كوانتيتيشن خلية واحدة مرناً و "سطح التعبير البروتين" في خلايا CD4 المصابين "فيروس نقص المناعة القردي"+ "تي الخلايا المعزولة" من macaques ريسوس

Andrey Tokarev; Matthew Creegan; Michael A. Eller; Mario Roederer; Diane L. Bolton

doi:10.3791/57776

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Method Article

كوانتيتيشن خلية واحدة مرناً و "سطح التعبير البروتين" في خلايا CD4 المصابين "فيروس نقص المناعة القردي"⁺ "تي الخلايا المعزولة" من macaques ريسوس

DOI:

10.3791/57776

⸱

September 25th, 2018

Andrey Tokarev¹, Matthew Creegan¹, Michael A. Eller¹, Mario Roederer², Diane L. Bolton¹

¹US Military HIV Research Program, Henry M. Jackson Foundation, Walter Reed Army Institute of Research, ²Vaccine Research Center, NIAID, NIH

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Summary

وصف منهجية كوانتيتاتي الجينات 96 وأعرب 18 البروتينات السطحية من خلايا مفردة فيفو السابقين، مما يسمح للتعرف على خلطات الجينات والبروتينات في الخلايا المصابة بالفيروس بالنسبة للخلايا مصابة. نقوم بتطبيق نهج لدراسة CD4 المصابة بسيف⁺ تي الخلايا المعزولة من macaques الريسوسي.

Abstract

تحليل خلية واحدة أداة هامة لتشريح السكان غير متجانسة من الخلايا. تحديد وعزل خلايا نادرة يمكن أن يكون صعباً. للتغلب على هذا التحدي، الجمع بين منهجية فهرسة التدفق الخلوي والفائق متعدد الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (قبكر). يهدف إلى تحديد وتوصيف فيروس نقص المناعة القردي (سيف)-إصابة خلايا موجودة داخل macaques الريسوسي. الخلايا المصابة بالفيروس من خلال كوانتيتيشن من البروتين السطحي بالأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) ومرناً ب qPCR، يتم تحديدها بواسطة التعبير الجيني الفيروسي، الذي هو جنبا إلى جنب مع قياسات مضيف الجينات والبروتين لإنشاء ملف تعريف متعدد الأبعاد . نحن مصطلح نهج، وتقييم خلية واحدة بروتو النسخي المستهدفة، أو تسسيبتري. لتنفيذ هذه الطريقة، ملطخة خلايا قابلة للحياة مع الأجسام المضادة الفلورسنت محددة للعلامات السطحية المستخدمة لعزل نظام مراقبة الأصول الميدانية خلية فرعية و/أو تحليل المظهرية المتلقين للمعلومات. يتم فرز الخلايا المفردة تليها متعدد النسخ العكسي (RT) وبكر قبل التضخيم، تحلل فورا و qPCR إنتاجية عالية تصل إلى 96 من النصوص. سجلت في وقت الفرز قياسات نظام مراقبة الأصول الميدانية وبعد ذلك ترتبط بالبيانات التعبير الجيني بالموقف جيدا لخلق البروتين مجتمعة والنسخي الشخصية. دراسة المصابين بسيف الخلايا مباشرة فيفو السابقين، وحدد الخلايا الكشف qPCR متعددة الأنواع الرنا الفيروسي. الجمع بين النصوص الفيروسية وكمية كل منها توفير إطار لتصنيف الخلايا في مراحل متميزة من دورة الحياة الفيروسية (مثلالإنتاجية مقابل غير منتجة). وعلاوة على ذلك، كانت تسسيبتري سيف⁺ الخلايا مصابة بالمقارنة خلايا معزولة من العينة نفسها لتقييم المضيف الأثران عن الجينات والبروتينات. وكشف التحليل مقدر سابقا الجيش الملكي النيبالي الفيروسية التعبير عدم التجانس بين الخلايا المصابة، وكذلك في فيفو تنظيم الجينات بوستترانسكريبشونال سيف بوساطة مع القرار خلية واحدة. طريقة تسسيبتري ذات الصلة لتحليل أي السكان خلية قابلة لتحديد الهوية بواسطة التعبير marker(s) البروتين السطحية، gene(s) المضيف أو الممرض، أو مزيج منها.

Introduction

العديد من مسببات الأمراض داخل الخلايا تعتمد على إليه الخلية المضيفة للنسخ المتماثل، غالباً ما تغيير بيولوجيا الخلية المضيف أو استهداف الفئات السكانية الفرعية محددة جداً للخلايا المضيفة تحقيق أقصى قدر من الفرص لنشر. نتيجة لذلك خلية العمليات البيولوجية تعطلت عادة، مع عواقب ضارة على الصحة العامة للبلد المضيف. فهم التفاعلات بين الفيروسات والخلايا المضيفة التي النسخ المتماثل سيتم توضيح آليات المرض يمكن أن يساعد في تطوير علاجات محسنة واستراتيجيات للوقاية من العدوى. الأدوات التحليلية المباشرة التي تمكن من دراسة التفاعلات بين المضيف الممرض ضرورية نحو تحقيق هذه الغاية. تحليل خلية واحدة يوفر الوسيلة الوحيدة للسمة لا لبس فيه النمط الظاهري خلوية الوراثي خاصة، أو الإصابة بالحالة¹. على سبيل المثال، الإصابات المسببة للأمراض كثيرا ما حمل التغييرات المباشرة وغير المباشرة على حد سواء في الخلايا المضيفة. ولذلك، التمييز بين الخلايا المصابة من نظرائهم غير مصاب ضروري لسمة التغييرات الخلية المضيفة للإصابة المباشرة أو الآثار الثانوية، مثل المعمم التهاب. وعلاوة على ذلك، للعديد من مسببات الأمراض، مثل سيف وفيروسات نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز)، العدوى الخلية المضيفة العائدات من خلال مراحل متعددة، مثل مبكرة أو متأخرة، أو الكامنة، كل منها قد تتسم بالجينات متميزة والبروتين التعبير التشكيلات الجانبية² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵-سوف تفشل معظم التحليلات المخاليط خلية لالتقاط هذا التغاير⁶. على النقيض من ذلك، الغاية متعدد تحليلات خلية واحدة قادرة على التحديد الكمي للتعبير على حد سواء الفيروسية والجينات المضيفة توفر وسيلة لحل الاضطرابات الخلوية الخاصة بالعدوى، بما في ذلك الاختلافات عبر مراحل الإصابة. علاوة على ذلك، تحليل التفاعلات المضيف الممرض في الناحية الفسيولوجية الإعدادات ذات الصلة أمر بالغ الأهمية للتعرف على الأحداث التي تحدث في الكائنات الحية المصابة. وهكذا، الأساليب التي يمكن تطبيقها مباشرة السابقين فيفو يتم القبض على الأرجح أفضل في فيفو العمليات.

سيف، وفيروس نقص المناعة البشرية المستهدفة CD4⁺ تي الخلايا، التي هي التصدي للعوامل المضادة للفيروسات "تقييد" المضيف ومستضد downregulate تقديم جزيئات إثبات الإصابة بالإنتاجية وتجنب مراقبة محصنة ضد⁷^،⁸^، ⁹^،^،من¹⁰¹¹. بدون علاج، نتائج العدوى في خسائر فادحة في خلايا CD4 الخلايا⁺ تي، وفي نهاية المطاف توجت حصل نقص المناعة المكتسب (الإيدز)¹². في الإعداد للعلاج المضاد للفيروسات الرجعية، تستمر الخلايا المصابة خفية الخزانات لعدة عقود، مما يشكل حاجزاً هائلا للاستراتيجيات العلاجية. فهم الخصائص في فيفو خلايا المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية/سيف لديه القدرة على الكشف عن ميزات الخلية المضيفة دوراً هاما في نشوء المرض واستمرار. ومع ذلك، هذا قد تم شديدة التحدي، أساسا بسبب low frequency للخلايا المصابة وعدم توفر والكواشف قادراً على سهولة التعرف عليها. الخلايا التي نسخ الرنا الفيروسي، يقدر أن يكون حاضرا عند 0.01 – 1% من خلايا CD4 خلايا⁺ تي في الدم والأنسجة اللمفاوية¹³^،^،من¹⁴¹⁵. تحت العلاج القمعية، الخلايا المصابة خفية حتى أقل تواترا في 10^-3–10^-7 ¹⁶^،^،من¹⁷¹⁸. تلوين البروتينات الفيروسية فحوصات أن عمل جيدا لدراسة التهابات في المختبر ، مثل هفوة داخل الخلايا، دون المستوى الأمثل بسبب تلوين الخلفية من 0.01-0.1%، مماثلة أو أكبر من تواتر الخلايا المصابة¹³^، ¹⁴. تلطيخ السطحية للبروتين الحياة الفطرية تتسم جيدا [مونوكلونل] الخاصة بالحياة الفطرية سيف، فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام أيضا ثبت أن تكون صعبة، المحتمل لأسباب مماثلة. في الآونة الأخيرة، أدوات مبتكرة تهدف إلى تحسين الكشف عن خلايا معربا عن هفوة أما عن طريق إدراج فحوصات محددة لهفوة الجيش الملكي النيبالي أو باستخدام بديل التصوير التكنولوجيات¹⁴^،^،من¹⁵¹⁹. بيد أن مثل هذا النهج لا تزال محدودة في عدد القياسات الكمية التي يؤديها في كل خلية.

هنا، يمكننا وصف المنهجية (1) يعرف واحدة من الخلايا المصابة بالفيروس مباشرة السابقين فيفو بالمورثات الفيروسية حساسة ومحددة الكمية قبكر و (2) يوضحها تعبير البروتينات السطحية تصل إلى 18 والجينات 96 لكل المصابين (و خلية غير مصاب). يجمع هذا المنهجية قياس البروتين وحيد الخلية السطحية بنظام مراقبة الأصول الميدانية متبوعاً بتحلل الخلية فورا واستخدام تحليل التعبير الجيني متعدد qPCR المستهدفة في النظام بيومارك. تكنولوجيا الدوائر المتكاملة فلويديك (IFC) يسمح كوانتيتيشن متعدد الجينات 96 من 96 عينة في وقت واحد، أنجزه مصفوفة دوائر 9,216 التي تتم ردود فعل qPCR الفردية. فرز الخلايا الحية نظام مراقبة الأصول الميدانية سجلات قياسات وفرة المحتوى عالي البروتين في حين الحفاظ على الترنسكربيتوم كامل لتحليل أداء فورا المصب. لتحديد الخلايا المصابة بالفيروسات، يتم تضمين فحوصات محددة للكشف الفيروسية المقسمة، وبدلاً من ذلك وأونسبليسيد (فرنا) في التحليل قبكر، جنبا إلى جنب مع فريق فحوصات المعرفة من قبل المستخدم التي بلغ مجموعها يصل إلى 96 الجينات، الحد الأقصى لعدد فحوصات يقيمون حاليا في المؤسسة المالية الدولية. تعبير الجينات والبروتين من المعلومات التي تم جمعها لكل خلية مرتبطة بالموقف جيدا. ونحن سابقا أفادت النتائج من هذا التحليل في مكان آخر²⁰. هنا، نحن نقدم أكثر تفصيلاً المبادئ التوجيهية المنهجية، فضلا عن المزيد phenotyping وصفية لخلايا CD4 المصابة بسيف⁺ تي الخلايا.

يمكن تطبيق هذا النهج، الذي نحن على المدى تسسيبتري، لأن الإيقاف أي سكان خلية قابلة للتطبيق التفاعلي للأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي والتعبير عن الترنسكربيتوم متوافقة مع فحوصات qPCR المتاحة. على سبيل المثال، يمكن استخدامه لوصف الجينات التفاضلية والتعبير البروتين في خلايا نادرة أو خلايا لا يسهل تمييزها بعلامات البروتين السطحي. إعداد نموذج يعتمد على معيار تلطيخ بروتوكول استخدام الأجسام المضادة المتاحة تجارياً. سيتوميتيرس مع إمكانية فرز الخلايا المفردة أيضا متوفرة تجارياً، ولكن احتياطات السلامة الأحيائية إضافية مطلوبة من أجل معالجة الخلايا الحية المعدية. تسجيل ملف التعريف التعبير البروتين وحيد الخلية لكل خلية بالموقف جيدا، المشار إليها هنا كما فهرسة الفرز، سمة مشتركة لنظام مراقبة الأصول الميدانية المتاحة تجارياً فرز البرامج. التحليل الحسابي الجينات المضيف الأثران أعرب السكان خلية للفائدة ولا يرد هنا، ولكن ترد إحالات إلى أساليب نشرها مسبقاً.

Protocol

ملاحظة: تخطيطي لسير العمل البروتوكول ويرد في الشكل 1. وهو يتألف من ثلاث خطوات رئيسية: نظام مراقبة الأصول الميدانية، الرايت وكدنا قبل التضخيم، و qPCR ليصل إلى 96 من الجينات في وقت واحد. يتم وصف إصدارين من البروتوكول، وفرز الخلايا في الحد من تخفيف وفرز الخلايا المفردة، بمزيد من التفصيل في الخطوة 5 والخطوه 6، على التوالي. هذه الاستراتيجيات ومعالجة مسائل بحثية مختلفة لكن اتباع إجراءات مماثلة.

1-المتطلبات المسبقة أو قبل تحليلات

التحقق من صحة جميع فحوصات التعبير الجيني لاستخدامها كما هو موضح سابقا⁶.
ملاحظة: تتم هذه الخطوة قبل موعد التجربة. التحقق من صحة جميع فحوصات، التجارية والعرف، مطلوب لضمان كفاءة وخطي التضخيم من الحمض النووي الريبي ذات الصلة وصولاً إلى مستوى خلية واحدة. فشل العديد من الاختبارات المتاحة تجارياً ومخصصة للوفاء بهذه المواصفات. ترد في ملفات الترميز الإضافي 1-5تجهيز وتركيب منحنى الآلي للتأهيل المتزامن لفحوصات تعبير الجينات تصل إلى 96، ولكن يمكن أن يكون مؤهلاً الاختبارات الفردية استخدام R² ومنحدر يصلح الخطي ل. والرزن الناجحة والفاشلة الممثل المؤهل المؤامرات مبينة في الشكل 2.
وضع لوحة سيتوميتريك تدفق من الأجسام المضادة لوصمة عار علامات خلية السطحية للفائدة.
1. تيتراتي الأجسام المضادة تلطيخ عينة ذات صلة، على سبيل المثال، الريسوسي المحيطية وحيدات النوى خلايا الدم (ببمكس)، مع كل جسم. بدء تشغيل مع 20 ميليلتر من جسم كل اختبار في 100 ميليلتر تلطيخ رد فعل وإنشاء ثمانية تخفيف المسلسل شقين. تحديد تركيز الأمثل الذي يسلك الحد الأقصى لتلطيخ كثافة مع الحفاظ على فصل واضح بين السكان السلبية والإيجابية.
2. تقييم تلطيخ مجتمعة في sample(s) خلية إضافية باستخدام الخليط من جميع الأجسام المضادة في تركيز الأمثل تحديد في الخطوة 1.2.1. تأكد من أن تلطيخ مماثلة لتلك التي لوحظت بالنسبة للبقع جسم الفرد. إذا تلطيخ أقل من ما لوحظ عند استخدام أي جسم بمعزل عن غيرها، النظر يرتبط fluorochrome بديلة لتحل محل تلك الأجسام المضادة.

2. إعداد المقايسة تعبير الجين

التعبير الجيني 96 الجمع بين فحوصات في رناسي الدناز خالية/أنبوب 1 – 15 مل (حجم قد تختلف مع عدد لوحات الفرز). لوحة الاختبارات المستخدمة في هذه الدراسة هو المحدد في الجدول 1 و الجدول 2. المواد الناتجة عن ذلك يشار إلى "مزيج المقايسة". إضافة كل مقايسة لتركيز نهائي من 180 نانومتر إلى الأمام وعكس كبسولة تفجير. إضافة "المخزن المؤقت لتعليق الحمض النووي" لتحقيق التخفيف المناسبة من "مزيج المقايسة".
ملاحظة: لأغراض عملية، مخزونات مخصصة المقايسة (المستخدم لتوليد) قد تكون مستعدة في 18 ميكرون لتكون متسقة مع تركيز المتاحة تجارياً "x 20" الجينات التعبير qPCR فحوصات (جدول المواد). 18 ميكرومتر يمزج من التمهيدي إلى الأمام وعكس مخصصة لكل الجينات مصنوعة من حلول الأسهم في "المخزن المؤقت لتعليق الحمض النووي". فحوصات متوفرة تجارياً (جدول المواد) تشمل أيضا تحقيقات، ولكن المسابير ليست مطلوبة من أجل RT أو كدنا قبل التضخيم ويمكن إهماله وبالتالي لفحوصات مخصصة. من المستحسن تضمين واحد أو أكثر من الجينات التدبير المنزلي لاستخدامها في مراقبة الجودة لتقييم كفاءة الفرز واسترداد الخلية، وتوليف كدنا. استخدام كبسولة تفجير عشوائي لتوليد كدنا لم تحدد، ولكن من المتوقع أن تكون أقل كفاءة من الإشعال الخاصة بالجينات.
إعداد 2 × لوحة المقايسة للاستخدام في الخطوة 7، 1 (متعدد qPCR). لكل مجموعة شرائح 96 × 96 المتوقعة، "الماصة؛" 6 ميليلتر لكل فحص في كل عين جيدا من صفيحة بكر 96-جيدا. على سبيل المثال، للرقائق 5، سوف تشغل 30 ميليلتر لفحص كل بئر واحدة في لوحة 96-جيدا. إذا كان استخدام فحوصات 96، سيحتوي كل بئر من لوحة 96-جيدا مقايسة. ختم اللوحة بختم لاصقة.
ملاحظة: من الناحية المثالية، 2.1 و 2.2 يتم تنفيذ الخطوات في نفس الوقت، لتجنب دورات تجميد أذاب متعددة لفحوصات التعبير الجيني. يجب أن كانت جميع الجينات داخل لوحة الفحص أيضا موجودة في "مزيج المقايسة" (الخطوة 2، 1). مزيج المقايسة ولوحة الفحص يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية للاستخدام في الأجل الطويل أو القصير، على التوالي.

3-سطح وصمة عار خلايا قابلة للحياة

ملاحظة: تلطيخ داخل الخلايا، وبيرميبيليزيشن، والتثبيت غير متوافقة مع هذا الأسلوب كما أنها تهدد الجيش الملكي النيبالي.

إعداد العينات التعويض بإضافة كل جسم المدرجة في الجدول للمواد 40 ميليلتر من حبات التعويض في 2.5-fold تركيز أعلى من تلك المستخدمة لتلوين الخلية. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية محمية من الضوء. أضف 3 مل من برنامج تلفزيوني الخرز وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية. نضح في برنامج تلفزيوني وريسوسبيند الخرز في ~ 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
إعداد أرز خلية سيتوميتريك تدفق لتجهيز العينة: الحصول على تعويض أنابيب وإنشاء مصفوفة التعويض، وتطبيق مصفوفة للحصول على الملفات للعينات التجريبية.
إعداد مزيج الرئيسي من جسم الفلورسنت كوكتيل بالجمع بين وحدة التخزين المناسبة لكل جسم كما هو محدد في الجدول للمواد، في أنبوب العنبر 1.5 مل لجميع العينات تكون الملون. دوامة والطرد المركزي الكوكتيل في س 21,000 ز لمدة 2 دقيقة عند 25 درجة مئوية بيليه الضد، المجاميع.
ملاحظة: يتم سرد الأجسام المضادة المستخدمة هنا في الجدول للمواد.
ذوبان الجليد cryopreserved الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية للحد الأدنى 2 إضافة 0.5 – 2 مل من تعليق خلية لمل 12 من برنامج تلفزيوني في أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية، ونضح برنامج تلفزيوني. ريسوسبيند في 3 مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب البوليستيرين 5 مل. الطرد المركزي كما ذكر أعلاه ونضح برنامج تلفزيوني، تاركاً ~ 20 ميليلتر المتبقية في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: قد تكون تكييف درجة الحرارة المصبوغة لدرجات حرارة أكثر دفئا أو أكثر برودة حسب الحاجة لتطبيقات محددة عن طريق تعديل المعايرة جسم تلطيخ الشروط تبعاً لذلك (راجع الخطوة 1، 2).
ريسوسبيند يصل إلى 2 × 10⁷ يغسل خلايا في 80 ميليلتر من جسم كوكتيل واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية محمية من الضوء. لعينات تتجاوز 2 × 10⁷ الخلايا، وزيادة حجم رد فعل المصبوغة تبعاً لذلك للحفاظ على < 2 × 10⁷ خلايا/100 ميليلتر.
غسل الخلايا بإضافة 3 مل من برنامج تلفزيوني، سينتريفوجينج في 500 x ز لمدة 3 دقائق، ويسفط المادة طافية.
دقة ريسوسبيند الخلايا في 300 – 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني والتصفية حسب بيبيتينج من خلال 35 ميكرون نايلون خلية مصفاة كاب. تبقى الخلايا على الجليد ومحمية من الضوء حتى الفرز.

4-إعداد لوحات جمع خلية وتنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز وكدنا إنشاء

الجمع بين المكونات RT preamp "رد فعل مزيج" (الجدول 3) التي بيبيتينج في أنبوب عقيم واحدة خالية من رناسي/الدناز.
ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة قبل أو أثناء تلطيخ في الخطوة 3. قد أغفل الإنزيم RT هنا لتحديد مساهمة قالب الحمض النووي لإشارة قبكر.
استخدام ماصة متعددة القنوات للاستغناء عن 10 ميليلتر RT preamp "رد فعل" مزيج إلى العدد المطلوب من 96-بئر بكر فرز مجموعة لوحات. ختم اللوحات مع الفيلم لاصقة، ووضع اللوحات على كتل الألومنيوم 96-جيدا مبردة مسبقاً.
إنشاء خلية الفرز على cytometer تدفق مخطط النابضة بالحصول على البيانات من الخلايا تقريبا 20,000 العينة الملون. ضمان تطبيق مصفوفة التعويض للبيانات التي تم جمعها. رسم البوابات وتعريف الشجرة النابضة التي تحدد طوعيين الخلية من المصلحة أن تكون معزولة لتحليل التعبير الجيني.
ملاحظة: يظهر الشجرة النابضة المستخدمة لجمع الخلايا فرنا⁺ سيف المحتملة في الشكل 3.
أدخل إعدادات الأداة المناسبة لتحديد عدد ومجموعة فرعية من الخلايا فرز في كل بئر. تعليمات مفصلة إضافية للفرز أما سلسلة إضعاف الحد خلية أو الخلايا المفردة وترد في الخطوتين 5 و 6، على التوالي.
نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا إلى 96-جيدا استعداد بكر جمع اللوحات. إزالة الختم لاصقة قبل الفرز واستبدل بختم جديدة بعد عملية الفرز.
ملاحظة: الاحتفاظ اللوحات على كتل الألومنيوم مبردة مسبقاً في جميع الأوقات، بما في ذلك أثناء عملية الفرز.
لوحة جمع فورا بعد الفرز ودوامه وأجهزة الطرد المركزي في س 2,000 ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ثيرموسيكلي اللوحة في جهاز PCR مع غطاء مسخن استخدام الشروط التالية: 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (RT)، 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها دورات 18 من 95 درجة مئوية عن 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 4 دقيقة (قبل التضخيم).
تمييع كدنا 1:5 بنقل 5 ميكروليتر من كدنا في 20 ميليلتر من الحمض النووي تعليق العازلة في صفيحة بكر 96-بئر جديدة. كدنا المخفف قد تكون مخزنة في 4 درجات مئوية أو-20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى في هذه المرحلة. كدنا جاهز الآن ليتم استخدامه كقالب ل qPCR (الخطوات 5، 2، 7، 4).
ملاحظة: هذا تمييع يضمن أن الإشعال في رد فعل RT preamp لا تسهم qPCR المتلقين للمعلومات.

5-تباين ج: نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا إلى "سلسلة إضعاف الحد" لتحديد تواتر فرنا⁺ الخلايا أو القيام "مراقبة جودة التجريبية"

ملاحظة: قبل تنفيذ فرز خلية واحدة، قد يكون لاستخدامها لتحديد تواتر الخلايا ذات الاهتمام، بفرز الخلايا إلى تخفيف المسلسل في تكرار. هذه الخطوة أيضا ينص على مراقبة الجودة قيمة الفرز الكفاءة وتحلل الخلية والانتعاش الحمض النووي الريبي وتوليف كدنا، كما هو موضح في الخطوة 5، 3. يسمح تحديد مسبق للتردد خلية فرنا⁺ لتقدير أكثر دقة لعدد الخلايا المفردة التي يجب أن يتم فرز لتحقيق حجم عينة كافية لتحليل تعبير الجينات الخلية فرنا تعمل بشكل مناسب⁺ .

نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا إلى لوحات 96-جيدا على استعداد كما هو الحال في الخطوات 4، 1-4-2، وجمع الخلايا 1 – 1,000 كل بئر في replicates متعددة.
ملاحظة: عدد الآبار نسخ متماثل في كل خلية تمييع يرتبط عادة عكسيا مع تركيز الخلية الواحدة وكذلك. عند الخلية المصابة والتردد أقل من 1%، ينبغي أن تركز تخفيف الخلية على خلايا 100 – 1,000 كل بئر. مخطط لوحة فرز مثال يرد في الشكل 1، أعلى اليسار. تزيد الخلايا 1,000 كل بئر ينبغي تجنبها بسبب الزيادات الناتجة عن ذلك في حجم رد الفعل والتدخل مع توليف كدنا المتلقين للمعلومات والقياس الكمي.
الجمع بين الكواشف qPCR في حل ميكس رئيسية في الجدول 4. حجم رد فعل 25 ميليلتر، يجمع ميليلتر 22.5 من مزيج الرئيسي مع 2.5 ميليلتر من قالب كدنا المخفف من الخطوة 3، 9. أداء qPCR استخدام شروط ركوب القياسية (مثلاً، 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها دورات 40 94 درجة مئوية عن 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة).
ملاحظة: ينصح سينجليبليكس قبكر ردود الفعل باستخدام أداة قبكر في الوقت الحقيقي تقليدية تحليلاً أولياً اقتصادا لفحوصات واحد أو عدد قليل لإثبات كفاءة الخلية الفرز واستعادة الجيش الملكي النيبالي، وتوليف كدنا. يمكن استخدامه أيضا لحساب تواتر الخلايا فرنا⁺ . ردود الفعل qPCR متعدد باستخدام بيومارك تكون عادة أكثر ملاءمة لتحليلات واسعة النطاق لخلية واحدة.
لمراقبة الجودة، والأرض والقيم (Et = −_ماكس الأشعة المقطعية Ct) مقابل عدد من الخلايا يتم فرز كل بئر على نطاق₁₀ سجل وتطبيق إجراء تحليل انحدار خطي.
ملاحظة: replicates متسقة والانحدار الخطي المنحدر من 3.3 (± 0.3) ص²> 0.9 تدل تجربة تتسم بالكفاءة. أمثلة للنوع الأمثل والأمثل، تظهر التجارب RT-preamp في الشكل 4.
لتحديد تواتر الخلايا فرنا⁺ ، ارسم أرقام الخلية فرز كل بئر على المحور السيني (سجل₁₀ مقياس) وجزء صغير من الآبار الإيجابية لفرنا في تمييع كل خلية على المحور ص. للحصول على مثال، راجع الشكل 1 (السفلي الأيسر، توزيع بواسون). تطبيق نموذج انحدار خطي للبيانات لتحديد عدد الخلايا التي تأوي خلية إيجابية واحدة في المتوسط، تناظر 63.2 في المائة من الآبار الإيجابية (0.632 على المحور ص)²¹. تحويل هذا العدد إضعاف الخلية (التقاطع المحور س) إلى التردد معبراً عنه كنسبة مئوية. على سبيل المثال، يكافئ خلية فرنا⁺ واحدة كل الخلايا 48 تردد 2.1 في المائة.

6-تباين باء: نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا لتحليل خلية واحدة

اتبع الخطوات 4، 1-4، 8، وحدد خلية واحدة فرز كل جيدا باستخدام ميزة فرز مؤشر التدفق في سيتوميتير لإنشاء ملفات FCS فردية لكل خلية تم فرزها، تعيين بواسطة الموقف جيدا.
ملاحظة: إذا تجاوز عدد فرز مجموعة لوحات عدد ثيرموسيكليرس المتاحة، ركوب الدراجات يمكن أن يتوقف بعد الخطوة المنظمة المنتسخة العكسية (95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة) وكدنا يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية حتى ثيرموسيكليرس متوفرة. وفي هذه الحالة، يبدأ قبل التضخيم في الدورة الأولى من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية.
اختياري: إنشاء كدنا "تجمعات" تتألف من كدنا من دفعات واحدة من الخلايا المعرفة من قبل المستخدم إلى الشاشة لخلايا نادرة لمصلحة استخدام كدنا غير مخفف المتبقية. نقل 2 ميليلتر من غير مخفف خلية واحدة قبل تضخيم كدنا ماصة متعددة القنوات في لوحة 96-بئر جديدة. كرر قبل بيبيتينج ميليلتر 2 من كدنا من خلايا مفردة إضافية كل من تجمع المعين في نفس جيدا. شاشة مسابح كدنا ل gene(s) للفائدة (مثلاً، فرنا) لتحديد تلك التي تحتوي على الخلايا إيجابية باستخدام قبكر التقليدية. منذ تجميع يتطلب فقط قاسمة صغيرة من كدنا من كل خلية، ميليلتر ~ 8 المتبقية من كدنا لا تزال متاحة لتحليلات خلية واحدة.
ملاحظة: يوصي بتجميع الاستراتيجيات قبل إجراء تحليل التعبير الجيني خلية واحدة في محاولة للحد من عدد الخلايا المفردة التي استجوبته qPCR متعدد كثيفة الاستخدام للموارد. ومن المناسب للحالات التي الخلايا للفائدة (مثلاً، مرناً سيف +) قد يحددها مقايسة qPCR أولية واحدة-من نوع plex. وتشمل الاستراتيجيات الفائق مباشرة إنشاء تجمعات كدنا الجمع بين 2 ميليلتر من كدنا غير مخفف من صفيحة فرز مجموعة الصفوف (أي 12 كافة الخلايا في الصف A) أو أعمدة (أي 8 كافة الخلايا في العمود 1)، في بئر واحدة في لوحة جديدة. لتحديد أفضل تجمع استراتيجية، النظر في تواتر المتوقعة من الخلايا للفائدة من الخطوة 5، 4. على سبيل المثال، إذا كان من المتوقع أن تكون إيجابية 10% خلايا، تجمعات تتألف من ست عينات لكدنا خلية واحدة كثيرا ما سيكون سلبيا ويمكن وبالتالي استبعاد الخلايا تمثل في أن التجمع من المصب خلية واحدة تحليلات.

7-متعدد qPCR على منصة بيومارك

ملاحظة: هذا المقطع قد اتبع الإصدار A أو B الموصوفة أعلاه. في الدراسة المبينة في هذا التقرير، أنه تم تطبيق حصرا لتحليل خلية واحدة.

إعداد لوحة الإنزيم qPCR ميليلتر 4 بيبيتينج لفحص كل من 2 × لوحة المقايسة (إعدادها في الخطوة 2، 2) في لوحة بكر 96-بئر جديدة تحتوي على 4 ميليلتر للمقايسة تحميل الكاشف في كل بئر. الحفاظ على لوحة الفحص في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: لوحة الفحص مستقر عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد، وفي-20 درجة مئوية لمدة شهر واحد. وهكذا، قد يكون من المفيد إعداد مواد كافية لرقائق متعددة وتخزين مناسبة.
الاستغناء عن السوائل خط السيطرة من المحاقن فتيلة في الصمامات اثنين من شرائح. قم بإزالة البلاستيك واقية تحت اللوحة. وضع الرقاقة على وحدة تحكم المؤسسة المالية الدولية مع الجانب مسنن الموضع A1. من القائمة الرئيسية، حدد البرنامج النصي "رئيس الوزراء". قم بتشغيل البرنامج النصي.
إعداد "مزيج التفاعل في الوقت الحقيقي" عن طريق خلط 50 ميكروليتر من عينة تحميل كاشف مع 500 ميليلتر من مزيج PCR الرئيسية (جدول المواد) لكل رقاقة موائع جزيئية. "الماصة؛" ميليلتر 4.4 في كل بئر من صفيحة بكر 96-بئر جديدة، المعين من الآن فصاعدا كلوحة "العينة".
"الماصة؛" ميليلتر 3.6 من كدنا المخفف 1:5 من الخطوة 4، 8 إلى لوحة عينة تحتوي على "مزيج التفاعل في الوقت الحقيقي".
ملاحظة: إذا كان إجراء تشكيلة أسفل PCR الشاشة لنادرة (مثلاً، فرنا⁺) الخلايا لتحليل المتلقين للمعلومات كما ورد في الخطوة 6، 2، تشمل الخلايا ممثلة في مجمعات الإيجابية فقط.
بعد انتهاء فتيلة رقاقة، تحميل مداخل رقاقة بالاستغناء عن ميليلتر 5 من لوحة الفحص في المقابلة أيضا على الجانب مسنن (مقايسة) رقاقة، 5 ميليلتر من لوحة عينة في المقابلة لها في الجانب الآخر (عينة) من شرائح. إدراج شرائح في وحدة تحكم المؤسسة المالية الدولية، وتشغيل البرنامج النصي "تحميل ميكس".
نقل الرقاقة إلى منصة بيومارك أداء qPCR متعدد. المضي قدما في إعداد صك وبرمجة qPCR اتباع التعليمات خطوة بخطوة يقدمها البرنامج "تحليل PCR الوقت الحقيقي" واستخدام بروتوكول التعبير الجيني (جنرال الكتريك) 96.96 V.1 القياسية مع دورات 40 من بكر. احفظ الملف شبرون في مجلد معين.
ملاحظة: يمكن تشغيل رقائق متعددة يوميا وعلى مدى عدة أيام.
تحليل البيانات قبكر.
1. فتح برنامج تحليل PCR الوقت الحقيقي. افتح الملف "ChipRun.bml" من "الملف | القائمة المفتوحة ".
2. تحديد موقع "مستكشف رقاقة" ورقاقة تشغيل الملخص "في الركن الأيمن العلوي من إطار البرنامج. التعرف على المكونات الثلاثة "ملخص تشغيل شريحة": تحليل وجهات النظر وإعداد نموذج للكشف عن الإعداد.
3. انقر فوق "كشف برنامج الإعداد". تحت "المهام"، انقر فوق "جديد"، وحدد نوع الحاوية "SBS لوحة"، وتنسيق حاوية "SBS96". بجوار "التعيين"، انقر فوق... زر، وحدد "M96-التحليل-SBS96.dsp".
  1. اختياري: تعيين كل كاشف (مقايسة) رقم أو اسم في المقطع "اسم" لكل بئر بالنقر المزدوج فوق 1^st جيدا. الانتقال إلى التالي جيدا بالضغط على "F2".
4. انقر فوق "نموذج" في برنامج الإعداد. ضمن "المهام" بجوار "التعيين"، انقر فوق... زر، وحدد "M96-عينة-SBS96.dsp".
5. انقر فوق "تحليل وجهات النظر". ضمن "المهام" في علامة التبويب "قبكر"، حدد "تصحيح خط الأساس للخطى (مشتق)"، و "Ct عتبة الأسلوب المستخدم (كاشفات)". في علامة التبويب "Ct عتبات"، تحقق من "تهيئة مربع السيارات". انقر فوق الزر "تحليل" أعلاه.
6. في الربع الأيمن العلوي من "تحليل وجهات النظر"، انقر فوق علامة التبويب الثانية "جدول النتائج". من القائمة المنسدلة، حدد "عرض خريطة الحرارة". سوف تظهر على خريطة الحرارة مع البيانات.
  1. اختياري: لضمان موحد روكس الأسفار عبر الرقاقة، حدد "عرض الصورة" بدلاً من "عرض خريطة الحرارة" من نفس القائمة. في الفترة الثانية من الإطار الأيمن فوق الخريطة الحرارة، حدد "روكس". في المرحلة الأولى من الإطار الأيمن، حدد واحدة من دورات 1-40. انقر فوق في الرابع من الإطار الأيمن للتبديل إلى عرض fluorescence روكس اللونين الأبيض والأسود. سوف تظهر صورة التي يبلغ يرش، الجسيمات، أو العيوب على الرقاقة. إذا صارخ هو حجب التوحيد روكس، إعادة تشغيل الرقاقة.
7. إطار خريطة الحرارة، انقر فوق "عتبة" و "سجل الرسم البياني". ضبط عتبات Ct يدوياً لكل كاشف بالنقر على فحوصات (أعمدة خريطة الحرارة) وسحب العتبة اللازمة لتتقاطع مع منحنيات التضخيم في المرحلة الأسية. عند القيام بذلك، انقر فوق "تحليل".
تصدير بيانات qPCR كملف.csv. استيراد البيانات إلى جدول بيانات أو برامج التحليل الإحصائي (مثلاً، أحزاب اللقاء المشترك) ورسم خريطة لنتائج العينة وتحليل المواقف على الرقاقة. تنظيم الخلايا في مجموعات استناداً إلى التعبير عن الجينات الفيروسية، عن طريق إنشاء عمود جديد واستخدام صيغة شرطية. تحت "تحليل"، حدد "التي تناسب X Y" والمؤامرة تعبير الجينات مقابل مجموعة. تطبيق التحليل الإحصائي.
ملاحظة: يتم تصوير الممثل التعبير الكمي خلية واحدة من أربعة أنواع من "الحمض النووي الريبي سيف" في مؤامرات المتغيرين في الشكل 5A. ويبين الشكل 5Bالمضيف الكمية التعبير الجيني في خلايا "الحمض النووي الريبي سيف"⁺ .
استخراج قيم التعبير كمية البروتين من بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية في خلية واحدة.
1. .Fcs فتح الملفات من نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز (الخطوة 6.1) المقابلة للوحة 96-جيدا باستخدام فلوجو الإصدار 9. مع اسم الملف وأبرز، حدد "منصة | البوابة رقم الحدث | إنشاء نوع المفهرس غيتس ". سوف تظهر الخلايا الفردية المعروضة حسب الصف.
2. تسليط الضوء على كافة الخلايا 96 (لا الصفوف) وحدد "مساحة العمل | تصدير | حدد فلورس تعويض كل شيء ". تحت "نوع البيانات"، حدد "FCS ملف"، انقر فوق "تصدير"، وحدد مجلد معين.
3. اسحب الملفات.fcs الجديدة لخلايا فردية في مساحة عمل جديدة فلوجو. تسليط الضوء على كافة الخلايا، انقر فوق "إضافة إحصاءات" (الزر "Σ" في الزاوية اليسرى العليا) "| يعني | كافة المعلمات فلور ".
4. فتح "محرر جدول" بواسطة النقر فوق الزر الرابع من اليسار في الزاوية اليسرى العليا. تسليط الضوء على جميع فلوريسنت الخلية الأولى واسحبها إلى نافذة محرر الجدول. في إطار محرر الجدول، انقر فوق الزر نفسه في أعلى "إنشاء وعرض جدول". سيقوم هذا بإنشاء جدول الخلايا 96 ومعلمة رقمية لكل فلور.
5. نسخ الإخراج إلى برنامج قاعدة بيانات (مثلاً، MS Excel، أحزاب اللقاء المشترك)، أما النسخ/اللصق أو بالنقر فوق "حفظ وتشغيل التطبيق" (الرابع من الزر الأيسر أعلى الجدول).
  ملاحظة: هذا الإجراء محددة لإصدار 9 فلوجو. فلوجو الإصدار 10 يستخدم إجراء آخر لاستيراد البيانات المفهرسة. البيانات المفهرسة تدفق يمكن أيضا نسخ/لصق في أحزاب اللقاء المشترك مباشرة من ملفات.csv التي تم إنشاؤها بواسطة فارز الخلية.
دمج خلية واحدة نظام مراقبة الأصول الميدانية والبيانات قبكر برقم اللوحة وكذلك موقف. إجراء التحليلات الإحصائية والرسوم البيانية على الجينات خلية واحدة مجتمعة (qPCR) وبيانات التعبير (نظام مراقبة الأصول الميدانية) البروتين.
ملاحظة: أمثلة من خلية واحدة جنبا إلى جنب قبكر ويتم عرض بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية في الشكل 6 (استضافة ملامح التعبير البروتين السطحية للخلايا المكاك الريسوسي فرنا المصابة بسيف، المقسمة⁺ )، الرقم 7 (التعبير الجينيCD4 مقابل السطح خلايا CD4 البروتين التعبير في الخلايا المكاك الريسوسي فرنا المقسمة⁺ )، ونشرت سابقا²⁰. تحديد الأثران أعرب عن الجينات في الخلية طوعيين للفائدة، وهي خلية واحدة تحليل الأساليب الموصوفة سابقا الموصى بها²⁰^،²²^،^،من²³²⁴، التي تستأثر نسبة الخلايا إيجابية لجينات، فضلا عن قيمة التعبير الجيني المستمر.

النتائج

سير العمل للبروتوكول بأكمله هو مبين في الشكل 1. وهو يتألف من الاختلافات بين تعريف عدد من الخلايا التي تم فرزها: أما تمييع الحد أو كواحدة من الخلايا، كما هو موضح في النص. وترد أمثلة للتحقيق التمهيدي المؤهل التحليلات على إضعاف تخفيف الحمض النووي الريبي المسل...

Discussion

البروتوكول هو موضح هنا، يسمى تسسيبتري، يدمج كوانتيتيشن البروتين وحيد الخلية السطحية بتدفق مولتيباراميتير الخلوي مع خلية واحدة مرناً التعبير الكمي ب qPCR RT كبير متعدد. تمكن الاتحاد من هذه التقنيات اثنين لقطات عالية المحتوى لمجموع النسخي والشخصية البروتين من الخلايا المفردة في شكل الفائق. ?...

Disclosures

وأيد هذا العمل (W81XWH-07-2-0067) اتفاق تعاون بين مؤسسة هنري م. جاكسون للنهوض بالطب العسكري, Inc.، وإدارة الولايات المتحدة للدفاع (DOD). الآراء التي أعرب عنها هي آراء المؤلفين ولا ينبغي أن تفسر بتمثيل مواقف الجيش الأميركي أو وزارة الدفاع. بحوث أجريت في إطار بروتوكول المعتمد استخدام حيوانات في منشأة آآلاسي المعتمدة عملا "قانون رعاية الحيوان" وغيرها من القوانين الاتحادية واللوائح المتعلقة بالحيوانات وتجارب الحيوانات التي تنطوي وتتمسك بالمبادئ وذكر في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، نشر المجلس النرويجي للاجئين، طبعة 2011.

Acknowledgements

المؤلف يود أن يشكر نييد فكتوريا التدفق الخلوي الأساسية والمرافق مهرب التدفق الخلوي الأساسية لصيانة وتشغيل نظام مراقبة الأصول الميدانية أدوات ومعدات الفرز؛ ماريا مونتيرو، هرشيني شارما، أغنية كيمي لخبراء المساعدة التقنية؛ مايكل بيتك، الابن (متوفى) للحصول على المساعدة مع سيف qPCR المقايسة التصميم؛ وكيلي براندون، وماثيو سكارلوتا لسيف عزل تسلسل. الآراء التي أعرب عنها هي آراء المؤلفين ولا ينبغي أن تفسر بتمثيل مواقف الجيش الأميركي أو وزارة الدفاع. بحوث أجريت في إطار بروتوكول المعتمد استخدام حيوانات في منشأة آآلاك المعتمدة عملا "قانون رعاية الحيوان" وغيرها من القوانين الاتحادية واللوائح المتعلقة بالحيوانات وتجارب الحيوانات التي تنطوي وتتمسك بالمبادئ وذكر في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، نشر المجلس النرويجي للاجئين، طبعة 2011.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction and PCR reagents and consumables
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-well PCR Plate	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Glass Distilled Water	Teknova	W3345
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (if separate from kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagents
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000736
Sample Loading Reagent	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagents
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Polystyrene tube with strainer cap	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	dilute 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	dilute 1:40
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	dilute 1:83
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8	Biolegend	302048	dilute 1:167
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7	Biolegend	302340	dilute 1:37
Anti-CD38-R PE clone OKT10	NHP reagent recource	N/A	dilute 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50	BD Biosciences	564364	dilute 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6	BD Biosciences	561358	dilute 1:20
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A	Biolegend	313528	dilute 1:80
Instruments
BioPrptect Containment Enclosure	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences
ProtoFlex Dual 96-well PCR system	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
IFC controller HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD

References

Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).
Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology. 10, 41 (2013).
Mailler, E., et al. The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 8 (9), (2016).
Varmus, H. Retroviruses. Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).
Frankel, A. D., Young, J. A. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).
Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).
Tokarev, A., Guatelli, J. Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence. Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).
Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence. Viruses. 8 (3), 67 (2016).
Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape. Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).
Kirchhoff, F. Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses. Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).
Wigzell, H. Immunopathogenesis of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).
Reynolds, M. R., et al. Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).
Baxter, A. E., et al. Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals. Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).
Grau-Exposito, J., et al. A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients. MBio. 8 (4), (2017).
Eriksson, S., et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies. PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).
Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).
DeMaster, L. K., et al. A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy. J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).
Bolton, D. L., et al. Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells. PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).
Quintans, J., Lefkovits, I. Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system. Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).
Finak, G., et al. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 16, 278 (2015).
McDavid, A., et al. Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).
McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data. Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).
Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time. Trends Microbiol. , (2017).
Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 239, 55-68 (2017).
Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).
Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
Soh, K. T., et al. Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins. Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).
Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).
Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).
Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).
Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).
Genshaft, A. S., et al. targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction. Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).
Mahnke, Y. D., Roederer, M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).
Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).
Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).
Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).
Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 9 (1), 75 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139 macaques

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: