صبغ FM ركوب الدراجات في المشبك: مقارنة Depolarization البوتاسيوم عالية، الكهربائية وتحفيز تشانيلرهودوبسين

Summary

حويصلة متشابك (SV) ركوب الدراجات هو الآلية الأساسية للاتصالات بين الخلايا في نهايات الخلايا العصبية. امتصاص صبغ FM وإطلاق سراح هي الوسيلة الأساسية للمعايرة الكمية SV إندو-والرقابة. هنا، نحن نقارن جميع أساليب التحفيز محرك FM1-43 ركوب الدراجات في المشبك نموذج الوصلات العصبية العضلية (NMJ) المورفولوجية .

Abstract

وتستخدم الأصباغ FM لدراسة دورة حويصلة متشابك (SV). هذه المسابر amphipathic تحتوي على رأسه ماء وذيل مسعور، جعلها للذوبان في الماء مع القدرة بشكل قابل للعكس الدخول والخروج غشاء دهني بليرس. هذه الأصباغ ستيريل نسبيا غير الفلورية في وسط مائي، ولكن أسباب الإدراج في المنشور الخارجي من غشاء البلازما > زيادة 40 س في الأسفار. في نهايات الخلايا العصبية، يتم استيعابه الأصباغ FM خلال SV الالتقام، الذين يتم الاتجار بهم داخل وبين تجمعات SV، وتم إصدارها مع الرقابة SV، توفير أداة قوية لتصور presynaptic مراحل كبيرة. يعتبر نموذج الجينية الأولية وضع المشبك جلوتاماتيرجيك والدالة المورفولوجية الوصلات العصبية العضلية (NMJ)، حيث صبغ FM التصوير قد استخدمت على نطاق واسع لقياس ديناميات SV في طائفة واسعة من الظروف المسخ. المحطة الطرفية متشابك NMJ يتم الوصول إليها بسهولة، مع مجموعة جميلة من boutons متشابك كبيرة مثالية لتطبيقات التصوير. هنا، يمكننا مقارنة وعلى النقيض من ثلاث طرق لتحفيز المورفولوجية NMJ محرك تعتمد على نشاط امتصاص صبغ FM1-43/الإفراج عن: 1) حمام تطبيق عالية [ك⁺] ديبولاريزي الأنسجة العضلية، 2) شفط العصب المحرك الكهربائي التحفيز ديبولاريزي الأعصاب presynaptic الطرفية، و 3) تستهدف التعبير المحورة وراثيا من المتغيرات تشانيلرهودوبسين للسيطرة المكانية، وحفز الضوء على ديبولاريزيشن. كل من هذه الأساليب على مزايا وعيوب لدراسة تأثيرات الطفرات الوراثية المتعلقة بدوره SV في المورفولوجية NMJ. وسوف نناقش هذه المزايا والعيوب لمساعدة اختيار النهج التحفيز، جنبا إلى جنب مع منهجيات محددة لكل استراتيجية. بالإضافة إلى تصوير فلوري، يمكن أن تكون الأصباغ FM فوتوكونفيرتيد إلى إشارات إلكترون كثيفة تصور استخدام مجهر إلكتروني (TEM) لدراسة آليات دورة SV على مستوى ultrastructural. نحن نقدم المقارنات من [كنفوكل] والمجهر الإلكتروني التصوير من أساليب مختلفة من التحفيز NMJ المورفولوجية ، للمساعدة في توجيه اختيار النماذج التجريبية المقبلة.

Introduction

وقد استخدمت تتميز جميل المورفولوجية اليرقات الوصلات العصبية العضلية (NMJ) جلوتاماتيرجيك المشبك نموذج لدراسة تشكيل المشبك والدالة مع طائفة واسعة من الاضطرابات الوراثية¹. المحطة الطرفية العصبون يتكون من فروع إكسون متعددة، كل مع العديد من بتونس متشابك الموسع. هذه varicosities رحيب (تصل إلى 5 ميكرومتر في القطر) تحتوي على جميع الأجهزة كبيرة، بما في ذلك الحويصلات جلوتاماتيرجيك موحدة متشابك (SVs; ~ 40 نانومتر في القطر) في محمية سيتوسوليك وسهولة يمكن نشرة برك². قفص الاتهام هذه الحويصلات في غشاء البلازما presynaptic الانصهار الموقع النشط المناطق (المزرعة)، حيث يتوسط الرقابة الإفراج العصبي الغلوتامات السكك-الاتصالات متشابك. وفي وقت لاحق، SVs يتم استردادها من غشاء البلازما عن طريق إعادة تدوير قبله، وتشغيل أو كلاثرين بوساطة الالتقام (CME) لدورات متكررة exo/الالتقام. المورفولوجية NMJ يسهل الوصول إليها ومناسبة تماما لعزل ووصف SV دورة طفرات على السواء. استخدام شاشات الجينية إلى الأمام، أدت الطفرات الرواية إلى تحديد الجينات الجديدة الحاسمة ل دورة SV³. وعلاوة على ذلك، أدت عكس النهج الوراثية بدءاً من الجينات معروفة بالفعل لاستيضاح SV دورة آليات جديدة من خلال الوصف الدقيق للمسخ ركوب الدراجات تعمل⁴. المورفولوجية NMJ مثالي تقريبا كإعداد متشابك تجريبية لتشريح آليات SV الالتقام والرقابة عن طريق أساليب بصريا حويصلة المسار الدراجات خلال كبيرة.

تسمح مجموعة من علامات مضيئة التعقب البصرية من الحويصلات أثناء ركوب الدراجات الديناميات، ولكن أكثر تنوعاً FM صبغ النظير الذي يتم تصنيعه أولاً قبل ماو، واو، وآخرون. ⁵-هيكلياً، تحتوي على صبغات FM رأسه ماء وذيل محبتين متصلاً من خلال عصابة عطرية، مع منطقة الوسطى منح الخواص الطيفية. ستيريل هذه الأصباغ التقسيم عكسية في الأغشية وليس 'التقلب المفاجىء' بين منشورات الغشاء وحتى لا تكون ابدأ حرة في سيتوسول، وهي أكثر بكثير من الفلورسنت في أغشية من المياه⁵. عكسها الإدراج إلى بلير دهن يؤدي زيادة محاطاً fluorescence⁶. في نهايات الخلايا العصبية، تتكون كلاسيك FM صبغ تجارب وضع العلامات للاستحمام إعداد متشابك مع الصبغ أثناء ديبولاريزينج التحفيز لتحميل صبغة عن طريق الالتقام SV. صبغ خارجي ثم جرفت ويلقي القبض عليه في دورة SV في حل خالية من الكالسيوم في المسابقة للصورة المحملة نهايات⁷. جولة ثانية من التحفيز في حمام خالية من صبغة مشغلات إطلاق سراح وزير الخارجية من خلال الرقابة، عملية التي يمكن اتباعها من قبل قياس انخفاض كثافة الأسفار. ويمكن السكان SV من حويصلة واحدة لحمامات السباحة التي تحتوي على مئات حويصلات كمياً رصد^6،7. وقد استخدمت الأصباغ FM لتشريح وتعتمد على نشاط تعبئة متميزة وظيفيا SV برك، ومقارنة قبله وتشغيل مقابل CME ركوب^8،9. تم تعديل الأسلوب لكل على حدة بالانزيم أثارت، دورة متشابك عفوية ومصغر الأنشطة (مع معدات حساسة للغاية للكشف عن تغييرات صغيرة جداً الأسفار والحد من فوتوبليتشينج)¹⁰. فحوصات يمكن تمديدها إلى مستوى ultrastructural قبل فوتوكونفيرتينج إشارة FM الفلورية إلى تسمية وحدة إلكترون كثيفة لانتقال الميكروسكوب الإلكتروني^11،،من^1213،14 .

تاريخيا، كانت الاستعدادات الاستحمام متشابك في تركيزات عالية من البوتاسيوم (يشار إليه فيما يلي "عالية [ك⁺]") الأسلوب المفضل للتحفيز لحمل SV ركوب الدراجات؛ ديبولاريزينج بدءاً من الضفدع اتروبين NMJ⁵، إلى مثقف القوارض الدماغ الخلايا العصبية هيبوكامبال¹⁵، إلى المورفولوجية جلوتاماتيرجيك NMJ النموذجي^16،17. هذا النهج [ك⁺] عالية بسيط، يتطلب أي معدات متخصصة، وهو وبالتالي الوصول إلى معظم المعامل، ولكن قيود لتطبيق وتفسير البيانات. أسلوب أكثر بكثير من الناحية الفسيولوجية مناسبة لاستخدام الشفط الكهربائي التحفيز الكهربائي للعصب^4،،من⁵¹². هذا النهج محركات نشر إمكانات العمل لحفز مباشرة للعصب بريسينابتيك المحطة الطرفية، ويمكن مقارنة النتائج مباشرة إلى فحوصات الكهربية كبيرة وظيفة^{13،14، 15}، لكن يتطلب معدات متخصصة وتحديا تقنيا أكثر بكثير. ومع ظهور أوبتوجينيتيكس، استخدام تشانيلرهودوبسين الخلايا العصبية التحفيز على مزايا إضافية، بما في ذلك سيطرة الزمانية المكانية للتعبير قناة باستخدام نظام Gal4/UAS ثنائي²⁰. هذا النهج هو من الناحية التقنية أسهل بكثير من التحفيز الكهربائي الشفط ويتطلب شيئا أكثر من مصدر ضوء LED رخيصة جداً. وهنا، نحن نوظف تصوير FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) بيريدينيوم dibromide) لكل مقارنة وهذه ثلاثة أساليب التحفيز المختلفة في المورفولوجية NMJ: عالية بسيطة [ك⁺ ]، تحدي النهج تشانيلرهودوبسين الكهربائية وجديدة.

Protocol

1-اليرقات الغراء تشريح

1. مزيج دقيق 10 أجزاء من سيليكون الاستومر قاعدة مع جزء 1 من سيليكون الاستومر علاج عامل من مجموعة الاستومر (جدول المواد).
2. معطف كوفيرسليبس الزجاج 22 × 22 ملم مع الاستومر وعلاج على صفيحة ساخنة في 75 ˚C لعدة ساعات (حتى لم يعد مثبت للمس).
3. ضع ساترة واحد زجاج الاستومر المغلفة في قاعة تشريح الزجاج plexi مصنوعة خصيصا (الشكل 1، أسفل) تحضيرا لتشريح اليرقات.
4. إعداد الماصات الغراء من زجاج البورسليكات الشعرية استخدام ساحبة ميكروليكترودي قياسية للحصول على الاستدقاق المرجوة وتلميح الحجم.
5. كسر قبالة رأس ميكروبيبيتي، وفي الطرف الآخر بلطف، وإرفاق 2 متر أنابيب بلاستيكية مرنة (1/32 "قطرها الداخلي، معرف 3/32" خارج القطر، القطر الخارجي؛ 1/32 "الجدار؛ جدول المواد) مع الفم المناسب (نصيحة ماصة P2).
6. ملء حاوية صغيرة (0.6 مل ايبندورف أنبوب cap) بحجم صغير (~ 20 ميليلتر) الغراء (جدول المواد) تحضيرا لتشريح اليرقات.
7. ملء الدائرة مع المحلول الملحي (في مم): 128 كلوريد الصوديوم، 2 بوكل 4 مجكل₂، كاكل 1₂, 70 السكروز وحمض 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 (حبيس) الرقم الهيدروجيني 7.2.
8. إضافة جسم البيروكسيديز (HRP) فجل الحصان المضادة مترافق إلى أليكسا فلور 647 (مكافحة-HRP:647؛ وتمييع 01:10 من مخزون 1 ملغ/مل) لوضع العلامات NMJ presynaptic الطرفية أثناء تشريح^21،22.
9. استخدام الرسام ما يرام (حجم 2)، إزالة تجول الطور ثالث من القنينة الغذاء ووضعه على الزجاج غطاء الاستومر المغلفة.
10. ملء نصيحة ميكروبيبيتي الزجاج مع كمية صغيرة من الغراء باستخدام ضغط الهواء السلبي التي تم إنشاؤها عن طريق الفم مع المرفقات (الخطوة 1، 5).
11. موقف يرقة الظهرية الجانب الأعلى مع الملقط والصمغ إسقاط الرأس ساترة الاستومر المغلفة مع صغيرة من الغراء باستخدام ضغط الهواء الإيجابي عن طريق الفم.
12. كرر هذا الإجراء مع نهاية الخلفي لليرقة، مع التأكد من أن يتم تمدد الحيوان مشدود بين المرفقات الغراء اثنين.
13. استخدام مقص (شفرات 3 مم؛ الجدول للمواد)، جعل قطع أفقي (~ 1 مم) في مؤخرة وقطع عمودي على طول خط الوسط الظهرية.
14. برفق باستخدام الملقط غرامة (#5، الجدول للمواد)، إزالة الظهرية القصبة الهوائية والأمعاء، والدهون في الجسم والأجهزة الداخلية الأخرى التي تغطي العضلات.
15. كرر الإجراء الالتصاق اللوحات جدار الجسم أربعة، والتأكد على امتداد الجدار الجسم بلطف أفقياً وعمودياً.
16. رفع الحبل البطني العصب (فنك) باستخدام الملقط، قطع الأعصاب الحركية بعناية مع المقص، ومن ثم إزالتها تماما فنك.
17. يستبدل المحلول الملحي تشريح Ca^{2 +}-مجاناً المالحة (نفس المحلول الملحي تشريح أعلاه دون كاكل₂) لوقف SV ركوب الدراجات.

2-الخيار 1: عالية [ك⁺] صبغة FM تحميل

1. من حل أسهم FM1-43 (4 ملم)، إضافة ميليلتر 1 إلى 1 مل من 90 مم حل بوكل (عالية [ك⁺] في المحلول الملحي التشريح) لتركيز نهائي من 4 ميكرومتر.
2. استخدام ماصة، استبدال Ca^{2 +}-سالين مجاناً في قاعة التصوير مع الحل صبغ FM [ك⁺] عالية لتحفيز امتصاص صبغ الالتقام SV.
3. البدء فورا في جهاز توقيت رقمي لمدة محددة سلفا للسامية [ك⁺] ديبولاريزينج فترة التحفيز (على سبيل المثال-، 5 دقيقة؛ الشكل 2).
4. للتأكد من إعداد يرقات صحية، ملاحظة تقلصات قوية للعضلات لمدة فترة depolarization [ك⁺] عالية.
5. عند انتهاء فترة الموقت، بسرعة إزالة الحل صبغ FM [ك⁺] عالية واستبدال مع Ca^{2 +}-المالحة مجاناً لوقف SV ركوب الدراجات.
6. أغسل في تتابع سريع مع Ca^{2 +}-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الحل صبغ FM [ك⁺] عالية هو إزالتها بالكامل.
7. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة^{2 +}-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل].

3-تصوير: [كنفوكل] مجهرية

1. استخدام مجهر [كنفوكل] تستقيم مع 40 × الهدف غمر المياه إلى NMJ صورة صبغ الفلورية (يمكن استخدام المجاهر الأخرى).
2. صورة العضلات NMJ 4 شرائح البطن 2-4 (يمكن تصويرها الأخرى نمجس) وجمع الصور باستخدام البرمجيات المناسبة (جدول المواد).
3. استخدام ليزر زناد 633 نانومتر لإثارة HRP:647 (مع مرشح تمرير طويل > 635 نانومتر) والارجون 488 نانومتر ليزر إثارة FM1-43 (مع ممر الموجه مرشح 530-600 nm).
4. عمليا تحديد الربح الأمثل والإزاحة لكل القنوات.
   ملاحظة: هذه الإعدادات سوف تظل ثابتة طوال بقية التجربة.
5. تأخذ كدسة Z [كنفوكل] من خلال أسرة NMJ مختارة من أعلى علامات HRP إلى أسفل الصالة متشابك.
6. تأخذ علما دقيقا ب NMJ المصورة (الجزء والجانب والعضلات) لضمان الزائدة إلى NMJ نفس الدقيق بعد صبغ FM وتفريغ.

4. عالية [ك⁺] التحفيز: FM صبغ تفريغ

1. استبدال Ca^{2 +}-سالين مجاناً مع ارتفاع المياه المالحة [ك⁺] (دون صبغ FM1-43) إلى محرك الأقراص ديبولاريزيشن، الإفراج عن الرقابة وصبغ SV.
2. البدء فورا في جهاز توقيت رقمي لمدة محددة سلفا لفترة التحفيز [ك⁺] عالية (على سبيل المثال-، 2 دقيقة؛ الشكل 2).
3. عند انتهاء فترة الموقت، فورا إزالة المياه المالحة [ك⁺] عالية واستبدال مع Ca^{2 +}-سالين مجاناً لوقف SV ركوب الدراجات.
4. أغسل في تتابع سريع مع Ca^{2 +}-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان ارتفاع المياه المالحة [ك⁺] هو إزالتها بالكامل.
5. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة^{2 +}-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل].
6. أن تكون معينة الصورة الفلورية صبغ FM1-43 في NMJ نفسها المشار إليها أعلاه باستخدام نفس الإعدادات [كنفوكل].

5-الخيار 2: التحفيز الكهربائي صبغة FM تحميل

1. إعداد ماصة شفط استخدام ساحبة ميكرويليكترودي (جدول المواد) للحصول على تفتق المطلوبة وتلميح الحجم.
2. النار-البولندية نصيحة ميكروليكترودي مع الصغرى-فورج حتى يمكن امتص عصب محرك واحد مع تناسب ضيق.
3. الشريحة ماصة شفط على صاحب قطب كهربائي في ميكرومانيبولاتور ونعلق على أنبوب بلاستيكي طويلة مرنة والمحاقن.
4. تعيين معلمات مشجعا (على سبيل المثال-، 15 الخامس 20 هرتز التردد ومدة 20 مللي ثانية والساعة من 5 دقيقة (الشكل 2) أو 1 دقيقة (الشكل 3)).
5. استبدال Ca^{2 +}-سالين مجاناً على إعداد اليرقات مع أعلى المحلول الملحي FM1-43 (4 ميكرومتر؛ كاكل 1 مم₂) على تلاعب الكهربية.
6. وضع التحضير في مرحلة مجهر ورفع المرحلة حتى اليرقة وماصة شفط في التركيز (40 X غمر المياه الهدف).
7. تمتص حلقة من قطع العصب الحركي إينيرفاتينج هيميسيجمينت المحدد مع ضغط الهواء السلبي إنشاؤها بواسطة المحاقن في مسرى شفط.
8. اختبار الدالة القطب شفط مع دفعة قصيرة من التحفيز أثناء الرصد بصريا لتقلص العضلات في هيميسيجمينت المحدد.
9. تحفيز الأعصاب الحركية باستخدام المعلمات المحددة (الخطوة 5.4) محرك الأقراص الالتقام SV وامتصاص صبغ FM1-43 (الشكل 2).
10. أغسل في تتابع سريع مع Ca^{2 +}-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الحل صبغ FM1-43 هو إزالتها بالكامل.
11. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة^{2 +}-المالحة مجانية للتصوير الفوري باستخدام البروتوكول [كنفوكل] التصوير من أعلى.
12. تأخذ علما NMJ المصورة (الجزء والجانب والعضلات) لضمان الوصول إلى NMJ نفس الدقيق بعد تفريغ صبغ FM بعناية.

6-الكهربائية التحفيز: FM صبغ تفريغ

1. استبدال Ca^{2 +}-مجاناً المالحة مع المياه المالحة العادية (بدون صبغ FM1-43) ومكان الإعداد مرة أخرى في مرحلة تلاعب الكهربية.
2. تعيين معلمات مشجعا للتفريغ (مثلاً، 15 ت، 20 هرتز التردد ومدة 20 مللي ثانية والساعة 2 دقيقة (الشكل 2) أو 20 s (الشكل 3)).
3. تمتص العصب المحرك نفسه في مسرى نفس النحو الوارد أعلاه، وحفز ثم تفعيل الرقابة SV والإفراج عن صبغ FM1-43.
4. أغسل في تتابع سريع مع Ca^{2 +}-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الصبغة الخارجية هو إزالتها بالكامل.
5. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة^{2 +}-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل].
6. التأكد من الصورة في الأسفار صبغ FM1-43 في NMJ نفسها المشار إليها أعلاه باستخدام نفس الإعدادات [كنفوكل].

7-الخيار 3: تشاننيلرهودوبسين تحفيز صبغة FM تحميل

1. رفع الإعراب عن ChR2 اليرقات في الأغذية التي تحتوي على الشبكية عبر كل عامل المشارك ChR2 (الذائبة في الإيثانول؛ 100 ميكرومتر التركيز النهائي).
2. مكان إعداد اليرقات في قاعة شبكي في مرحلة مجهر تشريح مزودة بمنفذ كاميرا.
3. إرفاق الصمام أزرق (470 نانومتر؛ جدول المواد) مشجعا لبرمجة باستخدام كبل coaxial ومكان الصمام بمنفذ الكاميرا.
4. وتركز شعاع ضوء LED زرقاء على تشريح اليرقات الدالة استخدام الدالة تكبير المجهر.
5. استبدال Ca^{2 +}-سالين مجاناً على إعداد اليرقات مع أعلى المحلول الملحي FM1-43 (4 ميكرومتر؛ كاكل 1 مم₂) في مرحلة أوبتوجينيتيك.
6. تعيين المعلمات LED باستخدام مشجعا (مثلاً، 15 ت، 20 هرتز التردد ومدة 20 مللي ثانية والساعة من 5 دقيقة (الشكل 2)).
7. ابدأ تحفيز الضوء وتتبع مع جهاز ضبط وقت لمدة محددة سلفا لفترة التحفيز أوبتوجينيتيك (مثلاً، 5 دقيقة؛ الشكل 2).
8. عند إيقاف جهاز ضبط الوقت، بسرعة إزالة الحل صبغ FM واستبدال مع Ca^{2 +}-المالحة مجاناً لوقف SV ركوب الدراجات.
9. أغسل في تتابع سريع مع Ca^{2 +}-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الحل صبغ FM هو إزالتها بالكامل.
10. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة^{2 +}-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل] باستخدام بروتوكول التصوير من أعلى.
11. تأخذ علما NMJ المصورة (الجزء والجانب والعضلات) لضمان الوصول إلى NMJ نفس الدقيق بعد تفريغ صبغ FM بعناية.

8-تشانيلرهودوبسين التحفيز: صبغ FM وتفريغ

1. استبدال Ca^{2 +}-سالين مجاناً مع المالحة العادية (بدون صبغ FM1-43) في مرحلة مجهر تشريح مع منفذ كاميرا LED ركزت على اليرقة.
2. تعيين معلمات مشجعا للتفريغ (مثلاً 15 الخامس، 20 هرتز التردد ومدة 20 مللي ثانية والوقت من 2 دقيقة (الشكل 2)).
3. ابدأ تحفيز الضوء وتتبع مع جهاز ضبط وقت لمدة محددة سلفا لفترة التحفيز أوبتوجينيتيك (مثلاً، 2 دقيقة؛ الشكل 2).
4. عند انتهاء فترة الموقت، بسرعة إزالة الحل صبغ FM واستبدال مع Ca^{2 +}-المالحة مجاناً لوقف SV ركوب الدراجات.
5. أغسل في تتابع سريع مع Ca^{2 +}-مجاناً المالحة (5 x ل 1 دقيقة) لضمان الصبغة الخارجية هو إزالتها بالكامل.
6. الحفاظ على إعداد اليرقات في كاليفورنيا الطازجة^{2 +}-المالحة مجانية للتصوير الفوري مع المجهر [كنفوكل].
7. التأكد من الصورة في الأسفار صبغ FM1-43 في NMJ نفسها المشار إليها أعلاه باستخدام نفس الإعدادات [كنفوكل].

9-الأسفار الكمي

1. لتحميل الصورة في "الصورة ي" (المعاهد الوطنية للصحة مفتوحة المصدر) وإنشاء إسقاط أقصى شدتها بالنقر فوق الصورة | مكدسات | المشروع Z.
2. استخدام المضادة-قناة HRP:647، وانتقل إلى الصورة | ضبط | العتبة والشريحة شريط الأدوات أعلى حتى يتم تمييز فقط NMJ.
3. باستخدام أداة العصا، انقر على NMJ. في حالة الانقطاع NMJ، اضغط الزر Shift وحدد جميع أجزاء.
4. تغيير الصورة إلى القناة صبغ FM1-43 والذهاب إلى تحليل | تدبير الحصول على قياس الأسفار.
5. كرر الخطوات من 9.1-9.4 في صورة "تفريغ" من NMJ نفسه (الجزء التي تم تحديدها، والجانب والعضلات).
6. للحصول على النسبة المئوية للصبغة التي تم إلغاء تحميلها، تأخذ نسبة شدة الأسفار تفريغها أو تحميلها.
   ملاحظة: يمكن تعديل هذا الإجراء لتحليل الأسفار على أساس بوتون الواحدة بوتون باستخدام أما أدوات التحديد "البيضاوي" أو "يدوي". يمكن طرح الخلفية الفلورية بأخذ عينات من الأسفار العضلات. يمكن أيضا إضافة وكلاء للحد من هذه الخلفية.

النتائج

ويبين الشكل 1 تدفق العمل لصبغ FM تعتمد على نشاط التصوير البروتوكول. التجربة يبدأ دائماً بتشريح الغراء اليرقات نفسها، بغض النظر عن أسلوب التحفيز المستخدمة في وقت لاحق. 1a الشكل تخطيطي ليرقة تشريح، عرض الحبل البطني العصب (فنك)، يشع الأعصاب ونم...

Discussion

عالية التحفيز ديبولاريزينج المالحة [ك⁺] هو حتى الآن أسهل من الخيارات الثلاثة لصبغ FM تعتمد على نشاط ركوب الدراجات، ولكن يرجح أن الأقل الفسيولوجية²⁹. هذه طريقة بسيطة ديبولاريزيس كل خلية موجوداً في الحيوان الكامل، وحتى لا يسمح للدراسات الموجهة. قد يكون من الممكن تطبيق محليا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388	To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber	N/A	N/A	Handmade
Borosilicate Glass Capillaries	WPI	1B100F-4	To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-2000	To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	For mouth and suction pipette
P2 pipette tip	USA Scientific	1111-3700	For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap	Fisher Scientific	05-408-120	Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Glue used for dissections
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S5886	For saline
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	M35-500	For saline
Calcium Chloride Dihydrate	Millipore Sigma	C7902	For saline
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	For saline
HEPES	Millipore Sigma	H3375	For saline
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	To label neuronal membranes
Paintbrush	Winsor & Newton	94376864793	To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5	WPI	500233	Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)	WPI	14177	Used during dissection
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Fluorescent styryl dye
Digital Timer	VWR	62344-641	For timing FM dye load/unload
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope	Zeiss		For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0	Zeiss		Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser	Lasos		To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser	Lasos		To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge	WPI	MF200	To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip	BD	301625	To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base)	Narishige	MMN-9	To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator	Grass	S48	To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope	Zeiss		Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective	Zeiss		Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port	Zeiss	2000-C	Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Used for ChR activation
T-Cube LED Driver	ThorLabs	LEDD1B	To control the LED
LED Power Supply	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	To power the LED
Optical Power and Energy Meter	ThorLabs	PM100D	To measure LED intensity