بروتوكولات لاختبار السمية لرواية كيمياء مبيدات الحشرات للبعوض

Summary

ويرد وصف بروتوكولات لتقييم سمية كيمياء للبعوض غير ناضجة والكبار للتنمية كفئات جديدة من مبيدات اليرقات واليافعة وانديكتوسيديس. تمكين البروتوكولات الفائق اختبار كيمياء متعددة في جرعة واحدة نقطة والتقييم اللاحق الجرعة استجابة الإنزيم لتحديد السمية على جهة الاتصال أو عن طريق الابتلاع.

Abstract

فئات جديدة من المبيدات الحشرية مع الرواية طرق عمل ضرورية للسيطرة على السكان مقاومة مبيدات الحشرات من البعوض التي تنقل الأمراض مثل زكى وحمى الضنك والملاريا. فحوصات للسريع، يتم عرض تحليلات الفائق لكيمياء رواية أونفورمولاتيد ضد يرقات البعوض والكبار. يمكننا وصف بروتوكولات لجرعة نقطة واحدة وجرعة استجابة فحوصات لتقييم سمية كيمياء الجزيئات الصغيرة إلى ناقل بعوض الزاعجة المصرية Zika وحمى الضنك والحمى الصفراء، ومكافحة ناقلات الملاريا، Anopheles gambiae والشمالي بيت البعوض، Culex quinquefasciatus، على الاتصال، وعن طريق الابتلاع. على سبيل مثال، نحن تقييم سمية اميتربتيلين، خصم جزيء صغير مستقبلات البروتين-إلى جانب ز، عن طريق اليرقات، والكبار الموضعية والكبار تغذية الدم المقايسة. البروتوكولات توفير نقطة انطلاق للتحقيق في المبيدات الحشرية المحتملة. وتناقش النتائج في سياق تجارب إضافية لاستكشاف تطبيقات المنتج والآليات اللازمة لإيصالها.

Introduction

البعوض يحيل وكلاء المسببة للأمراض المعدية التي تؤثر على صحة الإنسان على الصعيد العالمي¹. أجناس البعوض أهم الثلاثة التي تؤثر على صحة الإنسان هي بعوضة Anopheles، و الحشرات. أنواع بعوض ناقل سيتناقش التي تسبب Zika وحمى الضنك والحمى الصفراء وداء شيكونغونيا. أنواع anopheles ناقلات طفيليات الملاريا ونقل الأنواع Culex فيروس غرب النيل والحبليات فيلاريال². وقد دعا إلى القضاء على من عشرة أهملت المدارية من الأمراض (NTD) بحلول عام 2020³ منظمة الصحة العالمية (WHO) وحددت مكافحة البعوض الاستراتيجية الأكثر قدرة على البقاء. المبيدات الحشرية أدوات قوية السيطرة على البعوض، والحد من انتقال المرض^4،5. ومع ذلك، ظهور السكان البعوض المقاوم للمبيدات الحشرية تهدد استمرار سيطرة العديد من الأمراض^6،،من⁷⁸. اتحاد مراقبة ناقلات مبتكرة (ناقلات) أطلقت أول جهد مكرس لتطوير استبدال المبيدات الحشرية ل مكافحة البعوض⁹. مبيدات حشرية جديدة مع وسائط جديدة للعمل (MoA) ضرورية لتحقيق أهداف منظمة الصحة العالمية، وتحقيق السيطرة على الأمراض. اكتشاف وتطوير فئات مبيدات جديدة مع الرواية مواس تتطلب فحوصات الكائن الحي كله لتحليل سريع والفائق لكيمياء ومقارنة ب معايير الصناعة¹⁰.

تتوفر فحوصات متعددة لتقييم صد والسمية للمبيدات الحشرية على يرقات البعوض البالغ، وبعضها مناسبة لتقييم رواية كيمياء صياغتها أو أونفورمولاتيد. هو بروتوكول منظمة الصحة العالمية¹¹ مقايسة اتصال المستخدمة لاختبار المنتجات ضد يرقات الطور الرابع. تصف الدراسات المنشورة أيضا مجموعة متنوعة من الاختبارات اليرقات المستخدمة لاختبار السمية لكيمياء الجزيئات الصغيرة على يرقات بعوض الزاعجة المصرية، Anopheles gambiae و Culex quinquefasciatus^{10،12، 1314،،،}من¹⁵¹⁶. مراكز "السيطرة على الأمراض" والوقاية منها زجاجة العينة يستخدم لتقييم مقاومة المبيدات الحشرية في الميدان القبض على السكان من البعوض الكبار عن طريق تقييم التركيز المميت (LC) والوقت قاتلة (الملازم) بالمقارنة مع معيار التشخيص جرعة من مبيد حشري التجارية¹⁷. اختبار قابلية منظمة الصحة العالمية يقدم نهجاً آخر لتقييم مقاومة المبيدات الحشرية في البعوض البالغ حيث البعوض يتعرضون لورقة مشربة مبيدات الحشرات داخل قارورة من الزجاج ح 1 ويتم تقييم معدل الوفيات في 24 ح¹⁸. فحوصات أخرى رش تركيبات داخل أقفاص مختومة والبعوض سجل ضربة قاضية والموت في تيميبوينتس المرجوة¹⁹. وقد استخدمت التطبيق الموضعي للصدر البعوض لتقييم فاعلية المبيدات المختلفة²⁰. إنشاء اختبار الحشرات ليفربول (لايت)²¹ تستخدم إجراءات التشغيل الموحدةلتقييم بيواكتيفيتي لكيمياء للبعوض البالغ. ينطبق التحليل الموضعي الكبار لايت كمية صغيرة من المنتج اختبار على الصدر البعوض البالغ مع وفيات سجلت في ح 48. التحليل يمكن تحديد كمية الجرعة المتلقاة في البعوض الفردية²¹. والرزن الرصغي لايت بتقييم سمية اختبار المنتج للبعوض البالغ يستريح على سطح كيميائيا ويستخدم لتحديد كيمياء مع إمكانات للتنمية بخاخ المتبقية داخلي (IRS) أو استخدام في الناموسيات (الناموسيات) للسيطرة على البعوض Anopheles .

منظمة الصحة العالمية وفحوصات الأمراض على قيود لاختبار كيمياء الرواية، أونفورمولاتيد، وهدف الحشري زجاجة منها تقييم قابلية على مدى فترات قصيرة بالانزيم (ساعتين) بدلاً من سمية^22،23. وباﻹضافة إلى ذلك، فحوصات لتقييم سمية كيمياء تسليمها في وجبة الدم والمحتملة لتطوير منتجات الجهازية النيابة (أي، انديكتوسيديس) تنقصها. هنا، يمكننا وصف فحوصات لاختبار نشاط موسكويتوسيدال كيمياء الرواية التي قابلة للذوبان في الماء أو في واحدة من العديد من المذيبات العضوية ضد اليرقات والكبار من بعوضة Anopheles و الحشرات. أولاً، علينا أن نبدي مقايسة يرقات سابقا وصف لدينا مجموعة^10،،من^1213،16، وتؤدي هنا ك (1) جرعة شاشة لتقييم سرعة كيمياء متعددة عند نقطة واحدة، و (2) جرعة استجابة الإنزيم لتحديد تركيز القاتلة (مثل LC_50، LC₇₅ أو LC_90،) الكيمياء واحد. بعد ذلك، يصف لنا فحوصات الكبار اثنين لتحديد الجرعة المميتة (دينار). وأول هذه تعديلاً للبروتوكول لايت لاختبار كيمياء المطبقة موضعياً، رواية ضد البعوض البالغ بالمقارنة مع عنصر تحكم إيجابية. والثاني مقايسة تغذية لتقييم كيمياء تسليم عناصره عبر وجبة الدم.

Protocol

ملاحظة: وصف جميع السلالات والكواشف اللازمة للعمل في البروتوكولات التالية، وموردي المواد المدرجة في الجدول للمواد.

1-ثقافة البعوض اليرقات والكبار

ملاحظة: تتوفر سلالات عرضه مبيدات البعوض من بحوث الملاريا وكاشف إشارة المستودع. أوصى سلالات على النحو التالي: السلالة ليفربول (لفب) بعوض الزاعجة المصرية ، Anopheles gambiae كيسومو (KISUMU1) سلالة والسلالة جوهانسبرغ (JHB) Culex quinquefasciatus .

1. الثقافة يرقات البعوض من البيض في ليلة ح ح 12 يوم/12 دورة في 28 درجة مئوية و 75-85% الرطوبة النسبية (RH) في علب بلاستيكية 25 سم × 40 سم (~ يرقات 400 كل علبة) كما هو موضح ببولي²⁹. تغذية اليرقات عضل الأرض (ألف-مصرية و أشارت gambiae) أو الأغذية السمكية فليك (C. قوينكويفاسسياتوس). لفحوصات اليرقات، جمع اليرقات في مرحلة الطور (L3) اليرقات الثالثة.
2. الخلفية البعوض الكبار من الخوادر التي تم نقلها أكواب بلاستيكية ومكان داخل أقفاص البلاستيك ل 20 في إينسيكتاري مقتضى الشروط الموضحة أعلاه. الحفاظ على البعوض في محلول السكر 20% كما هو موضح في مكان آخر من²⁹. جمع الكبار في ظهور بعد 3-5 أيام.

2-اليرقات المقايسة الاتصال (جرعة نقطة واحدة أو المقايسة استجابة الجرعة)

ملاحظة: يمكن إجراء المقايسة مع كيمياء قابلة للذوبان في الماء أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، شريطة إلا يتجاوز التركيز [دمس] في آبار الاختبار النهائي 1%. المذيبات البديلة قد يكون خياراً، بل أنه من الضروري أولاً التأكد من أن لا تتسبب في تركيز النهائي أكثر من الوفيات 10% في ح 72 وظيفة التعرض. قد يتم تنفيذ المقايسة كجرعة واحدة نقطة أو المقايسة استجابة الجرعة. إذا كان أداء هذا الأخير، من المستحسن اختبار مجموعة من تركيزات (الحد الأدنى من خمسة)، التي تغطي LC المتوقعة₅₀.

1. قم بتسمية الآبار من لوحة النسيج واضح 24-جيدا كما هو مبين في الشكل 1.
2. إعداد حل أسهم لاختبار مادة الكيمياء في أنبوب 1.5 مل.
   1. تزن كل الكيمياء باستخدام رصيد التحليلي، واعتماداً على خصائص الذوبان، إعادة تعليق في ddH العقيمة₂س, [دمس] أو أخرى المذيبات العضوية المناسبة لاختيار (انظر الشكل 2).
      ملاحظة: حسابات يجب أن تأخذ في الاعتبار نقاء الكيمياء. على سبيل المثال، لكيمياء أن 99 ٪ نقية، حل مغ 10.1 في 1,000 ميليلتر من الأسيتون للحصول على حل 1%. ختم مع الفيلم البارافين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
3. تحديد التركيز النهائي لاختبار مادة الكيمياء التي سيتم تقييمها وإعداد تخفيف المسلسل من الحل الأسهم تبعاً لذلك، باستخدام المذيب المناسب.
   ملاحظة: التركيز والحجم للكيمياء والمذيبات يمكن حسابها باستخدام الصيغة ج₁* ت₁= ج₂* V₂ حيث ج₁= تركيز العينة 1، ج₂= تركيز العينة 2، ت₁= حجم عينة 1 وت₂= حجم العينة 2. انظر المثال الحسابات المبينة في الشكل 2 و الجدول 1.
   1. إعداد حل أسهم 10 ملم وتخفيف المسلسل كما يلزم الحصول على تركيزات الاختبار المطلوب (الجدول 1 باء).
4. باستخدام ماصة نقل بلاستيك تحمل على نطاق، نقل خمسة L3 اليرقات إلى البئر لصفيحة اختبار زراعة الأنسجة؛ ويمكن التعرف على يرقات L3 بطول (~ 2.5-3.5 مم) ورأسه كبسولة عرض ~ 0.025 ملم²⁴. بلطف إزالة الماء مع ماصة 1 مل واستبدال وحدة التخزين المطلوبة من ddH₂س (انظر أدناه). تكرار الحصول على n = 4 replicates التقنية كل معاملة (أي 20 يرقات مجموع كل معاملة).
5. إضافة وحدة التخزين المناسبة لاختبار الكيمياء لكل من أربعة آبار نسخ متماثل في لوحة اختبار 24-جيدا ولطف دوامة لوحة لضمان خلط موحد للكيمياء. ضع اللوحة في غرفة الاختبار أو النمو تحت ظروف ثابتة (مثلاً 25 درجة مئوية و ~ 75-85% ويوصي بالصحة الإنجابية، ومن ضوء/12 ح 12 ح الظلام دورة إذا كان ذلك ممكناً).
   ملاحظة: تأكد من لإمكانية تكرار نتائج بين التجارب، يتم إجراء فحوصات لاحقة تحت نفس الظروف البيئية.
6. سجل عدد القتلى غير المستجيبة اليرقات في كل بئر في 30 دقيقة، 1، 1، 5، 2، 3، 24 و 48 و 72 ساعة بعد التعرض (أو النقاط الزمنية البديلة) على ورقة نقاط (الجدول 2). اضغط برفق على الجانب من اللوحة. إذا كان يتم ملاحظة أي حركة، اللمس بلطف اليرقة مع مسواك عقيمة. نقاط اليرقات التي لا تستجيب للتنصت على/اللمس ك "ميتة".
   ملاحظة: يمكن ملاحظة أخرى تعمل الخصائص المورفولوجية والسلوكية ويمكن تسجيلها.
7. تصحيح لوفيات عنصر التحكم باستخدام صيغة أبوت تعديله إذا رغبت، على النحو التالي:
   معدل الوفيات (%) = (س ص) * 100/(100-Y)،
   حيث X = وفيات المئة في عينة المعالجة، و Y = نسبة وفيات في عنصر التحكم.
8. الرسم البياني النتائج كالمدرج التكراري أو المنحنى اللوغاريتمي باستخدام البرمجيات للاختيار مثل بريزم لوح الرسم البياني 6 أو ما شابه، وحساب قيم التركيز المميت (LC) بالنسبة لعنصر التحكم.
9. تكرار الفحص استخدام مجموعة منفصلة من البعوض للحصول على n = 3 أو أكثر البيولوجية replicates.

3-الكبار المقايسة الموضعية (جرعة نقطة واحدة أو المقايسة استجابة الجرعة)

ملاحظة: تجري المقايسة الموضعية الكبار باستخدام الأسيتون كمذيب. المذيبات البديلة قد يكون خياراً، بل أنه من الضروري أولاً التأكد من أن لا تتسبب في تركيز النهائي أكثر من 10% وفيات في 48 ساعة بعد التعرض. ويمكن تنفيذ المقايسة واحد أشر الجرعة أو المقايسة استجابة الجرعة ويتم استخدامه لتحديد الجرعة المميتة (دينار). إذا كان أداء هذا الأخير، من المستحسن اختبار مجموعة من تركيزات (الحد الأدنى من خمسة)، التي تغطي LD المتوقع₅₀.

1. تحديد عدد الكبار البعوض الإناث المطلوبة لإكمال المقايسة.
   ملاحظة: مقايسة جرعة نقطة مع كيمياء واحد سوف تتطلب حدا أدنى البعوض 90 (30 لمراقبة إيجابية، 30 لمراقبة سلبية الأسيتون فقط و 30 لاختبار مادة الكيمياء).
2. ثقافة 3 للبعوض الإناث البالغ عمره 5 أيام ونقل إلى دلو من بلاستيك مل 20 منفصلة باستخدام الشافطة (الشكل 3).
3. قم بتسمية أوز 9 أكواب الورق مع الاسم وتركيز لاختبار مادة الكيمياء. جانبا المربعات مش 10 سم × 10 سم والأربطة المطاطية لكل كوب (انظر الشكل 4).
4. حدد مبيد للحشرات موجودة كعنصر إيجابي (مثلاً، للبيرويثرويد الاصطناعية، بيفينثرين) وإعداد حل أسهم 1% (10 ميكروغرام/ميليلتر) في الأسيتون.
   ملاحظة: حسابات يجب أن تأخذ في الاعتبار نقاء الكيمياء. على سبيل المثال، لكيمياء أن 99 ٪ نقية، حل مغ 10.1 في 1,000 ميليلتر من الأسيتون للحصول على حل 1%. ختم مع الفيلم البارافين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
5. استخدام نفس الإجراء المذكورة أعلاه، تعد حلاً أسهم لاختبار مادة الكيمياء.
   ملاحظة: كثير من اختبار كيمياء مجا عاليا، والحلول ينبغي يفضل أن تكون جديدة في كل مرة يتم تنفيذ العينة.
6. إعداد تخفيف المسلسل لسيطرة إيجابية واختبار كيمياء من حلول الأسهم كما هو مبين في الشكل 5 استخدام قنينة زجاج 20 مل قبل شطفها بالأسيتون.
7. تطهير حقنه زجاجية 1 مل مع الأسيتون، وملء مع الأسيتون وآمنة في الدقيقة-قضيب المعدلة لتسليم كمية من 0.25 ميليلتر.
8. العمل في مجموعات من عشرة، 3-5-القديمة يوم البعوض الإناث الكبار من الأقفاص باستخدام الشافطة إزالة وتخدير لمدة تصل إلى خمس دقيقة في 4 درجات مئوية في ثلاجة أو على الجليد. وبعد ذلك، نقل البعوض إلى طبق بتري ومكان على الجليد لمدة تصل إلى 10 دقائق.
9. العمل بسرعة، إزالة أنثى واحدة مع غرامة ملاقط، وتطبيق ميليلتر 0.25 من اختبار حل للصدر الظهرية استخدام المحاقن الصغيرة-قضيب. تأكيد التسليم للكيمياء بالمراقبة باستخدام مجهر تشريح لضمان كل البعوض تتلقى وحدة التخزين المناسبة لاختبار الكيمياء.
10. تحويل البعوض إلى فنجان ورق مسمى يستريح على الجليد، وكرر تسع مرات للحصول على n = 10 البعوض المعالجة. ختم البعوض في الكأس مع شبكة مربعة المضمون مع الشريط المطاطي، ونقل إلى دائرة بلاستيكية الحوض أو النمو تحت ظروف ثابتة من 28 درجة مئوية و 75-85% رطوبة نسبية (على 12 ح ح ليلة اليوم/12 دورة الأفضل).
11. تكرار التجربة المذكورة أعلاه مرتين للحصول على n = 3 replicates التقنية (أي 30 البعوض المجموع) كل مجموعة العلاج أو التحكم.
12. كرر الخطوات من 3.7-3.10 أولاً باختبار مادة الكيمياء، ومن ثم مراقبة إيجابية.
    ملاحظة: هو عنصر تحكم آخر مفيدة لتشمل إذا البعوض كافية متوفرة "فارغة" من 30 تخديره من البعوض التي لا تتلقى اختبار كيمياء أو المذيبات.
13. سجل عدد البعوض "القتلى/غير المستجيبة" في 30 دقيقة، 60 دقيقة، 2 و 24 و 48 ساعة بعد التعرض (أو النقاط الزمنية البديلة) استخدام ورقة نقاط (الجدول 3). نقاط البعوض كما "القتلى/غير المستجيبة" إذا كانت تظهر عدم وجود الحركة، ويعرف بأنه زرع على جانب واحد أو على ظهره، ومع عدم القدرة على الطيران.
14. إذا رغبت في ذلك، تصحيح لوفيات مراقبة استخدام صيغة أبوت المعدلة كما يلي:
    معدل الوفيات (%) = (س ص) * 100/(100-Y)،
    حيث X = وفيات المئة في عينة المعالجة، و Y = نسبة وفيات في عنصر التحكم.
15. عرض النتائج كرسم بياني أو منحنى أسي. مقايسة استجابة جرعة، حساب قيمة₉₀ دينار لاختبار مادة الكيمياء بالنسبة لعنصر التحكم أو LD₇₅ أو LD₅₀.
16. تكرار الفحص مرتين على الأقل باستخدام مجموعات منفصلة من البعوض للحصول على n = 3 أو أكثر البيولوجية replicates.

4-الكبار بتغذية الدم الإنزيم (جرعة نقطة واحدة أو المقايسة استجابة الجرعة)

1. جمع حوالي 150 4-5 أيام القديمة أنثى البعوض البالغ ونقل إلى قفص منفصل. تكرار الحصول على 6 أقفاص إذا تقوم فحص استجابة جرعة. إزالة مصدر السكر ح 1-24 قبل الفحص التغذية.
2. إعداد حل أسهم الكيمياء كما هو موضح أعلاه، المحاسبة لنقاء الكيمياء (حل أسهم نموذجي 80 مم في الماء أو في المخزن المؤقت للملح)، وبعد ذلك إعداد تخفيف المسلسل في المياه/المخزن المؤقت كما هو مطلوب.
3. إضافة 40 ميليلتر من كل من تخفيف إلى 960 ميليلتر من الدم الأرنب ديفيبريناتيد للحصول على تركيز الاختبار المطلوب. تطبيق غشاء الفيلم إلى وحدة تغذية وختم بحلقة مطاطية. نقل 1 مل دم عن طريق ماصة وإرفاق وحدة تغذية لوحدة لتدفئة.
4. بلطف بمسحه الغشاء السطحي مع طازجة 10% حمض الالكتيك الحل ومكان وحدة التغذية في القفص البعوض البالغ. تغطية القفص بقطعة قماش داكن أو كيس القمامة الأسود والسماح للبعوض لتغذية لمدة ساعة واحدة.
5. كرر الخطوات 4.2 4.4 لما تبقى من حلول اختبار ومراقبة سلبية (الدم فقط).
6. وعند الانتهاء من تغذية، مكان الدلاء في 4 درجات مئوية في ثلاجة لمدة 5 دقائق تخدير البعوض. إزالة الذكور البعوض والبعوض الإناث غير المروية، والعد وتسجيل العدد الكلي لتغذية وتغذية البعوض جزئيا عن طريق فحص البطن.
7. الاحتفاظ بالبعوض الإناث تتغذى جزئيا وكاملا، تهدف إلى تحقيق حد أدنى من 50 البعوض تتغذى على الدم كل جرعة.
8. نقل دلاء لغرفة بلاستيك للحوض أو النمو تحت ظروف ثابتة من 28 درجة مئوية و 75-85% رطوبة نسبية (على 12 ح ح ليلة اليوم/12 دورة الأفضل).
9. سجل إجمالي عدد البعوض الميت غير المستجيبة في 0.5، 1، 1.5، 2، 24، 48 وح 72 (أو النقاط الزمنية البديلة حسب الرغبة) باستخدام النقاط ورقة (الجدول 4).
10. في ثالث يوم بعد الدم تغذية، الأخذ كأس بيض في القفص وجمع البيض على مدى فترة ح 72. حساب إجمالي عدد البيض المنتج الواحد العلاج تحت مجهر تشريح.
11. حساب نسبة الوفيات والخصوبة كدالة للعدد الإجمالي لتغذية البعوض لكل مجموعة العلاج والمراقبة. تصحيح لوفيات مراقبة استخدام صيغة أبوت معدلة إذا رغبت في ذلك.
12. عرض بيانات السمية وخصوبتها ارسم المدرج التكراري أو المنحنى الأسى (في حالة القيام فحص استجابة جرعة) باستخدام برمجيات اختيار. بحساب إذا تقوم فحص استجابة جرعة، LD₅₀, LD₇₅ أو قيمة₉₀ دينار لاختبار مادة الكيمياء بالنسبة لعنصر التحكم.
13. تكرار الفحص مرتين على الأقل باستخدام مجموعات منفصلة من البعوض للحصول على n = 3 أو أكثر البيولوجية replicates.

النتائج

ويبين الشكل 6 وفيات المئة L3 Ae. مصرية بعد التعرض لجرعات خمسة من خصم مستقبلات الدوبامين، اميتربتيلين مقارنة بالماء فقط (السلبية) التحكم في 24 و 48 و 72 ساعة. في هذا المثال، البيانات التي جمعت في كل من النقاط الزمنية عرض منحنى لوغاريتمي نموذجية وتكشف عن تأثير الجرعة من اميتربتيلين في وفيات اليرقات. القيمة₅₀ LC يقلل التجربة على مدى الزمن، ويمكن حسابها باستخدام بيانات ح 72 (أي، نقطة الوسط لمنحنى لوغاريتمي).

يبين الشكل 7 نسبة وفيات الإناث البالغات عمره 5 أيام 3- عبد اللطيف-مصرية عقب التعرض لجرعة 400 ميكرون (10 ميكروغرام/ميليلتر) بالمقارنة مع للبيرويثرويد الاصطناعية، وخصم مستقبلات الدوبامين، اميتربتيلين التحكم بيفينثرين-إيجابية (الدرجة التقنية؛ 500 بيكوغرام/ميليلتر) والاسيتون فقط المراقبة السلبية والبعوض غير المعالجة (فارغة). في هذا المثال، اميتربتيلين وبيفينثرين تسبب وفيات البالغين هامة بالنسبة إلى مراقبة سلبية. علما بأن معدل وفيات البالغين تتناقص بمرور الوقت، يفترض أنه بسبب إزالة السموم الأيضية لاختبار كيمياء.

يبين الشكل 8 نسبة وفيات (يسار المحور ص) أنثى راشدة يوم 3-5 القديمة الزاعجة المصرية عبد اللطيف- تغذية وجبة الدم تعامل مع واحدة من أربع جرعات من خصم مستقبلات الدوبامين، اميتربتيلين، والخصوبة (المحور الصادي الحق؛ وعدد البيض متوسط/ الإناث) لدورة جونوتروفيك الأولى بعد التعرض بالمقارنة مع مكافحة البعوض (تغذية الدم فقط؛ السلبية التحكم). وتكشف البيانات أن هناك أي تأثير كبير من اميتربتيلين على وفيات البالغين بالنسبة لعنصر التحكم ولكن إثبات أن اميتربتيلين يزيد بشكل ملحوظ الخصوبة في أعلى جرعة (400 ميكرون).

الشكل 1 . الإعداد للفحص استجابة الجرعة اليرقات. صورة تبين تركيب المقايسة استجابة الجرعة اليرقات إجراء باستخدام يرقات بعوض الزاعجة المصرية L3 في لوحة 24-جيدا.

الشكل 2 . تظهر الداخلي لمجموعة الجرعة نقطة (A) واحدة أو (ب) جرعة استجابة الإنزيم اليرقات في لوحة 24-حسنا التخطيطي. عقب نقل اليرقات L3 خمسة آبار، الماء الزائد بلطف إزالتها عن طريق ماصة واستبداله ب ddH طازجة ومعقمة₂o. بعد ذلك، تعد الأسهم وتخفيف المسلسل لاختبار مادة الكيمياء وإضافة إلى وحدة تخزين نهائي 1 مل/بئر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 . الثقافة البعوض الحامل للكبار- إظهار صورة ل 20 دلو البلاستيكية المستخدمة لثقافة البعوض البالغ واستخدام المضخة إزالة البعوض.

الشكل 4 . الكبار المقايسة الموضعية استخدام الإناث يوم 4-5 القديمة بعوض الزاعجة المصرية. العلاج التالية مع الكيمياء أو البعوض المذيبات، والكبار توضع في أكواب الورق ونقل إلى غرفة اختبار لمدة المقايسة.

الشكل 5 . الأوراق المالية وتخفيف المسلسل. رسم تخطيطي يبين الإجراء المتعلق بإعداد المخزون (A) و (ب) اختبار المسلسل حلول للمقايسة الموضعية الكبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 6 . بيانات تمثيلية من مقايسة استجابة جرعة اتصال يرقات. الحصول على بيانات تمثيلية من مقايسة استجابة جرعة اتصال يرقات عرض نسبة وفيات يرقات بعوض الزاعجة المصرية L3 عقب التعرض لخصم مستقبلات الدوبامين، اميتربتيلين في 24 و 48 و 72 ساعة. تمثل كل نقطة بيانات يعني في ميكرومتر ± sem. البيانات تمثل n = 3 replicates البيولوجية.

الشكل 7 . بيانات تمثيلية من مقايسة استجابة جرعة الموضعية الكبار- بيانات تمثيلية من مقايسة استجابة الكبار جرعة الموضعية عرض سمية خصم مستقبلات الدوبامين، اميتربتيلين (10 ميكروغرام/ميليلتر) إلى يوم 3-5 القديمة أنثى بعوض الزاعجة المصرية بالنسبة للبيرويثرويد الاصطناعية، بيفينثرين (500 بيكوغرام/ميليلتر) إيجابية التحكم) وسلبية التحكم (مركبة الأسيتون فقط) في 2 و 24 و 48 ح. وتمثل البيانات n = 3 replicates البيولوجية. أشرطة الخطأ تشير إلى sem.

الشكل 8 . بيانات تمثيلية من فحص ابتلاع الكبار- بيانات تمثيلية من مقايسة ابتلاع الكبار عرض سمية لخصم مستقبلات الدوبامين، اميتربتيلين في 100 ميكرومتر، 200 ميكرومتر و 400 ميكرون جرعة ليوم 3-5 القديمة الإناث البالغات بعوض الزاعجة المصرية وأثرها على الخصوبة (معبراً عنها كالبيضة مجموع متوسط عد كل أنثى على مدى دورة جونوتروفيك الأولى). وتمثل البيانات n = 3 replicates البيولوجي ± sem.

ألف نقطة واحدة من جرعة فحوصات مع كيمياء ثلاثة
كيمياء	تركيز (400 أم)
اميتربتيلين	80 مم الأسهم: 2 ملغ اميتربتيلين X 98% (نقاء مسحوق) × 0.001 غ/1 ملغ X 1 مول 313.86 ز × 1 لتر/0.08 مول X 106 ميليلتر/L = 78.06 ميليلتر من الماء.
	تخفيف المسلسل: تمييع الأسهم 1:2 مع ddH2س ثم 1:4 لتحقيق 10 ملم. إضافة 40 ميليلتر للأوراق المالية 10 ملم جيدا تحتوي على 960 ميليلتر ddH20 لتحقيق تركيز نهائي من 400 ميكرون/جيدا.  إعداد تخفيف المسلسل 10 ملم المخزون 1:2 لتحقيق 5 مم، 2.5 ملم، 1.25 مم والأرصدة 0.625 مم.
-رابطة الدول المستقلة (ض)--فلوبينثيكسول	80 مم الأسهم: 2 مغ من رابطة الدول المستقلة (z) فلوبينثيكسول X 98 ٪ (نقاء مسحوق) × 0.001 غ/1 ملغ × 1 mol/507.44 ز رابطة الدول المستقلة (z) فلوبينثيكسول L/0.08 X 1 X 106 مول ميليلتر/لتر = 48.28 ميليلتر من الماء.
	تخفيف المسلسل: كما ذكر أعلاه.
Amitraz	80 مم الأسهم: 2 مغ من س أميتراز ز 0.001/مجم 1 X 1 mol/293.4 ز من أميتراز L/0.08 X 1 مول X 106 ميليلتر/1 لتر = ميليلتر 85.21 من [دمس] (ملاحظة: أميتراز قابل للذوبان في [دمس] فقط).
	تخفيف المسلسل: كما ذكر أعلاه.
فحص استجابة الجرعة باء
كيمياء	الجرعة 1	الجرعة 2	الجرعة 3	الجرعة 4	الجرعة 5
	400 ميكرون	200 ميكرومتر	100 ميكرومتر	50 ميكرومتر	25 ميكرومتر
مثل اميتربتيلين، رابطة الدول المستقلة-(ض)--فلوبينثيكسول أو أميتراز	40 ميكروليتر	40 ميكروليتر	40 ميكروليتر	40 ميكروليتر	40 ميكروليتر
	الأسهم 10 ملم	الأسهم 5 مم	الأسهم 2.5 ملم	الأسهم 1.25 مم	مم 0.625 الأسهم

الجدول 1. مثال على العمليات الحسابية ل بعوض الزاعجة المصرية أشر L3 اليرقات (A) واحد جرعة المقايسة والمقايسة وردا (ب) جرعة.

الجدول 2. مثال ورقة نقاط المستخدمة لتسجيل البيانات من مقايسة استجابة الجرعة يرقات البعوض. التحكم، الماء فقط أو ماء مع [دمس] 1% أو المذيبات الأخرى فقط. هي جرعات نموذجية تستخدم لاختبار كيمياء خصم جزيء صغير مثل اميتربتيلين 25 ميكرومتر، 50 ميكرومتر، 100 ميكرومتر، 200 ميكرومتر و 400 ميكرون.

فحص موضعي الكبار البعوض (3-5 أيام القديمة)
تاريخ البدء:
المحقق:
الأنواع/سلالة:
نوع الاعتداء: نقطة وحيدة الجرعة الجرعة/الاستجابة
أ وفيات (رقم البعوض الميت)
الوقت (ساعات)	الجرعة 1	الجرعة 2	الجرعة 3	الجرعة 4	الجرعة 5	عنصر التحكم
0.5
1
1.5
2
2.5
الوفيات ب المئة
الوقت (ساعات)	الجرعة 1	الجرعة 2	الجرعة 3	الجرعة 4	الجرعة 5	عنصر التحكم
0.5
1
1.5
2
2.5

الجدول 3- مثال ورقة نقاط المستخدمة لتسجيل البيانات من تحليل استجابة الكبار الجرعة الموضعية.

الفحص ابتلاع الكبار البعوض (3-5 أيام القديمة)
تاريخ البدء:
المحقق:
الأنواع/سلالة:
نوع الاعتداء: نقطة وحيدة الجرعة الجرعة/الاستجابة
ألف-عدد تغذية البعوض
	الجرعة 1	الجرعة 2	الجرعة 3	الجرعة 4	الجرعة 5	عنصر التحكم
بنك الاحتياطي الفيدرالي
لا بنك الاحتياطي الفيدرالي
المجموع
% بنك الاحتياطي الفيدرالي
% لا بنك الاحتياطي الفيدرالي
باء-معدلات الوفيات (رقم البعوض الميت)
الوقت (ساعات)	الجرعة 1	الجرعة 2	الجرعة 3	الجرعة 4	الجرعة 5	عنصر التحكم
2
24
48
72
وفيات المئة جيم
الوقت (ساعات)	الجرعة 1	الجرعة 2	الجرعة 3	الجرعة 4	الجرعة 5	عنصر التحكم
2
24
48
72

الجدول 4. مثال ورقة نقاط المستخدمة لتسجيل البيانات من تحليل الدم-تغذية الكبار- هي جرعات نموذجية تستخدم لاختبار كيمياء خصم جزيء صغير مثل اميتربتيلين 50 ميكرومتر، 100 ميكرومتر، 200 ميكرومتر و 400 ميكرون.

Discussion

المبيدات الحشرية أدوات قوية لمكافحة الأمراض المنقولة بالبعوض مثل²⁵من الملاريا وحمى الضنك و Zika²⁶. استخدام المبيدات الحشرية واسعة النطاق قد أنتجت البعوض السكان هي مقاومة لمراقبة المواد الكيميائية، مما يؤدي إلى تطوير مقاومة المبيدات الحشرية، الذي يعتبر أكبر تهديد منفرد لاستمرار السيطرة على الأمراض. شهد العقد الماضي زيادة هائلة في السكان من Anopheles spp. مقاومة لمركبات البيرويثرويد الاصطناعية (SPs) المستخدمة في الناموسيات في أفريقيا⁷. أبلغ السكان Aedes albopictus، ناقل حمى الضنك وزكى، في ولاية فلوريدا ونيوجيرسي التي تقاوم الفوسفاتية⁶. وبالمثل، تم توثيق المقاومة لمادة الدي دي تي ومركبات البيرويثرويد في السكان، و بعوض Anopheles spp. في كولومبيا^27،28. هناك حاجة ملحة لتطوير مبيدات اليرقات الجديدة واليافعة التي تربط أورثوستيريك المتنوعة أو مواقع اللوستيريك على أهداف جزيئية المعروفة أو التي تعطل^29،الأهداف (أي رواية كيمياء MoA) الجديد³⁰ و يكون الحد الأدنى من الأثر البيئي. ويتزايد أيضا الاعتراف بالإمكانات حول انديكتوسيديس للبعوض التحكم^31،،من³²³³.

لتسهيل التطور السريع لهذه المنتجات، ونحن تصف سلسلة من البروتوكولات التي تهدف إلى تقييم سمية كيمياء الجزيئات الصغيرة ليرقات البعوض والكبار عبر طريقين التسليم-الاتصال والابتلاع. بروتوكولات مثل اختبار قابلية منظمة الصحة العالمية والمقايسة زجاجة منها تستخدم مشتركة لتقييم السمية وطرد من تركيبات مبيدات الحشرات الموجودة^1،2. بيد أن هذه الاختبارات قيود لإجراء تحليلات للكيانات الكيميائية رواية أونفورمولاتيد (الامتحانات) وغير قابلة للاختبار أعدادا كبيرة من كيمياء في الإنتاجية متوسطة أو عالية.

هنا يصف لنا مقايسة يرقات قياسية لسرعة تقييم الامتحانات في نقطة واحدة بالجرعات التي يمكن قياس لتحليل الإنتاجية العالية. كما يصف لنا تكييف مقايسة وضعتها لايت²¹ تقييم سمية الاتصال كيمياء الجزيئات الصغيرة للبعوض البالغ. وأخيراً، وصف مقايسة ابتلاع لتقييم السمية لتسليمها عن طريق تناول وجبة الدم للبعوض الإناث البالغات من الامتحانات التنافسية الوطنية واستكشاف انديكتوسيدي المحتملة. يمكن إجراء هذه الاختبارات اليرقات والكبار في طائفة من جرعات بغية تحديد القيم LC ودينار، على التوالي، ويمكن إجراء فحوصات الاتصال اليرقات والكبار على حد سواء بالمقارنة مع واحد أو أكثر من التركيبات الكيميائية الموجودة. الفحص الموضعي الكبار يمكن أيضا حساب قيم LD كل البعوض الفردية. البروتوكولات يمكن أن يؤديها باستخدام أنواع بعوض Anopheles و Culex^16،29 ويمكن تعديله لمراعاة الخصائص البيولوجية للأنواع، إذا رغبت في ذلك. في تجربتنا، كيمياء موسكويتوسيدال يحمل عادة نشاط واسع النطاق عبر هذه الثلاثة أجناس^16،29، ولكن هناك قيمة لتقييم الأنواع الانتقائية.

فحوصات نقطة انطلاق سرعة الشاشة كيمياء متعددة لنشاط إبادة الحشرات. ويمكن اختيار تلك كيمياء أن المعرض سمية في واحد أو أكثر من الاختبارات لمزيد من التحليلات عن طريق فحوصات التعليم الثانوي والعالي. وتشمل الأمثلة الإنزيم الرصغي لايت والسكر في تغذية فحوصات^34،35. التحديد لفحوصات إضافية تحددها عادة الاعتبارات حول السوق المتوقعة والتطبيق، مع نتائج تقديم رؤى لأوضاع تسليم المنتج ممكن. وفي النتائج الممثل هو موضح هنا، نستكشف سمية اميتربتيلين، خصم مستقبلات الدوبامين الثدييات واللافقاريات التي تم تقييم لإمكانيات كرواية وزارة الزراعة المبيدات الحشرية^{10،12، 13 , 16}-اميتربتيلين أظهرت سمية اليرقات والكبار من عبد اللطيف. أيجيتبي في اقتراح مجموعة ميكروغرام مبيد والنشاط أدولتيسيدال، وتوفير الأساس المنطقي لاستكشاف مجموعة المواد الكيميائية المستندة إلى اميتربتيلين لتحديد نظائر بفاعلية عالية. أي تأثير كبير على معدل الوفيات أو خصوبتها لوحظ في Ae. مصرية تتعرض اميتربتيلين في وجبة الدم. في حين لا يعرف استقرار الكيمياء في ديفيبريناتيد الدم والجرعة الفعالة المتلقاة في البعوض، والقيود الملحوظة للمقايسة، توحي البيانات قد يكون اميتربتيلين وغيرها من المركبات النشطة GPCR احتمال ضئيل انديكتوسيديس، في الدولة أونفورمولاتيد في الأقل.

إجراءات وقائية للحد من الاختلاف البيولوجي بين فحوصات ضرورية. ينبغي إجراء فحوصات جميع الظروف القياسية لدرجة الحرارة والرطوبة ويفضل أن يكون ذلك في دائرة لنمو حشرة، بغية ضمان إمكانية تكرار نتائج. لا بد من توحيد الإجراءات للتهديف اندبوينتس المظهرية كهذه يمكن أن تكون موضوعي إلى حد كبير، مما يؤدي إلى تباين كبير في البيانات المسجلة بالعاملين في المختبرات المختلفة. والرزن اليرقات الأنسب للتقييم لكيمياء قابلة للذوبان في الماء، على الرغم من أن يمكن إجراء الفحص استخدام المذيبات العضوية مثل [دمس] شريطة أن يكون التركيز النهائي أقل من 1 في المائة أيضا. نسلم بالعديد من القيود على الفحص الموضعي الكبار. أولاً، من الضروري العمل بسرعة عند إعداد تخفيف المسلسل وتقديم جرعات الناقل (الأسيتون) درجة عالية من التقلب والتبخر قد ينتج الاختلاف مبلغ الكيمياء تسليمها. ثانيا، ينبغي الحرص على تحديد الفترة التخدير كهذا يمكن أن يسهم في معدل الوفيات. كما تجدر الإشارة إلى أن المذيبات مثل الأسيتون يمكن أن تنتج أثرا "تدق لأسفل" سريع في أول عدة ساعات للمقايسة الموضعية، التي ينبغي عدم الخلط مع الآثار الناجمة عن اختبار مادة الكيمياء. ونلاحظ أن حجم وجبة دم البعوض يختلف بين الأفراد، وتعقيد تقييما للجرعة التي تلقي كل شخص بالغ في الفحص ابتلاع الكبار. وأخيراً، لا ينبغي تحليل البيانات في الحالات التي يتجاوز فيها معدل الوفيات في مراقبة سلبية 10%.

هي المنتجات التي تتصرف تآزر على نحو متزايد لإمكاناتها توسيع الأداة المساعدة للمنتجات القائمة وتوفير المراقبة لمقاومة مبيدات الآفات السكان^15،،من¹⁶³⁶. وقد استخدمت فحوصات اليرقات لدراسة التآزر بين مبيدات الآفات فورماميديني، أميتراز ومجموعة متنوعة من كيمياء التي تعطل octopamine اللافقارية مستقبلات^14،15. والرزن اليرقات والمقايسة الموضعية الكبار ووصف مناسبة لتقييم الآثار التآزرية أو المضافة بين مجموعات من اختبار كيمياء. ونلاحظ أن سينيرجيستس مثل طريقة ببيرونيل (PBO) يمكن إدراجها في كل من الاختبارات الثلاثة الموضحة هنا.

تقديم فحوصات الموصوفة أعلاه سلسلة تجريبية موحدة لتقييم العقاقير جزيء الصغيرة، أونفورمولاتيد ضد البعوض المائية والأرضية مراحل الحياة. هذه الاختبارات صممت خصيصا لتقييم السمية وعرض العديد من المزايا القائمة فحوصات المشتركة الاستخدام. الأهم من ذلك، فحوصات قابلة للتشغيل الآلي للمكاتب، ويمكن أن يؤديها على نطاق صناعي التمكين من تقييم لآلاف مركبات الاختبار. أخيرا، كما تعتبر المجال تطوير المنتجات التي تعمل عن طريق مواس جديدة، بما في ذلك عن طريق تعطيل أهداف جزيئية الرواية والمسارات البيوكيميائية، سيكون من الضروري لنقاط النهاية المظهرية متعددة بالإضافة إلى تلك مثل معدل الوفيات و الشلل. فحوصات أعلاه تسمح بمثل هذه التحقيقات، وبالتالي توفير خطوة نحو تكنولوجيات إبادة الحشرات مبتكرة للغاية في الغد.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insecticide susceptible mosquito strains	Malaria Research and Reagent Reference Repository	https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain
Acetone	Mallinckrodt Chemical	CAS 67-64-1	Use for dilutions and control
Amitraz	Sigma-Aldrich	CAS 33089-61-1	Requires dilution in DMSO
Amitriptyline	Sigma-Aldrich	CAS: 549-18-8	Can be diluted in acetone
Bifenthrin	Sigma-Aldrich	CAS: 51529-01-2	Synthetic pyrethorid used as positive control
Cis-(Z)-flupenthixol	Sigma-Aldrich	CAS: 51529-01-2	Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors
Defibrinated rabbit blood	Hemostat	DRB0100	Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding
Dimethylsulphoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	MKBF2985	Organic solvent used to disolve amitraz
Hemotek membrane feeding system	Hemotek Ltd	Serial no. 1303	Used for feeding mosquitoes
Micro-applicator	Burkard Manufacturing Co.	-	Tool needed for topical application experiments
24-well cell culture plate with lid	Corning Incorporated	3526	-
Advantage rubber bands	Alliance Rubber Co.	-	Used to seal the paper cups
Glass syringe (1 ml)	Becton Dickinson and Co.	512004	Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic
Disposable scintillation vials (20 ml)	Fisher Scientific	74505-20	Glass vials prevent evaporation
Tulle fabric, white	Walmart	-	-
Paper cups	Dixie Consumer Products LLC.	PF15675/13D	Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays
Petri dishes (150 mm)	Corning Life Sciences	-	Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M	Used to sort larvae
Stereo microscope	Olympus	SZ6045	Used to score larval assays and perform micro-applications
Tweezers (fine)	Fontax	-	Used to handle adult mosquitoes