أشباح الدهون بالمياه للتحقق من صحة التصوير بالرنين المغناطيسي: بروتوكول مرنة وقابلة للتطوير

Emily C. Bush; Aliya Gifford; Crystal L. Coolbaugh; Theodore F. Towse; Bruce M. Damon; E. Brian Welch

doi:10.3791/57704

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

والغرض من هذا العمل هو وصف بروتوكول لإنشاء فانتوم المياه الدهون عملية التي يمكن تخصيصها لإنتاج أشباح مع نسب الدهون متفاوتة ووحدات التخزين.

Abstract

كما يتم تطوير تقنيات جديدة للأنسجة الدهنية للصورة، أساليب للتحقق من صحة هذه البروتوكولات تكتسب أهمية متزايدة. أشباح، والنسخ التجريبية الأنسجة أو الجهاز للفائدة، توفر حلاً منخفض التكلفة ومرنة. ومع ذلك، دون الوصول إلى معدات مكلفة والمتخصصة، تشييد أشباح مستقرة مع كسور الدهون عالية (مثلاً.، > مستويات كسر الدهون 50% مثل تلك التي ظهرت في النسيج الدهني البنى) يمكن أن يكون صعباً نظراً لطبيعة مسعور من الدهون. ويعرض هذا العمل بروتوكول مفصل ومنخفضة التكلفة لخلق أشباح 5 × 100 مل مع كسور الدهون 0%، 25%، 50%، 75%، و 100% استخدام لوازم المختبرات الأساسية (هوتبلت، قنينة، إلخ.) ومكونات الوصول إليها بسهولة (الماء المقطر، أجار، للذوبان في الماء الفاعل ونزوات الصوديوم، عامل تباين غادولينيوم-ديثيلينيتريامينبينتاسيتاتي (دتبا)، وزيت الفول السوداني والفاعل النفط القابلة للذوبان). البروتوكول قد صممت لتكون مرنة؛ يمكن استخدامه لإنشاء أشباح مع الكسور الدهون المختلفة ومجموعة واسعة من وحدات التخزين. وقيمت أشباح تم إنشاؤها باستخدام هذا الأسلوب في دراسة الجدوى التي مقارنة قيم كسر الدهون من الدهون-المياه التصوير بالرنين المغناطيسي للقيم المستهدفة في أشباح شيدت. أسفرت هذه الدراسة عن معامل ارتباط توافق 0.998 (فاصل الثقة 95%: 0.972 1.00). وباختصار، تثبت هذه الدراسات فائدة أشباح الدهون للتحقق من صحة الأنسجة الدهنية لتقنيات التصوير عبر مجموعة من الأنسجة ذات الصلة سريرياً والأعضاء.

Introduction

الفائدة في تحديد كمية الأنسجة الدهنية والدهون الثلاثية المحتوى باستخدام طرائق التصوير، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)، تمتد عبر العديد من المجالات. وتشمل مجالات البحث التحقيق في مستودعات الأنسجة الدهنية البيضاء والبنى وخارج الرحم تخزين الدهون في الأعضاء والأنسجة مثل الكبد¹والبنكرياس²، والهيكل العظمى والعضلات³. كما يتم تطوير هذه التقنيات الجديدة للقياس الكمي الدهنية، أساليب مطلوبة للتأكد من أن المعلمات التصوير تصلح للبحوث والتطبيقات السريرية.

أشباح، والنسخ التجريبية الأنسجة أو الجهاز، توفر أداة مرنة، والتي تسيطر عليها منخفضة تكلفة، لتطوير والتحقق من تقنيات التصوير⁴. على وجه التحديد، يمكن بناؤها أشباح تتألف من الدهون والماء في حجم نسبة الدهون أو كسر (FF) مماثلة لانسجة الفائدة السريرية. سريرياً، يمكن أن تختلف القيم FF في الأنسجة والأعضاء على نطاق واسع: FF في النسيج الدهني البنى يقع بين 29.7 في المائة و⁵من 93.9 في المائة؛ الكبد متوسط فرنك فرنسي في ذلك المرضى هو 18.1 ± 9.0%⁶؛ FF البنكرياس في البالغين المعرضين للخطر لنوع 2 مرض السكري تتراوح بين 1.6% و⁷من 22.2 في المائة؛ وفي بعض حالات المرض مسبقاً، يمكن أن يكون المرضى الذين يعانون من ضمور العضلات Duchenne القيم فرنك فرنسي تقريبا 90% في بعض العضلات⁸.

لأن الجزيئات غير القطبية مثل الدهون لا تذوب جيدا في حلول تتألف من الجزيئات القطبية مثل الماء، خلق أشباح مستقرة مع هدف السامي فرنك فرنسي لا تزال صعبة. لفرنك فرنسي يصل إلى 50%، العديد من الأساليب الموجودة يمكن استخدامها لإنشاء المياه الدهون أشباح⁹^،¹⁰^،^،من¹¹¹². الأساليب الأخرى التي تحقق أعلى جبهة القوى الاشتراكية عادة يتطلب معدات غالية الثمن مثل الخالطون أو الموجات فوق الصوتية خلية disruptor¹³^،¹⁴. على الرغم من أن هذه التقنيات توفر خارطة طريق لارتفاع FF أشباح، قيود المعدات وكميات مختلفة من التفاصيل التجريبية تحد من الجهود الرامية إلى خلق أشباح المياه الدهون استنساخه وقوية.

بناء على هذه التقنيات السابقة، قمنا بتطوير أسلوب لبناء أشباح المياه الدهون فعالة من حيث التكلفة ومستقرة عبر قيم النطاق قابلة للتخصيص من فرنك فرنسي. هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات اللازمة لجعل 5 × 100 مل أشباح الدهون مع القيم FF 0%، 25%، 50%، 75%، و 100% استخدام هوتبلت واحد. يمكن تعديلها بسهولة لإنشاء مختلف وحدات التخزين (10 إلى 200 مل) ونسب الدهون (0 إلى 100%). وتم تقييم مدى فعالية هذه التقنية الوهمية في القيم FF التصوير بالرنين المغناطيسي المياه الدهون مقارنة جدوى الدراسة إلى القيم المستهدفة فرنك فرنسي في أشباح شيدت.

Protocol

1. إعداد محطة العمل والمواد

الالتزام بكافة قواعد السلامة في المختبرات. ارتداء القفازات وحماية العين. قراءة صحيفة بيانات السلامة المادية لكل من الكواشف المستخدمة واتخاذ الاحتياطات الملائمة. استعراض المواد والمعدات القائمة، وإجراءات التعامل مع المواد الكيميائية، والاحتياطات الأواني الزجاجية.
تحذير: يتطلب هذا البروتوكول استخدام هوتبلت في درجات حرارة عالية. يجب توخي الحذر وارتداء قفازات مقاومة للحرارة عند التفاعل مع الساخنة الحاويات ولا تلمس سطح هوتبلت.
مسح مساحة العمل وتنظيف السطوح بمطهر. أغسل يديك ووضع القفازات.
تعقيم جميع الصكوك وداخل جميع الجرار الزجاج تقليل المخاطر المحتملة للتلوث، وزيادة طول عمر الوهمية.
ملاحظة: إذا كان سيستخدم الوهمية لأكثر من بضعة أيام، دورياً تنظيف سطح الوهمية المكتملة مع الإيثانول لمنع نمو البكتيريا.

2-إعداد الحل الماء

إعداد مساحة العمل لحل المياه. قم بوضع المواد والمعدات التالية على مقاعد البدلاء: تخرج اسطوانة، كوب 400 مل، شريط إثارة، مقياس، 2 x وزن القوارب، والبسط، مل 2 × 1.0 الحقن بالإبر، الماء المقطر، عامل تباين غادولينيوم-ديثيلينيتريامينبينتاسيتاتي (دتبا)، الفاعل للذوبان في الماء، واجار، ونزوات الصوديوم.
ملاحظة: يمكن استخدام المحاقن مع أو بدون الإبر. ومع ذلك، استخدام الإبر سوف تحسين دقة القياس وتساعد على منع ترشيش عند المحتويات يتم إضافتها إلى حلول المياه أو النفط.
وضع شريط ضجة في كوب 400 مل. استخدام 100 أو 200 مل تخرج اسطوانة لقياس 300 مل ماء المقطر وصب الماء الكأس. وضع في الكأس على هوتبلت وتعيين عند 90 درجة مئوية مع إثارة بمعدل 100 لفة في الدقيقة.
ملاحظة: يتم استخدام درجات الحرارة المرتفعة في هذا البروتوكول لتحقيق نتائج سريعة. درجة حرارة النقطة المحددة هوتبلت نظراً لعدم ترك الحلول على هوتبلت لفترات طويلة من الوقت، لا تعكس درجة حرارة الحل.
استخدام مقياس معايرة قياس ز 0.30 من بنزوات الصوديوم في قارب وزنها. إضافة بنزوات الصوديوم إلى المحلول المائي.
استخدام المحاقن لقياس 0.6 مل السطح للذوبان في الماء. تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات الهواء. اضغط الإبرة بضعة ملليمترات فوق مركز الحل، والإفراج ببطء السطح للذوبان في الماء لتجنب بقع على جدران الكأس.
استخدام المحاقن نظيفة، قياس مل 0.24 عامل التباين غادولينيوم-دتبا. إضافة إلى الكأس، باستخدام نفس الأسلوب كما في الخطوة 2، 4.
ملاحظة: يتم استخدام الجادولينيوم دتبا ضبط خصائص الاسترخاء التصوير بالرنين المغناطيسي فانتوم لتتطابق مع تلك الأنسجة للفائدة. القارئ يمكنك ضبط حجم دتبا غادولينيوم إضافة أفضل تطابق خصائص استرخاء الأنسجة للفائدة.
قياس g 9.0 لاجار في قارب وزنها. ملعقة في أجار ببطء مع ملعقة في كوب ماء.
مرة واحدة كل شيء قد تم إضافتها إلى الحل المياه، زيادة درجة الحرارة هوتبلت إلى 350 درجة مئوية ويقلب شريط السرعة إلى 1100 لفة في الدقيقة لمدة 5-10 دقيقة تذوب في أجار.
1. للتحقق إذا كان هو ذاب في أجار، بإيجاز إزالة الحل المياه من هوتبلت والتوقف عن إثارة، والتحقق من لون الحل. ينبغي أن يكون أجار ذاب واضحة (لا لافتات أو كتل) والأصفر أو الأصفر اللون.
وبمجرد أجار ذاب تماما، استخدام المحاقن أو صب حوالي 3.5 مل المحلول المائي في قنينة صغيرة. إذا لم يتم تعيين اختبار حل أو يفصل بعد 5-10 دقيقة، لا ذاب في أجار. زيادة درجة الحرارة هوتبلت العودة إلى 350 درجة مئوية وتستمر تدفئة الحل.
كرر الخطوة 2.8 حتى حل الماء في مجموعات قنينة الاختبار بشكل صحيح.
اترك الحل المياه في هوتبلت في 50 درجة مئوية و 100 لفة في الدقيقة. تنظيف مساحة العمل والاستعداد لحل النفط.
1. إزالة المواد التالية من مقاعد البدلاء: مقياس، 2 × قوارب تزن وملعقة ومل 2 × 1.0 الحقن بالإبر (المستخدمة)، الماء المقطر، عامل تباين غادولينيوم-دتبا، الفاعل للذوبان في الماء، واجار ونزوات الصوديوم.
2. قم بوضع المواد والمعدات التالية على مقاعد البدلاء: 400 مل كوب (نظيف)، وآثاره بار (نظيف)، ومل 2.0 حقنه بإبرة وزيت الفول السوداني، والسطح قابل للذوبان في الزيت.

3-زيت الحل

وضع شريط جديد ضجة في كوب نظيف 400 مل. استخدم اسطوانة تخرج لقياس 300 مل زيت الفول السوداني وتصب الكأس. إزالة الكأس التي تحتوي على الحل المياه ووضع كوب حل النفط على هوتبلت. تعيين إلى 90 درجة مئوية مع إثارة بمعدل 100 لفة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: يتم استخدام زيت الفول السوداني لأنه يحتوي على طيف رنين المغناطيسي النووي مماثلة مقارنة بالدهون الثلاثية في الأنسجة الدهنية البشرية¹⁵.
1. لا تترك الزيت على هوتبلت غير المراقب. إذا كان النفط تحصل على الساخن جداً ويبدأ بالدخان وإزالته من وميكروريف وتقليل درجة الحرارة قبل أن يعود النفط إلى هوتبلت.
قياس 3.0 مل السطح قابل للذوبان في الزيت مع حقنه نظيفة. باستخدام نفس الأسلوب هو موضح في الخطوة 2، 4، إضافة الفاعل النفط القابلة للذوبان للكأس. تعيين هوتبلت إلى 150 درجة مئوية و 1100 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لخلط تماما الحل النفط.
تأخذ الحل النفط قبالة هوتبلت وتنظيف مساحة العمل في التحضير لإنشاء الوهمية.
1. إزالة المواد التالية من مقاعد البدلاء: 2.0 مل حقنه بإبرة (المستخدمة)، زيت الفول السوداني، والسطح قابل للذوبان في الزيت.
2. وضع المواد والمعدات التالية على مقاعد البدلاء: 250 مل قارورة Erlenmeyer، حرك شريط (نظيف), الماصات الحجمي وحامل ماصة حجمية 5 × 120 مل زجاج الجرار.

4-خلق مستحلب الوهمية

إعداد الماصات الحجمي لحلول المياه والنفط. ينبغي أن تستعمل الماصات فقط مع حل كل منها لمنع التلوث عبر.
1. يتطابق مع حجم الماصة لوحدة التخزين المستخدمة في البروتوكول. على سبيل المثال، استخدام الماصات الحجمي 2 × 50 مل (حل المياه 50 مل + 50 مل زيت الحل) لإنشاء 100 مل الوهمية مع هدف وما يليها دهون 50%.
وضع الحل المياه على هوتبلت وتعيين هوتبلت إلى 300 درجة مئوية و 1100 لفة في الدقيقة. وبعد 4-5 دقائق، قم بإيقاف تشغيل محرض.
استخدام ماصة حجمية، معرفة ما إذا كان الحل المياه جاهزة لاستخراج جزئيا مع كمية صغيرة (5-10 مل) ملء الماصة الحل والشبيه الكأس مرة أخرى. إذا كان يمكن إزالة الحل المياه بسهولة وأطلق سراحهم دون مخلفات المفرطة في الماصة، الانتقال إلى الخطوة التالية، خلاف ذلك، وترك الأمر على هوتبلت والتحقق مرة أخرى في 2-3 دقيقة.
ملاحظة: مكونات الحل المياه أكثر عرضه لتعيين وفصل، ولذلك فمن الأفضل أن تبقى الحل المياه إثارة و/أو الحارة قدر الإمكان. إذا ليس الحل المياه تحسنت وأثارت قبل نقل، سيكون من الصعب جداً قياس أحجام دقيقة بسبب ميل أجار إلى كونجيال عندما يبرد.
عناية إضافة شريط إثارة نظيفة إلى 250 مل قارورة Erlenmeyer. تأخذ الحل المياه قبالة هوتبلت وقياس حجم مناسب (الجدول 2)، ونقله إلى قارورة Erlenmeyer.
وضع الحل النفط على هوتبلت وتعيين عند 90 درجة مئوية و 1100 لفة في الدقيقة لضمان الحل متجانسة. بعد 1-2 دقيقة، إزالة الحل النفط من هوتبلت واستبداله بقارورة Erlenmeyer.
قياس كمية مناسبة من حل النفط (الجدول 2) وإضافة ببطء إلى الحل الماء في قارورة Erlenmeyer.
متى تم إضافة جميع النفط الحل، زيادة درجة الحرارة إلى 300 درجة مئوية والحفاظ على إثارة 1100 لفة في الدقيقة. إثارة الحلول المدمجة لمدة 4-5 دقيقة (يجب أن يكون هناك دوامة من شريط إثارة). ينبغي أن يكون شكل مستحلب أبيض، مع نسيج دسم.
استخدام المسترد شريط مغناطيسي إثارة لإزالة الشريط ضجة.
ملاحظة: يجب استخدام المسترد شريط إثارة إزالة أشرطة ضجة من جميع المستحلبات مستقبلا. تنظيف جيدا بين كل استعمال.
استخدام قفازات مقاومة للحرارة لصب الخليط بعناية في قارورة Erlenmeyer في جرة زجاجية نظيفة 120 مل. صب الخليط ببطء أسفل الجانب من جرة الزجاج لمنع الفقاعات في الخليط يبرد.
تنظيف قارورة Erlenmeyer وشريط ضجة، ثم كرر الخطوات 4.2-4.8، ضبط الكميات من المياه والنفط الحلول، حتى يتم إنشاء كافة أشباح.
ملاحظة: تأكد من الزجاج بارد قبل التنظيف.

النتائج

إذا تم إعداد حل المياه بشكل صحيح، يجب أن كونجال كمية صغيرة من الحل بسرعة في قنينة اختبار (الشكل 1، الأيسر). إذا كان الحل الذي يفصل (الشكل 1، حق)، ينبغي إعداد الحل مرة أخرى (وفقا للتعليمات في الخطوة 3، 8 من البروتوكول). إذا كان ?...

Discussion

يصف لنا طريقة قوية لخلق أشباح الدهون الماء مناسبة للتحقق من تقنيات التصوير الطبية المستخدمة لقياس محتوى الأنسجة الدهنية والدهون الثلاثية في الجسم الحي. عن طريق إنشاء الخزانات اثنين (واحد لحل النفط) وواحدة لحل المياه، شيدت أشباح مستقرة مع مجموعة متنوعة من القيم FF – بما في ذلك القيم ال...

Disclosures

الكتاب يعلن أن أجرى هذا البحث نظراً لعدم وجود أي علاقة تجارية أو مالية يمكن أن يفسر تضارب المصالح محتملة.

Acknowledgements

دعم التمويل لهذه الأبحاث قدمت المعاهد الوطنية للصحة (NIH) والمعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي، وأمراض الكلي (NIDDK)/R01 المعاهد الوطنية للصحة-DK-105371. ونشكر الدكتور هوتشن (هاري) هو جين تاو لتقديم المشورة والاقتراحات على إنشاء فانتوم المياه الدهون.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Distilled Water	Amazon	B000P9BY38	Base of water solution
Agar	Sigma Aldrich Incorporated	A1296-100G	Gelling agent
Water-Soluble Surfactant	Sigma Aldrich Incorporated	P1379-500ML	Surfactant/emulsifying agent
Gadolinium-DTPA Contrast Agent	Bayer Healthcare	50419-0188-01	Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent.
Sodium Benzoate	Sigma Aldrich Incorporated	71300-250G	Preservative
Peanut Oil	Amazon	54782-LOU	Base of oil solution
Oil-Soluble Surfactant	Sigma Aldrich Incorporated	S6760-250ML	Surfactant/emulsifying agent
Hotplate w/ Stirrer	Fisher Scientific	07-770-152
Stir bars (Egg-Shaped)	Sigma Aldrich Incorporated	Z127116-1EA
400 mL Beaker	Sigma Aldrich Incorporated	CLS1003400-48EA
250 mL Erlenmeyer Flask	Sigma Aldrich Incorporated	CLS4450250-6EA
25 mL Glass Volumetric Pipette	Fisher Scientific	13-650-2P	Quantity = 2
50 mL Glass Volumetric Pipette	Fisher Scientific	13-650-2S	Quantity = 2
75 mL Glass Volumetric Pipette	Fisher Scientific	13-650-2T	Quantity = 2
3.0 mL Syringe	Sigma Aldrich Incorporated	Z248002-1PAK
1.0 mL Syringe	Sigma Aldrich Incorporated	Z230723-1PAK
Spatula	Sigma Aldrich Incorporated	S3897-1EA
Scale (100g X 0.01g Resolution)	Amazon	AWS-100-BLK
Weigh Boats	Sigma Aldrich Incorporated	Z740499-500EA
120 mL Glass Jars	McMaster Carr Supply Co	3801T73
Heat Resistant Gloves (pair)	Amazon	B075GX43MN
Syringe Needles	Sigma Aldrich Incorporated	Z192341-100EA
18" stir bar retriver	Fisher Scientific	14-513-70
1 Dram Clear Glass Vial	Fisher Scientific	03-339-25B

References

Franz, D., et al. Association of proton density fat fraction in adipose tissue with imaging-based and anthropometric obesity markers in adults. Int J Obes. , 1-8 (2017).
Chai, J., et al. MRI chemical shift imaging of the fat content of the pancreas and liver of patients with type 2 diabetes mellitus. Exp Ther Med. 11 (2), 476-480 (2016).
Hogrel, J. Y., et al. NMR imaging estimates of muscle volume and intramuscular fat infiltration in the thigh: variations with muscle, gender, and age. Age (Omaha). 37 (3), 1-11 (2015).
Hoskins, P. R. Simulation and Validation of Arterial Ultrasound Imaging and Blood Flow. Ultrasound Med Biol. 34 (5), 693-717 (2008).
Hu, H. H., Perkins, T. G., Chia, J. M., Gilsanz, V. Characterization of human brown adipose tissue by chemical-shift water-fat MRI. Am J Roentgenol. 200 (1), 177-183 (2013).
d'Assignies, G., et al. Noninvasive quantitation of human liver steatosis using magnetic resonance and bioassay methods. Eur Radiol. 19 (8), 2033-2040 (2009).
Schwenzer, N. F., et al. Quantification of pancreatic lipomatosis and liver steatosis by MRI: comparison of in/opposed-phase and spectral-spatial excitation techniques. Invest Radiol. 43 (5), 330-337 (2008).
Wokke, B. H., et al. Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 24 (5), 409-416 (2014).
Fischer, M. A., et al. Liver Fat Quantification by Dual-echo MR Imaging Outperforms Traditional Histopathological Analysis. Acad Radiol. 19 (10), 1208-1214 (2012).
Hayashi, T., et al. Influence of Gd-EOB-DTPA on proton density fat fraction using the six-echo Dixon method in 3 Tesla magnetic resonance imaging. Radiol Phys Technol. , (2017).
Hines, C. D. G., Yu, H., Shimakawa, A., McKenzie, C. A., Brittain, J. H., Reeder, S. B. T1 independent, T2* corrected MRI with accurate spectral modeling for quantification of fat: Validation in a fat-water-SPIO phantom. J Magn Reson Imaging. 30 (5), 1215-1222 (2009).
Fukuzawa, K., et al. Evaluation of six-point modified dixon and magnetic resonance spectroscopy for fat quantification: a fat-water-iron phantom study. Radiol Phys Technol. , 1-10 (2017).
Bernard, C. P., Liney, G. P., Manton, D. J., Turnbull, L. W., Langton, C. M. Comparison of fat quantification methods: A phantom study at 3.0T. J Magn Reson Imaging. , (2008).
Poon, C., Szumowski, J., Plewes, D., Ashby, P., Henkelman, R. M. Fat/Water Quantitation and Differential Relaxation Time Measurement Using Chemical Shift Imagin Technique. Magn Reson Imaging. 7 (4), 369-382 (1989).
Yu, H., Shimakawa, A., Mckenzie, C. a., Brodsky, E., Brittain, J. H., Reeder, S. B. Multi-Echo Water-Fat Separation and Simultaneous R2* Estimation with Multi-Frequency Fat Spectrum Modeling. Spectrum. 60 (5), 1122-1134 (2011).
Peri, C. . The extra-virgin olive oil handbook. , (2014).
Kell, G. S. Density, Thermal Expansivity, and Compressibility of Liquid Water from 0° to 150°C: Correlations and Tables for Atmospheric Pressure and Saturation Reviewed and Expressed on 1968 Temperature Scale. J Chem Eng Data. 20 (1), 97-105 (1975).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: