعدل التدفق، واللزوجة تؤثر على حجم ومورفولوجية ميكروسفيري. ولذلك، يمكن تقسيم التيار الرئيسي السائل microscale مونوسفيريس^9،10.

هنا، يتم توفيرها بروتوكول بكر ميكروسفيري مفصلة لتضخيم سدنى. أولاً، يتم وصف عملية تصميم الأجهزة المستندة إلى الحبرية موائع جزيئية. ثم، هو شرح الطريقة في بولياكريلاميدي التي يمكن فونكتيوناليزيد الجزئي المجالات الخرز الصغير مع قالب الحمض النووي عشوائية بطريقة متكاملة. وأخيراً، يرد بروتوكول ميكروسفيري-بكر لتضخيم ssDNA.

Protocol

1-تصنيع منصة موائع جزيئية PDMS

1. إعداد 20 مل من سائل PDMS prepolymer بخلط البوليمر الأساسي ومحفِّز في حجم بنسبة 10:1. من أجل 10 مل سائل PDMS على العفن سو-8 إعداد على رقاقة سيليكون في الجزء العلوي من الشبكة موائع جزيئية. الجزء المسطح السفلي، من أجل نفس الحجم من السائل PDMS على رقاقة السيليكون دون بنية العفن.
   ملاحظة: الشبكة موائع جزيئية مصممة في برنامج CAD وتحويلها بعد ذلك إلى النبائط بغية اختﻻق رئيسي باستخدام عملية الطباعة التصويرية النموذجية (انظر الأرقام تكميلية). هذا الرئيسي يتكون من العفن سو-8 سلبي مقاوم الضوء على رقاقة السيليكون¹¹.
2. ضع اثنين رقائق السليكون مغلفة بسائل prepolymer PDMS على صفيحة وعلاج عند 75 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   1. يدوياً تقشر طبقة PDMS شُفي من العفن سو-8. قم بمحاذاة قطرها 1.5 مم جولة أداة ثقب اللكم إلى ميناء النفط على الشبكة موائع جزيئية المنسوخة نسخاً متماثلاً لربط قنوات تدفق حجم ميكرون مع عينات السوائل الماكرو. لكمه من أصل من خلال الثقب يدوياً.
   2. كرر هذا اللكم العملية ثلاث مرات لتشكيل الحلول اثنين والمنفذ منفذ.
3. إجراء المعالجة السطحية ماء على كل من العلوي والسفلي PDMS الطبقات باستخدام المفاوض كورونا اليد¹² لعدة ثوان لكل عينة.
   1. المكدس اثنين البلازما-معاملة طبقات PDMS والحرارة عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام لوحة الساخن لعملية الربط PDMS إلى PDMS. الإمداد الماء المضغوط استخدام مضخة الحقن إلى ثلاثة مداخل الموانئ للترابط الهيكلي واختبار التسرب من الجهاز ملفقة.

2-إنتاج Polyacrylamide اليغو-الجزئي المجالات الخرز الصغير

1. تعد حبة-المخلوط بالتفصيل في الجدول 1.
2. دوامة والطرد المركزي أكريديتي سدنى القياسية بإيجاز المسمى acrylamide:bis (19:1) حل الأسهم والتحقيق (Ap، 100 ميكرومتر).
3. إعداد الحل أنا بخلط 25 ميكروليتر من الاكريلاميد 40% مكررا الحل 10 ميكروليتر من سدنى (أكريديتي التحقيق)، 10 ميكروليتر من المخزن المؤقت x TBE 5 (1.1 "م تريس"؛ 25 مم يدتا بورات 900 مم) و 5 ميكروليتر من المياه. إعداد الحل الثاني مع 50 ميكروليتر من فوق كبريتات الأمونيوم 20%.
4. إعداد اثنين المحاقن منفردة مليئة بالحل الأول والحل الثاني، وجبل لهم على مضخة لإدخال التدفقات الحل إلى منصة موائع جزيئية. إعداد مختلطة مع 0.4% زيت معدني تيميد للتجميد السطحية ميكروسفيري.
   ملاحظة: تيميد المعروف جيدا كعامل استقرار الحرة الراديكالية. الجذور الحرة يمكن تسريع معدل تكوين البوليمر مع فوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) من أجل تحفيز البلمرة الاكريلاميد.
5. ملء زجاجة زجاج مع 4 مل الزيت المعدني لتوليد تدفق مستمر.
6. إدراج أنبوبين لميناءين في غطاء الزجاجة الزجاج كخزان موائع جزيئية: منفذ هوائي لتطبيق الهواء المضغوط في زجاجة زجاج من ضاغط هواء وميناء السوائل لتوريد الزيت المضغوط لشبكة القناة الصغيرة من الزجاجة. قم بتوصيل أنابيب بين زجاجة زجاجية وميناء النفط في الجهاز موائع جزيئية.
   1. قم بتوصيل الأنابيب منافذ الحل اثنين في الجهاز موائع جزيئية بغية توفير الحلول اثنين من مضخات الحقن. إدراج أنابيب إلى المنفذ منفذ من أجل نقل ميكروسفيري التي تم إنشاؤها في الكأس.
7. تعيين معدل تدفق المضخة حقنه إلى 0.4-0.7 مل/حاء ضبط الهواء المضغوط ضغط الضاغط استخدام منظم (82-116 كيلو باسكال). تعيين سرعة الدوران (500 لفة في الدقيقة) على شريط مغناطيسي محرض في الكأس الزجاج على طبق ساخن. تشغيل المضخة المحاقن وإمداد الهواء المضغوط إنشاؤها بواسطة ضاغط خارجي إلى القمقم الزجاج باستخدام عنصر التحكم صمام الكهرومغناطيسي¹³ON/OFF.
8. نلاحظ تكوين الجزئي المجالات الخرز الصغير في الهندسة تركز تدفق والتجميد الجزئي المجالات الخرز الصغير الذي تم إنشاؤه في الكأس الزجاج مجهر رقمي.
   ملاحظة: سرعة الإنتاج وحجم ميكروسفيري تعتمد على فلووراتي للحلول والضغوط التي مورست لتدفق الزيت المعدني (الجدول 2).

3-أداء Polyacrylamide اليغو-الجزئي المجالات الخرز الصغير بحساب

1. للتقدير الكمي هيموسيتوميتير، تأخذ كمية صغيرة (حوالي 100 ميكروليتر) من المحلول polyacrylamide اليغو-الجزئي المجالات الخرز الصغير والمكان في هيموسيتوميتير الزجاج، وملء بلطف بتعليق ميكروسفيري أعلى البئر دائرة العد.
   ملاحظة: للحصول على مزيد من التفاصيل، انظر http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.
2. استخدام عداد حصيلة مجهر واليد إلى الاعتماد الجزئي المجالات الخرز الصغير في مجموعة واحدة من الساحات 16. ثم نقل هيموسيتوميتير إلى المجموعة التالية من الدائرة والقيام بالعد حتى يتم عد كل أربع مجموعات من زوايا 16.
3. تحديد عدد ميكروسفيري المتوسط وحساب عدد الجزئي المجالات الخرز الصغير في تعليق حبة الأصلي.
4. نقل 100 ميكروليتر من الجزئي المجالات الخرز الصغير إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. إزالة المادة طافية عن طريق سينتريفوجينج (400 س ز) لطيف وبيبيتينج.

4-إجراء التهجين الحمض النووي على سطح أوليجوميكروسفيري بولياكريلاميدي

ملاحظة: مطابقة الحمض النووي تحقيقا مع 5 '--NH₂-مجموعة بدلاً من تعديل 5'--أكريتيدي هو تضاف إلى الحل الأول واختبارها للجزئي المجالات الخرز الصغير المحتوية على Ap بالتوازي. وتظهر نتائج التهجين الحمض النووي في الشكل 2. يجب وضع حل المسابر (cAp) المسمى Cy3 اليغنوكليوتيد مكملة في غرفة مظلمة.

1. ريسوسبيند Cy3-كاب 100 ميكروليتر من 1xTE المخزن المؤقت باستخدام (المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات: 10 ملم تريس و 1μM يدتا، pH 8.0) بغية تحقيق تركيز نهائي من 100 ميكرومتر. على سبيل المثال، ريسوسبيند بمول 1 من كاب في 100 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات والنقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مغطاة برقائق الألومنيوم.
   ملاحظة: لتسلسل حبلا، انظر الجدول 3.
2. إضافة 100 ميكرومتر من كاب Cy3 إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل تحتوي على كوبوليميريزيد Ap الجزئي المجالات الخرز الصغير.
3. اضغط الأنبوبة عدة مرات لخلط واحتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام ح 1.
4. تجاهل المادة طافية وإزالة المخزن المؤقت المتبقية عن طريق بيبيتينج.
5. شطف ثلاث مرات مع 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات.
6. ريسوسبيند الجزئي المجالات الخرز الصغير بلطف التنصت على أنبوب ميكروسينتريفوجي. ثم كرر الخطوة 4، 4.
7. مكان الجزئي المجالات الخرز الصغير على الشريحة الزجاجية (75 مم × 50 مم) وتغطي برقائق الألومنيوم قبل التصوير.

5-غير المتناظر PCR لتضخيم ssDNA

1. إعداد مزيج كاشف PCR غير المتناظر لتضخيم سدنا يتم تحليلها. ذوبان الجليد الكواشف في الجدول 4 على الجليد. لا تحتفظ بإنزيم بوليميراز بوليميراز (50 ش/ميليلتر) على الجليد، ولكن بدلاً من تخزينها في-20 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
2. بلطف من دوامة كل الكواشف والطرد المركزي بإيجاز ثم أنابيب في 10,000 ز x 10 s.
3. الجمع بين جميع الكواشف كما هو موضح في الجدول 4-
4. وضع العينات في ثيرموسيكلير وبدء PCR غير المتماثلة الظروف التالية: 25 دورات (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 52 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 s)، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، عقد في 4 درجات مئوية.

6-ميكروسفيري-بكر لتضخيم ssDNA

ملاحظة: هذا المقطع يصف البروتوكول لتضخيم ssDNA في أنبوب تفاعل PCR. ردود فعل ميكروسفيري-بكر أجريت في 50 ميكروليتر من حجم رد الفعل. وترد في الجدول 5تسلسل التفصيلية التي تستخدم لتضخيم ssDNA. في هذه الحالة، يمكن أن يصلب Ap على سطح الجزئي المجالات الخرز الصغير بقوالب الحمض النووي عشوائية بطريقة متكاملة. هذا خطوة هامة جداً لإنتاج خيوط الحمض النووي التكميلية (العقاقير حبلا الحمض النووي، الشكل 3). الحمض النووي الموسع هو استخدامه كقالب للتضخيم بكر ميكروسفيري.

1. إعداد مزيج كاشف ميكروسفيري-PCR. ذوبان الجليد الكواشف في الجدول 6 على الجليد؛ ومع ذلك، لا تحتفظ بإنزيم بوليميراز بوليميراز على الجليد. قم بتخزينها في-20 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
2. بلطف من دوامة كل الكواشف والطرد المركزي بإيجاز ثم أنابيب في 10,000 ز x 10 s.
3. الحصول على حوالي ~ 25 الجزئي المجالات الخرز الصغير عن طريق العد المجهري.
   ملاحظة: يتم احتساب عدد الجزئي المجالات الخرز الصغير في أنبوب رد فعل واحد استخدام مجهر خفيفة مع 40 X التكبير. وتستخدم حوالي 25 ~ الجزئي المجالات الخرز الصغير للتضخيم بكر ميكروسفيري. معلومات أكثر تفصيلاً في الخطوة 3.
4. الجمع بين جميع الكواشف كما هو موضح في الجدول 6-
5. وضع العينات في ثيرموسيكلير وبدء PCR غير المتماثلة الظروف التالية: 25 دورات (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 52 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 s)، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، عقد في 4 درجات مئوية.
6. إضافة 8 ميكروليتر من 6 × تحميل المخزن المؤقت التضخيم التالية، وتحميل 15 ميكروليتر من كل عينة إلى 2% [اغروس] هلام. ثم، تنفيذ التفريد في 100 الخامس لمدة 35 دقيقة في 1 x TAE (تريس-خلات-يدتا، 40 مم خلات تريس، يدتا 1 مم، الرقم الهيدروجيني 8.2) المخزن المؤقت.

7-[كنفوكل] مجهرية اقتناء

ملاحظة: يتم تصويرها نتائج التهجين مسبار الحمض النووي ميكروسفيري تحت مجهر [كنفوكل]. يتم تنفيذ تحليل الصور باستخدام إيماجيج.

1. إصلاح المهجن الجزئي المجالات الخرز الصغير إلى مرحلة المجهر في حامل.
2. حدد الليزر (ليزر الهيليوم/نيون، 543 خط nm) وقم بتشغيله في السيطرة على الليزر.
3. حدد العدسة الهدف في مراقبة المجهر.
4. حدد عامل التصفية المطلوب Cy3 والقناة في تكوين عنصر التحكم.
5. بدء التجربة ومراقبة العينة. إعدادات للمجهر [كنفوكل] ملخصة في الجدول 7.

النتائج

منهاج موائع جزيئية البوليمرية ملفقة على أساس الحبرية يتكون من طبقتين PDMS (الشكل 1a). وتستخدم ثلاثة أنواع من شبكات قناة موائع جزيئية لتوليد الجزئي المجالات الخرز الصغير: الهندسة 1) تدفق التركيز كما هو مبين في الشكل 1 باءو 2) قناة السربنتين لخلط ...

Discussion

ملوثات دسدنا قضية رئيسية في التضخيم ssDNA. ما زال من الصعب على تقليل التضخيم دسدنا التقليدية غير المتناظر PCR التضخيم¹⁵. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من التحسينات التقنية لتوليد سدنا مكنتنا من زيادة كفاءة إنتاجية عينة، العزلة سدنا ما زالت إشكالية نظراً لارتفاع التكاليف وغلة تنقي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres