JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف من هذا البروتوكول الحصول على عينات من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية المعزولة من الأنسجة المعوية البشرية غير المثبتة، مستأصل حديثا باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). ويشمل هذا البروتوكول إعداد فلاش تجميد عينات من الأنسجة المعوية البشرية، كريوسيكتيونينج، وتلطيخ ethanolic والجفاف، LCM، واستخراج الحمض النووي الريبي.

Abstract

والغرض من هذا الأسلوب الحصول على عينات من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية التي جمعت من الأنسجة المعوية البشرية غير المثبتة، مستأصل حديثا باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). وقد حددنا خمس خطوات في سير العمل التي لا بد منها للحصول على عزل الحمض النووي الريبي من ganglia المعوي مع كمية ونوعية عالية بما فيه الكفاية لما يليها الحمض النووي الريبي أولاً، عند إعداد الأنسجة المعوية، يجب أن يكون كل عينة السائل الزائد كل إزالة بواسطة النشاف قبل التسوية serosa قدر الإمكان عبر الجزء السفلي من قوالب قاعدة كبيرة. العينات ثم تجمد بسرعة فوق ملاط الثلج الجاف و 2-ميثيلبوتاني. وثانيا، عند تقطيع الأنسجة، من المهم أن موضع كريومولدس حتى الأجزاء المعوية موازية للطائرة الكامل الضفيرة مينتيريك، مما تسفر عن مساحة أكبر من ganglia المعوي كل شريحة. الثالثة، خلال LCM، البولي إثيلين نابثالاتي (القلم)-عرض الشرائح غشاء أكبر قدر من السرعة والمرونة في تحديد الأشكال غير موحدة من ganglia المعوي عند جمع ganglia المعوي. رابعا، للتصور متميزة من ganglia المعوية داخل الأقسام، نقدم الأصباغ المتوافقة مع الإيثانول، مثل "كريسيل البنفسجي"، ممتازة الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي بالنسبة للأصباغ المائية. أخيرا، لاستخراج الحمض النووي الريبي من العقد تم التقاطها، لاحظنا الفروق بين مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التجارية التي أسفرت عن تفوق الجيش الملكي النيبالي الكمية والنوعية، والقضاء على التلوث بالحمض النووي. الأمثل لهذه العوامل في البروتوكول الحالي إلى حد كبير يسرع سير العمل وغلة عينات ganglia المعوي مع استثنائية الحمض النووي الريبي النوعية والكمية.

Introduction

ويهدف هذا الأسلوب للحصول على عينات الحمض النووي الريبي عالية الجودة من ganglia المعوي من الأنسجة المعوية البشرية باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM). البروتوكول هو موضح هنا تم الأمثل لتقديم نوعية الجيش الملكي النيبالي وغلة كافية للحمض النووي الريبي التسلسل (الحمض النووي الريبي-seq) والمقصود ليتم استخدامها مع الأنسجة المعوية البشرية مستأصل حديثا، غير المثبتة، مجمدة في فلاش.

اضطرابات حركية الجهاز الهضمي والأمعاء الوظيفية يؤثر على واحد من كل أربعة أشخاص في الولايات المتحدة. النظام العصبي المعوي (ENS)، كما يشار إلى الدماغ الثاني1، غالباً في وسط هذه الاضطرابات، كما أنها تلعب دوراً حاسما في التوازن القناة الهضمية وحركية. عموما قيدت التلاعب بحركية القناة الهضمية للاستئصال الجراحي للأنسجة أجانجليونيك/نونكونتراكتيلي، وتعديل النظام الغذائي المزمن، و/أو الأدوية. من المستغرب، يظل الترنسكربيتوم الكامل من ENS الكبار تكون متسلسلة، يحد كثيرا من قدرتنا على تحديد الجزيئات داخل ENS يمكن استهداف فارماسيوتيكالي أو تستخدم في علاجات الخلايا الجذعية.

هناك طرق قليلة نسبيا لعزل الحمض النووي الريبي من ganglia المعوية البشرية. يتطلب النهج الأول، تفكك الخلية2، حضانة ارتفاع درجات الحرارة وأوقات طويلة الحضانة؛ على حد سواء التي من المعروف أن تعزز تدهور الجيش الملكي النيبالي، ويغير2،الترنسكربيتوم3. نهج بديل، LCM، أكثر موثوقية يحافظ الترنسكربيتوم ويحمي سلامة الحمض النووي الريبي. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد استخدمت LCM لجمع ganglia من الأنسجة المعوية البشرية مجمدة طازجة4،،من56، هذه النهج يعوقها أما ضعف كمية ونوعية الجيش الملكي النيبالي، وكانت ذات العمالة الكثيفة جداً، أو تحتاج إلى تعديل لتلطيخ أو تقنيات استخراج الحمض النووي الريبي للعمل في أيدينا. بروتوكولات LCM أخرى مصممة للحفاظ على الحمض النووي الريبي التي تم العثور عليها في المنتج LCM أدلة قدمت تحسينات إضافية7،8، ولكن التكيف الضروري عند تطبيقه على عزل ganglia المعوي8، 9-ولهذه الأسباب، قمنا بتطوير بروتوكول أمثل استناداً إلى هذه الموارد أن ينتج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوية البشرية، وسير عمل سريع نسبيا، وتنتج نتائج متسقة عبر كبيرة عدد العينات.

في هذه الدراسة، نقدم موجزاً لإجراءات محسنة تسهل عزل الحمض النووي الريبي عالية من السلامة من ganglia المعوي مصدرها الأنسجة المعوية البشرية مستأصل. لدينا أسلوب يتضمن خمسة جوانب هامة. ينبغي أن يتم اقتطاعها عينات الأمعاء البشرية الأولى، مستأصل حديثا، غير المثبتة للحجم، وجميع الرطوبة الزائدة إزالة مع أنسجة مختبرية وسويت بالأرض في قالب قاعدة كبيرة قبل تجميد فلاش قمة الطين من الثلج الجاف و 2-ميثيلبوتاني (2 ميغا بايت). وينبغي إعداد المقاطع النسجية، والثانية من الأمعاء للحصول على الطائرة الكامل الضفيرة مينتيريك على شريحة، الذي يقدم حمولة كبيرة من ganglia المعوي. نجاح هذه الخطوة تعتمد إلى حد كبير على عملية إعداد الأنسجة. ثالثا، يتطلب هيكل نونونيفورم ganglia في ENS استخدام البولي إثيلين نابثالاتي (القلم) غشاء الشرائح6، التي توفر أكبر قدر من السرعة والدقة أثناء عملية LCM. ينبغي استخدام الأصباغ الرابعة، المتوافقة مع الإيثانول، مثل "كريسيل البنفسجي"، للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي أثناء تلطيخ ganglia المعوي. آخر، عملية استخراج الحمض النووي الريبي حاسمة بالنسبة لنتيجة ناجحة مع ما يليها الحمض النووي الريبي سعينا لنهج استخراج الحمض النووي الريبي التي تنتج نزاهة الجيش الملكي النيبالي عالية ويزيد الغلة الحمض النووي الريبي عند بدء التشغيل مع مجموعات صغيرة من ganglia المعوي ويزيل التلوث بالحمض النووي ويحتفظ العديد من الحمض النووي الريبي الأنواع ممكن.

أخذت معا، الاستفادة المثلى من هذه العوامل في هذه الدراسة إلى حد كبير يسرع سير العمل وغلة عينات ganglia المعوي مع استثنائية الحمض النووي الريبي كمية ونوعية. وكانت النتائج متسقة إلى حد كبير بين مجموعة كبيرة من العينات، مما يشير إلى اتساق هذا النهج. علاوة على ذلك، فقد استخدمنا هذه النهج بالتسلسل بنجاح عشرات من عينات الحمض النووي الريبي من ganglia المعوي. يمكن أيضا تكييف الاستراتيجيات التي أبرزت هنا لأداء LCM للعقد المطلوب أو نويات الطرفية والجهاز العصبي المركزي والحالات الأخرى التي تتطلب عزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة على نطاق واسع.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات المذكورة هنا فاندربيلت الجامعي المؤسسي استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين).

1-إعداد قبل وصول الأنسجة

  1. الحصول على موافقة الاتحاد الدولي للرجبى السليم والتنسيق مع وكالات التبرع بالأعضاء البشرية للحصول على أنسجة الأمعاء مستأصل حديثا، غير المثبتة من الجهات المانحة أن تفي بجميع معايير البحث المطلوبة للدراسة.
    ملاحظة: هذا البروتوكول يمكن تطويعها للاستخدام مع الفئران والقوارض نماذج أخرى.
    1. فورا على استئصال كل جزء الأمعاء، دقة مسح التجويف مع برنامج تلفزيوني المثلجة أو وسيطة تخزين الأنسجة لإزالة بقايا المواد لومينال أو البراز.
    2. بعد التنظيف والتخلص من النفايات في وعاء واقية مناسبة، غمر النسيج في كمية كافية من الأنسجة سعة التخزين المتوسطة (مثل 3-5 مرات حجم الأنسجة المعوية) وتخزينها في البلاستيك المسمى فردياً، والمياه محكم حاويات، غارقة في الجليد أو المبردة حتى الاستخدام).
    3. عملية النسيج في غضون 18-26 ساعة من وقت جمع لمنع تدهور الجيش الملكي النيبالي كبيرة.
      ملاحظة: اعتماداً على نظافة القطعة المعوية والتخزين، قد يكون ممكناً تمديد المهلة الزمنية المقترحة لدينا.
  2. تحضير جميع المواد اللازمة لجمع الأنسجة البشرية في وقت مبكر، كما هو مبين في هذا البروتوكول (انظر الجدول للمواد للحصول على معلومات أكثر تفصيلاً المنتج). تأكد من أن كافة المطلوبة يتم ارتداء معدات الحماية الشخصية في جميع الأوقات.
  3. إعداد دلاء الثلج الجاف جنبا إلى جنب مع ملاط ثلج الجاف كما هو مبين في الشكل 1.
    1. سحق الثلج الجاف ما يكفي لملء 4 دلاء الثلج دائرية القياسية ودلو الجليد مستطيل واحد. يجب أن يكون واحد من الدلاء القياسية المختبرات الصغيرة (11 × 21 سم) الأنسجة وضعت على سطح الجليد الجاف. إذا كان ذلك ممكناً، استخدام صناديق جديدة، ولم يتم فتحها من مختبر الأنسجة.
    2. جعل من ملاط ثلج الجاف بووديريزينج L 2 الثلج الجاف في دلو الجليد نظيفة مستطيلة.
    3. إضافة 2 ميغا بايت قبل مبردة تصل إلى سطح الجليد الجاف. قليلاً خلط وتسطيح الملاط استخدام غطاء مربع تلميح ماصة لسطح الشكل الطين إلى قناة محاط بقطعة أكبر من الثلج الجاف على طول جانبي دلو مستطيلة.
    4. مكان عدة كتل الجليد الجاف على طول حواف دلو الجليد رقيقة لتشجيع تجميد أكثر سرعة. وينبغي أن يكون هناك مجال لقوالب قاعدة إيه فور لتناسب فضفاضة في دلو الملاط الثلج الجاف في وقت معين.
      1. بشكل اختياري، شغل المكدس دلو الجليد داخل دلو الجليد مستطيل آخر ¼ مع الثلج الجاف. هذه المواقع تساعد على عزل أفضل الملاط الثلج الجاف ويحول دون الحاجة إلى إجراء تعديلات متكررة من الثلج الجاف و 2 ميغا بايت أثناء الإجراء.
    5. ضع دلاء الثلج الجاف في خط تجميع حسب الترتيب التالي: 1) الثلج الجاف دلو ملاط، 2) مختبر دلو الجليد الجاف الأنسجة، 3 و 4) العادي دلاء الثلج الجاف، دلو الثلج الجاف 5) مستطيلة الشكل (الشكل 1أ).

2-إعداد الأنسجة المعوية البشرية المجمدة فلاش

ملاحظة: يمكن أن تأخذ هذه العملية برمتها بين 45-80 دقيقة لكل قطعة الأمعاء، اعتماداً على نوعية الأنسجة المعوية. نوصي أيضا بجمع عينات مراقبة الجودة لتقييم نوعية الجيش الملكي النيبالي وعلم الأنسجة قبل المتابعة مع LCM.

  1. ملء علبة كبيرة مع الجليد الرطب وألواح التقطيع الجراحي فوق الجليد الجاف.
  2. في هذا الإعداد، تشيل قنينة 500 مل و 100 مل لتخزين الأنسجة والأجزاء المشذبة في حل التخزين البارد. قوالب قاعدة قبل البرد في مجالس القطع بحيث تكون مستعدة لتلقي الأنسجة.
  3. عند استلام الأنسجة المعوية جديدة، من أجل إيقاف الوسائط التي يتم نقل الأنسجة والاحتفاظ به في قنينة مبردة مسبقاً. ترك بعض الغرف في هذه الأكواب لتخزين مؤقت للأنسجة المعوية والأجزاء المشذبة، التي سيتم إعدادها في الخطوات اللاحقة.
  4. قص الجزء المعوية بطول 20 سم تقريبا، التي تنص على الأنسجة وافرة (40-60 سم2) لتوليد الحمض النووي الريبي للتطبيقات المصب وعينات مراقبة الجودة. اعتماداً على سلامة النسيج، قد يكون مجديا لإنجاز عزل الحمض النووي الريبي للتجهيز النهائي بطول أصغر بكثير (أي 5 سم الأمعاء).
  5. تقليم بعيداً الدهنية والنسيج الضام من الأمعاء باستخدام مقص جراحي. بقايا الدهنية على طول سيروسا المعوية ينال من قدرة على كامل تسطيح النسيج في الخطوات اللاحقة. تقليم الأنسجة، تفاديا نيكينج سيروسا أثناء إزالة الدهون والنسيج الضام، الذي يمكن أن تلف الضفيرة myenteric هيكلياً أو جعل السطح الخارجي للأنسجة تسطيح غير متكافئ لتقطيع بعناية.
  6. إجراء شق طولي على طول العينة المعوية، يفضل أن تكون في موقع مرفق المساريقي العلوي.
  7. تشريح بعيداً وتجاهل القولونية تنيا من القولون، ذلك لأنه يقوم بتسوية أكثر سهولة، بعد الإفراج عنه من التوتر.
  8. تباعد الجانب الغشاء المخاطي للامعاء إلى أسفل على قطع مثلجة مجلس وقطع 1.25 سم المنظومة الشرائط من طول كامل من الأنسجة.
    ملاحظة: توسع الأنسجة المعوية غالباً ما بعد التشذيب، حيث ينبغي تعديل هذا الحجم تبعاً لذلك.
  9. مؤقتاً تخزين الشرائط في حل تخزين الأنسجة المبردة.
    ملاحظة: نحن نستخدم UW بلزر الحل التخزين البارد لأنها حياة طويلة الجرف، وفعالة من حيث التكلفة نسبيا ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى حاجة.
  10. إزالة من قطاع أنسجة من الحل التخزين البارد وقطع عليه في قطاعات ~1.5-2 سم طويلة.
  11. لطخة قطاعات الأمعاء في كومة من المسحات المختبرية، لإزالة السائل الزائد ومنع تشكيل بلورات الثلج على طول سيروسا المعوية خلال فلاش-تجميد بسرعة. إذا هو لم يجف النسيج بما فيه الكفاية، سيكون من الصعب الحصول على مقاطع عالية الجودة من الضفيرة مينتيريك.
  12. يكمن الجانب الغشاء المخاطي لمسح القطع المعوية إلى مبردة مسبقاً، وكبير، والمتاح بلاستيكية قاعدة العفن (37 مم × 24 مم × 5 مم).
  13. عناية تسطيح كل قطعة باستخفاف تمتد الأنسجة سطح القالب الأساسي واستخدام الملقط منحنية بلطف اضغط لأسفل وطرد أي فقاعات الهواء التي قد حوصروا تحت سيروسا. علما بأن يوسع الأنسجة أثناء التسوية. إذا لزم الأمر، تقليم الأجزاء وقطع العينات المتبقية في حجم أصغر.
    ملاحظة: إذا كانت الأنسجة طاقتها، وهذا سوف يشوه الضفيرة مينتيريك. بعد أن تتم إزالة جميع فقاعات الهواء، تقييم سمك العينة قبل التجميد. إذا لزم الأمر، دفع الحواف من الداخل العينة حتى تقترب العينة المعوية سمك الأصلي.
  14. ضع القالب قاعدة محملة على سطح الجليد الجاف، ملاط 2 ميغا بايت. ينبغي تجميد الأنسجة تماما خلال 30-60 ثانية، اعتماداً على حجم وسمك الجزء المعوية.
  15. الجاف للجزء السفلي من القالب الأساسي لإزالة 2 ميغا بايت المتبقية بسرعة فرك العفن قاعدة في مختبر الأنسجة مبردة مسبقاً في دلو الثانية من الثلج الجاف.
  16. نقل العينة المجففة إلى الحوض الثالث من الثلج الجاف، ودفنها تحت سطح الجليد الجاف حتى أنها مستعدة لأن تكون ملفوفة.
  17. مراقبة الجزء السفلي من القالب الأساسي قبل الالتفاف، لدراسة النوعية لإعداد نموذج بسرعة. جعل علما بأي عينات لا تظهر مسطحة أو يكون فقاعات الهواء الكبيرة، كما ينبغي تجنب هذه كريوسيكتيونينج و LCM.
  18. لف العينة في رقائق الألومنيوم المسمى مسبقاً التي وضعت فوق الثلج الجاف في دلو من حيث أنه يحدث التفاف أنسجة بينما يجري أبقى مجمدة تماما.
  19. لف عينة بطبقة من البلاستيك، للتقليل من جفاف الأنسجة أثناء التخزين في-80 درجة مئوية.
  20. تخزين العينات في دلو مستطيلة حتى تكون جاهزة لنقلها إلى الثلاجة.
  21. قبل التسمية وقبل chill مربعات المجمد في-80 درجة مئوية للتخزين المباشر لعينات بعد جمع.
  22. أخذ جزء صغير من الأنسجة من كل قطعة الأمعاء لتقييم سلامة الحمض النووي الريبي قبل إجراء LCM.
    1. قبل تسمية أنبوب رناسي خالية 2 مل لكل قطعة، مليئة إيه فايف زيرو زيرو ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت. ونحن نوصي باستخدام أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "د"، المدرجة في الجدول للمواد.
    2. مجانسة قطعة صغيرة (2 × 2 مم) من الأمعاء في أنسجة قياسية البالغة الصغر-الخالطون (20-40 ثانية، حتى تبقى لا قطع الأنسجة). ثم، فورا بتجميد الجيش الملكي النيبالي على الثلج الجاف ومخزن في-80 درجة مئوية حتى الشروع في استخراج الحمض النووي الريبي.
    3. بشكل اختياري، تضمين بعض الفروع في الأنسجة المتوسطة التجميد (ينص) كنسخة احتياطية. إعداد مقاطع الأنسجة في الضبط بنفس الطريقة الموضحة في هذا القسم، ولكن غمر العينات في ينص ضمن القالب الأساسي قبل تجميد فلاش.

3-كريوسيكتيونينج

  1. قبل كريوسيكتيونينج، إعداد جميع المواد اللازمة لتلوين والجفاف ونقل عينات الأنسجة المرجوة من الثلاجة-80 درجة مئوية في دلو من الجليد الجاف.
  2. إعداد كريوستات لاستخدام الإعداد الأمثل خفض درجة حرارة (-18 إلى-22 درجة مئوية) ومسح أسفل الأسطح مع الإيثانول 100% وعلاج الشفرة وفرشاة صينية مع رناسي إزالة التلوث الحل.
  3. أفضل التقيد العينة لتشاك، استخدام الطريقة التالية.
    1. ضع الملقط في الثلج الجاف لمالا يقل عن 30 ثانية قبل إزالة التغليف العينة المعوية ووضعها على سطح الجليد الجاف serosa-الجانب-متابعة.
    2. صب التلة 3-5 مم من الأنسجة المتوسطة التجميد (ينص) على حامل عينات كريوستات كبيرة ونقل على الفور عينة المعوية serosa-الجانب الهاتفي على ينص.
    3. بسرعة نقل صاحب العينة للثلج الجاف، وتغطي مع الثلج الجاف بووديريزيد بعد السماح لينص على التمسك بالعينة s 2-5 في درجة حرارة الغرفة. ضمان بقاء ينص أسفل طائرة الضفيرة مينتيريك.
      ملاحظة: من الناحية المثالية، على السطح الخارجي للغشاء المخاطي للامعاء سوف يتقيد تقيدا تاما ينص قبل أن يبدأ ينص تجميد دون ذوبان الجليد من العينة.
  4. جبل صاحب العينة في الرأس كريوستات عينة ومحاذاة العينة مع بليد كريوستات، حيث لا تكون موازية لشفرة قطع طائرة الضفيرة مينتيريك.
  5. تعيين سمك تقطيع كريوستات إلى 8 ميكرون. والغرض من محاذاة تماما العينة الحصول على مساحة ممكنة أعظم الضفيرة مينتيريك على كل شريحة. هذا السمك ينصح عموما للأنسجة البشرية والقوارض، ولكن يمكن تعديلها حسب الحاجة.
  6. قسم من خلال سيروسا وعضلة طولانية حتى وصلت إلى ضفيرة مينتيريك.
    1. لتحديد موقع الضفيرة myenteric، تحميل مقطع عينة إلى شريحة ووصمة عار المقطع مع صبغ مائي، مثل 1% كريسيل البنفسجي أو الأزرق تولويدين، إلخ.
    2. قم بعرض المقطع تحت مجهر خفيفة في 40-2000 X التكبير التعرف على مفترق الطرق بين طبقات العضلات الطولية والدائرية. معلمات مجهر ترد في الجدول للمواد. في بداية تمزيقها، سيتم وضع علامة سيروسا بسبب وجود النسيج الضام. قد تكون بعض الدهون المساريقي العلوي المتبقية الحالية على طول سيروسا أيضا. ثم يبدأ ورقة من طبقة العضلات الطولية الخارجي. حالما يتم التوصل إلى الحدود بين طبقات العضلات الطولية والدائرية، سيجري الاحتفال بجزء من العقد المعوية.
      ملاحظة: في عدة أقسام القادمة، سوف تصبح الضفيرة myenteric واضح جداً، مع مساحات كبيرة من ganglia موجودة داخل قسم واحد (الشكل 2-ج). إذا لم يكن الأنسجة مسطحة تماما في بداية تمزيقها، ثم جزء فقط من العقد ستكون موجودة في كل قسم في وقت معين. في بعض الأحيان، قد عينة المعوية ضفيرة myenteric طبيعتها متفاوتة، على الرغم من الأنسجة التي تظهر مسطحة تماما. وهذا ينطبق بشكل خاص لعينات العفج. في تجربتنا، هذه العينات يمكن أن يستغرق وقتاً أطول لمعالجة مع LCM، بل يكفي الجيش الملكي النيبالي يمكن جمعها ضمن الدورة ليوم واحد. الموقع الدقيق الضفيرة مينتيريك يمكن أن تختلف اختلافاً كبيرا بين العينات، استناداً إلى الأنسجة والتحضير له قبل التجميد.
  7. البدء في جمع مقاطع المسلسل ل LCM، مع مجموعات المثلى توفير أكبر عدد من الخلايا العصبية وإطلاق كل شريحة. اعتماداً على المساحة السطحية للعينة، ويمكن الجمع بين عدة مقاطع إلى شريحة قلم-غشاء مفرد.
  8. تحميل المقاطع على الشرائح غشاء القلم، مبردة بإيجاز في كريوستات ل s 5-10. عند تركيب، ينبغي أن تذوب الأنسجة إلا قليلاً، أقصى الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي.

4-التلوين

ملاحظة: للمحة عامة عن عملية المصبوغة، الرجوع إلى الجدول 1. تعد جميع الحلول المستخدمة في قارورة مخروطية 50 مل القياسية. علاج خارج الأنابيب مع رناسي إزالة التلوث الحل لا يبدو أن تحسين النتائج (البيانات لا تظهر).

  1. تعد حلاً مشبعة من 4% كريسيل البنفسجي في الإيثانول 95% على الأقل يوم واحد في وقت مبكر، وإعادة تعليق البنفسجي كريسيل قبل تحميل المحاقن بشكل كامل.
    ملاحظة: قد تحتاج تركيز الإيثانول تخفيضها لتلطيخ فعال، كما هو موضح في جزء المناقشة. ونحن لم اختبر ما إذا كان استخدام الإيثانول 50% أو 75% خلال تلطيخ كبير يقلل من سلامة الحمض النووي الريبي. كريسيل البنفسجي هو حساسة للضوء، وهكذا ينبغي أن تكون محمية من الضوء.
  2. بعد تركيب أبواب الضفيرة myenteric على الشريحة، تغرق فورا الشريحة في قنينة مخروطية من الإيثانول 95% (مبردة مسبقاً في-20 درجة مئوية) لمدة 30 ثانية.
    1. إذا لم تتقيد الأقسام تماما الشريحة في الخطوة السابقة، قليلاً دافئ أسفل الشريحة مع القفاز يد (مسح مختبرات ينبغي وضعها في الفترات الفاصلة بين الشريحة والقفازات)، للتقيد الكامل قبل غمر في الإيثانول 95%. يمكن إعادة استخدام الشرائح على الأقل 3-6 هذا الحل دون الحد من سلامة الحمض النووي الريبي.
  3. وضع الوجه شرائح لأعلى على مسح مختبر توضع فوق حاوية قبل المعالجة، وخالية من رناسي8.
  4. قبل ملء المحاقن 3 مل مع 4% كريسيل البنفسجي وإرفاق عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون.
    ملاحظة: ونحن نوصي مرشحات خلات السليولوز.
  5. ضع 6-10 قطرات وصمة مباشرة على أقسام الأنسجة8 واحتضان 10-30 ثانية، أو حتى صبغ كافية يتم الاحتفاظ بها عند إزالة الملون. بينما تلطيخ، بلطف تدوير الحاويات الشريحة باليد للتأكد من أن أقسام الأنسجة المغلفة بالتساوي مع وصمة عار.
  6. إزالة البقع من أجل إيقاف وصمة عار وعلى الفور الشريحة في قنينة إيثانول 75%. مرارا وتكرارا تغرق الشريحة حتى الصبغة الزائدة قد تسربت معظمها من خارج العينة. هذا قد يستغرق ما بين 10-20 ثانية.
  7. وضع الصيغة النهائية لإزالة تلطيخ بها مرارا وتكرارا الغمس العينة في قنينة إيثانول 95% للعينة 10 س. سوبميرجي مرارا وتكرارا حتى إزالة وصمة عار الزائدة جميع.
    1. تعديل مدة ديستينينج، حسب الاقتضاء، لتحسين تلطيخ ganglia. إذا تمت إزالة وصمة عار الكثير، العينة يصبح شفافاً جداً، وقد يكون من الصعب تصور
      ملاحظة: قد الأمثل هذا البروتوكول المصبوغة استناداً إلى عدة منشورات5،،من810،11 الذي يحتاج إلى تعديل قبل أن تم الحصول على نتائج مرضية. ولذلك، ينبغي تعديل تركيز الإيثانول المستخدمة في الصبغ وأثناء عملية ديستينينج، عند الضرورة، الحصول على نتائج أفضل.

5-الجفاف

  1. فورا وتراجع الشريحة في الإيثانول 100% 2-3 مرات، لمجموعة من 10-20 ثانية.
  2. غمر الشريحة في الإيثانول 100% لا مائي لمالا يقل عن 30 ثانية. كما الإيثانول اللامائى بلورات جداً، إضافة الجزيئية ثقب سيتا (8-12 شبكة) إلى قنينة الإيثانول 100% قبل بدء الإجراء إزالة أي ماء استيعابها وهكذا يذوي أكمل نموذج5.
  3. مرارا وتكرارا وتراجع الشريحة في زيلين نفط عن 15-20 ثانية. هذه الخطوة تماما يزيل طبقة الإيثانول على الشريحة. إضافة ثقب سيتا الجزيئي قبل الموعد المحدد لهذه الأنابيب من زيلين نفط، الكامل الجسميات جزيئات الإيثانول والمياه الزائدة5.
    تنبيه: والزيلين تصنف على أنها مصدر إزعاج للعيون والجهاز التنفسي العلوي، وينبغي أن تستخدم في غطاء الأبخرة كيميائية.
  4. غمر الشريحة في زيلين نفط (مع ثقب سيتا الجزيئية، مش 8-12) لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: يمكن أخذ استراحة قصيرة بعد هذه الخطوة، إذا لزم الأمر. يمكن أن يترك العينات في زيلين نفط لمدة 4-5 ساعات دون الآثار الضارة لتلطيخ، العائد/السلامة LCM أو الجيش الملكي النيبالي.
  5. اختيارياً، وعلى حدة بإعداد عدة شرائح إضافية في هذه المرحلة. إذا كان إعداد جولة ثانية من الشرائح بعد إكمال LCM على كافة الشرائح المعدة، قد تحتاج الأنسجة في كريوستات إلى ريفاسيد، بسبب جفاف سطح الأنسجة. واحد إلى أربعة أقسام قد تحتاج إلى تجاهل قبل يمكن جمعها بأقسام قابلة للاستخدام.

6-ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM)

  1. إزالة الشريحة من زيلين نفط وأيردري في غطاء الأبخرة كيميائية على الأقل 1 دقيقة إدراج خرطوشة من قبعات LCM إلى مرحلة مجهر LCM. تحميل الشريحة على خشبة المسرح، والحصول على صورة عامة للشريحة.
  2. تحديد الموقع الذي تريده ل LCM وتحميل قبعة على الشريحة.
  3. محاذاة ليزر الأشعة تحت الحمراء (IR) وضبط السلطة والمدة جعل قطرها 20-30 ميكرون القبض على الفور.
  4. موقع الليزر الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) وتعيين سرعة القطع المناسبة وكثافة.
  5. مخطط ganglia المطلوب يتم جمعها باستخدام البرمجيات LCM، مع التأكد من البقاء داخل حدود منطقة التحصيل على الغطاء (يصور في الشريحة نظرة عامة للبرنامج كدائرة خضراء).
  6. في كل من الآثار، ضبط البقع الأشعة تحت الحمراء أن هناك على الأقل واحد الأشعة تحت الحمراء بقعة كل 100-500 ميكرون.
  7. اضغط على الزر قص الأشعة تحت الحمراء للأشعة فوق البنفسجية المضي في جمع كافة العقد ملحوظ.
  8. بمجرد الانتهاء من المجموعات، أما نقل الحد الأقصى إلى موقع جديد وكرر عملية جمع أو دراسة الغطاء LCM في محطة مراقبة الجودة بمجرد الغطاء مليء بما فيه الكفاية مع ganglia (أو حتى يتم التوصل إلى الحد الزمني الموصى به من 60 إلى 80 دقيقة).
  9. إذا كان الحطام موجودة على الغطاء، يمسح بعيداً باستخدام الرسام الجميلة ذات الرؤوس تم قبل التعامل مع الحل إزالة التلوث رناسي، وشطفها بماء خال من نوكلاس، وتجفيفها تماما.
  10. بعناية دراسة الغطاء بالعين المجردة أو بالتكبير تحت مجهر حقل مشرق لضمان جميع الأنقاض قد أزيلت. إذا كان لا يمكن إزالة الأنقاض من خلال استخدام الرسام قبل المعالجة، ثم استخدام تلميح ماصة غرامة (رناسي الحرة) إلى كشط بعيداً من تحت الأنقاض.
  11. تأمين الحد الأقصى على مل 0.5 [ميكروفوج] أنابيب مليئة ميليلتر 230 من المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي (RLT المخزن المؤقت من أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "ب"، مع β-mercaptoethanol إضافتها بتركيز 10 ميليلتر/مل).
  12. عكس كاب، بإيجاز ودوامه، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  13. الطرد المركزي في ≥ 5,000 س ز ل 5 دقيقة ونقل بعد ذلك [ميكروفوج] أنابيب للجليد الجاف.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. ويمكن تخزين ليساتيس الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية دون تأثير كبير على تدهور الجيش الملكي النيبالي لمدة أسبوع واحد على الأقل. إذا كان يتم إجراء عزل الحمض النووي الريبي في نفس اليوم، ثم البرد العينات على الجليد حتى أنهم مستعدون للاستخراج.
  14. أداء كافة مجموعات إضافية ضمن المهلة الزمنية القصوى الموصى بها من 80-90 دقيقة بعد إزالة الشريحة من زيلين نفط. كما تتعرض الأجزاء المجففة للرطوبة المحيطة، رنسيس يمكن تدريجيا تصبح تنشيط. قصر فترة التجميع يمكن التقليل من تلك الآثار وأقصى المحافظة على سلامة الحمض النووي الريبي.

7. عزل الحمض النووي الريبي

  1. تعد محطة خالية من رناسي لاستخراج الحمض النووي الريبي.
  2. إعداد جميع الأنابيب والمواد الكاشفة وفقا للدليل "الطقم استخراج الحمض النووي الريبي".
    ملاحظة: في حين تتوفر مجموعات كثيرة لعزل الحمض النووي الريبي عقب LCM، حققنا نجاحا أفضل استخدام أدوات استخراج الحمض النووي الريبي "ب"، المدرجة في قائمة المواد. انظر الشكل 5 مقارنة جنبا بجنب الكواشف استخراج الحمض النووي الريبي.
  3. إزالة عينات من الثلاجة-80 درجة مئوية وسرعة ذوبان الجليد في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  4. فورا إذابة دوامة عينات ل s 2-3 توزيع أملاح ثيوسيانات جوانيدينيوم بالتساوي.
  5. الجمع بين كل عينة مع حجم متساوية من الإيثانول 70%. تجمع ليساتيس 2 أو أكثر معا، إذا لزم الأمر، للوصول إلى تركيز الحمض النووي الريبي كاف.
  6. المضي قدما وفقا لإرشادات الشركة المصنعة في كتيب لعملية استخراج الحمض النووي الريبي، استخدام بروتوكول الأمثل للعينات ميكروديسيكتيد.
  7. الوت الجيش الملكي النيبالي في الخطوة الأخيرة في حجم الحد الأدنى الموصى به المياه خالية من نوكلاس (14 ميليلتر).
  8. بعد عزل الحمض النووي الريبي، الكوة 1-2 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي من كل عينة إلى جديدة قبل المسمى أنبوب رناسي خالية لتقييم نوعية/الجودة مع جهاز ميكروفلويديكس التي يمكن تصور كميات صغيرة من الجيش الملكي النيبالي، مثل بيواناليزير. قاسمة ميليلتر 1 إضافية في أنبوب مستقل للقياس الكمي مع مجموعة أدوات القياس الكمي الحمض النووي الريبي حساسية عالية.
    1. ضبط هذه الخطوات، حسب الحاجة، للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي لتحليل المتلقين للمعلومات (أي.، تجمع عدد أكبر من قبعات LCM قبل استخراج الحمض النووي الريبي).
  9. الجيش الملكي النيبالي مخزن في-80 درجة مئوية حتى جمع العينات كافية لتحليل المتلقين للمعلومات.

النتائج

ونحن قد أدخلت عدة تحسينات على البروتوكولات القائمة التي تمكن من جمع السريع نسبيا من ganglia المعوي من عينات الأمعاء البشرية باستخدام LCM، الوفاء بالمعايير لما يليها الحمض النووي الريبي أولاً، نحن الأمثل التجميد السريع لشرائح الأنسجة المعوية في قوالب قاعدة كبيرة وضعت على سط?...

Discussion

يتيح هذا الإجراء كفاءة جمع ganglia المعوية عديدة كمصدر استخلاص الحمض النووي الريبي لما يليها الحمض النووي الريبي هنا، نحن قد تسارعت العمليات الواردة في البروتوكولات القائمة مع أقصى الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. كما كافة الخطوات في هذا الإجراء مترابطة، من المهم أن القضاء على كافة الق...

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgements

ونحن ممتنون للجهات المانحة وأسرهم الذين جعلوا هذا العمل ممكناً. ونقدر أيضا بمساعدة الموظفين في المعهد الدولي للطب والخدمات تينيسي الجهات المانحة للمساعدة في تنسيق مجموعة من الأنسجة المستخدمة في هذه الدراسة. وأيد هذا العمل المنح المقدمة من "المعاهد الوطنية للصحة"، المعاهد الوطنية للصحة OT2-OD023850 لدعم الإدارة البيئية2 وراتب من المعاهد الوطنية للصحة T32-DK007673 إلى أمز. ونحن ممتنون للموظفين من "الموارد المشتركة علم الأمراض المتعدية فاندربيلت" للوصول إلى صك LCM وإسداء المشورة بشأن إعداد الأنسجة. علم أمراض الأنسجة فاندربيلت الموارد المشتركة معتمد جزئيا من المعاهد الوطنية للصحة منح P30-CA068485-14 و U24-DK059637-13. ونشكر مركز الوصول إلى تكنولوجيا الجينوم في قسم علم الوراثة في "كلية الطب في جامعة واشنطن" للمساعدة في تحليل الجينوم. غتاك معتمد جزئيا بالسرطان NCI مركز دعم المنح #P30 CA91842 إلى مركز السرطان Siteman وتكنولوجيات المعلومات والاتصالات/كتسا #UL1TR002345 منحة من المركز الوطني لبحوث الموارد (نكر)، مكون من المعاهد الوطنية للصحة (NIH)، والمعاهد الوطنية للصحة خارطة الطريق للأبحاث الطبية. هذا المنشور هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة الرأي الرسمي لنكر أو المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Neutral-buffered formalinSigmaHT501128-4L
2-MethylbutaneFisherO3551-4
3-mL syringeBD309628
50-mL conical tubes, polypropylene Corning05-526B
Base molds 37x24x5mm, disposableElectron Microscopy Sciences5025511
Belzer UW  Cold Storage SolutionBridge to LifeN.A.
CapSure Macro LCM capsArcturus, ThermoFisherLCM0211
Cling Wrap, Press’n Seal   Glad  N.A. 
Cresyl Violet AcetateAcros OrganicsAC405760025
Cutting BoardElectron Microscopy Sciences63308
Ethanol, 190-proofPharmco-AAPER111000190
Ethanol, 200-proofPharmco-AAPER111000200
Glass Microscope slidesFisher12-550-343
Gloves, extended cuffMicroflex 19010144
Gowns, surgical-disposableKimberly-Clark 19-088-2116
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)Nalgene  1335920B
Kimwipes (large)Kimberly-Clark 34120
Kimwipes (small)Kimberly-Clark 34133
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)ThermoFisherN.A.
Leica Cryostat Chuck, large,  40 mm Southeast Pathology Instrument ServiceN.A. 
Light MicroscopeOlympusCX43
Microscope objective (20X)Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17N.A.
Microscope objective (10X)Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-N.A. 
Molecular SievesAcros OrganicsAC197255000
Nuclease-free waterAmbionAM9937
PicoPure RNA extraction kitApplied Biosystems12204-01
Pellet PestleKimble Kontes4621973
PEN membrane LCM slidesArcturus, ThermoFisherLCM022
RNase-free tubes, 1.5 mLAmbionAM12400
RNaseZAP SigmaSigma-R2020
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure)Applied Biosystems12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy  Micro kit)Qiagen74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol)Invitrogen15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit)Qiagen74134
Splash Shield, disposable faceshieldFisher17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp"Fine Science Tools14002-14
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm)Nalgene  190-2520
Tissue Freezing MediumGeneral Data HealthcareTFM-5
XylenesFisherX3P1GAL

References

  1. Gershon, M. D. . The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).
  2. Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
  3. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
  4. Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
  5. Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  6. Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
  7. . PALM Protocols - RNA handling Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011)
  8. . Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015)
  9. . Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
  10. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  11. Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
  12. Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
  13. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
  14. Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
  15. Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
  16. Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
  17. Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
  18. Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
  19. Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
  20. Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  21. Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136 LCM ganglia Seq

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved