في فيفو يسبر ميكرودياليسيس طريقة لتجميع البروتينات خارج الخلية كبيرة من الدماغ السائل الخلالي مع الوزن الجزيئي عالية وقف إنتاج المواد الانشطارية

Summary

وقد مكن في فيفو ميكرودياليسيس مجموعة من الجزيئات الموجودة في الدماغ السائل الخلالي (قوي الأمن الداخلي) من الحيوانات مستيقظا، ويتصرف بحرية. من أجل تحليل الجزيئات الكبيرة نسبيا في قوي الأمن الداخلي، المادة الحالية يركز تحديداً على البروتوكول ميكرودياليسيس باستخدام المسابر مع ارتفاع الوزن الجزيئي قطع الأغشية.

Abstract

في فيفو ميكرودياليسيس تقنية قوية لتجميع قوي الأمن الداخلي من الحيوانات مستيقظا، ويتصرف بحرية استناداً إلى مبدأ الغسيل الكلوي. أن ميكرودياليسيس أسلوب المنشأة أن التدابير جزيئات صغيرة نسبيا بما في ذلك الأحماض الأمينية أو العصبية، فقد استخدم مؤخرا أيضا تقييم ديناميات الجزيئات الكبيرة في قوي الأمن الداخلي باستخدام المسابر مع ارتفاع الوزن الجزيئي قطع الأغشية. عند استخدام مثل هذه التحقيقات، وقد ميكرودياليسيس ليتم تشغيلها في وضع دفع وجذب لتجنب الضغوط التي تراكمت داخل التحقيقات. توفر هذه المقالة خطوة بخطوة البروتوكولات بما في ذلك الجراحة ستيريوتاكسيك وكيفية إعداد خطوط ميكرودياليسيس لتجميع البروتينات من قوي الأمن الداخلي. أثناء ميكرودياليسيس، يمكن إدارة الأدوية النظامية أو عن طريق التسريب المباشر إلى قوي الأمن الداخلي. وميكرودياليسيس عكس أسلوب لبث المركبات مباشرة إلى قوي الأمن الداخلي. إدراج العقاقير في المخزن المؤقت لنضح ميكرودياليسيس يسمح لهم منتشر في قوي الأمن الداخلي من خلال تحقيقات حين جمع قوي الأمن الداخلي في وقت واحد. ويبين المؤلف بقياس البروتين تاو كمثال، كيف تتغير مستوياته على حفز نشاط الخلايا العصبية بعكس ميكرودياليسيس من بيكروتوكسين. يرد وصف المزايا والقيود المفروضة على ميكرودياليسيس جنبا إلى جنب مع التطبيق الموسع عن طريق الجمع بين أساليب أخرى في فيفو .

Introduction

قوي الأمن الداخلي تضم 15-20% حجم الدماغ الإجمالي ويوفر المكروية حاسمة بالنسبة لتوصيل الإشارة والنقل الركيزة وإزالة النفايات¹. ولذلك، سيوفر قدرة جمع قوي الأمن الداخلي من الحيوانات الحية آثار أكبر بالنسبة لمختلف العمليات البيولوجية، فضلا عن إليه المرض. في فيفو ميكرودياليسيس هي واحدة من الطرق القليلة أن العينة وقياس الجزيئات خارج الخلية من قوي الأمن الداخلي من مستيقظا، تتحرك بحرية الحيوانات ومما يخدم كأداة مفيدة في علم الأعصاب البحوث الميدانية^2،3. في هذا الأسلوب، وإدراجها في الدماغ ميكرودياليسيس تحقيقات مع الأغشية semipermeable و perfused مع المخزن المؤقت التروية بمعدل التدفق البطيء نسبيا (0.1-5 ميليلتر/دقيقة). خلال هذه التروية، جزيئات خارج الخلية في قوي الأمن الداخلي منتشر في التحقيق وفقا للتدرج تركيز سلبية وجمع دياليساتي. على الرغم من أن تركز هذه المقالة على أسلوب الذي عينة قوي الأمن الداخلي في الدماغ، المبدأ والطريقة يمكن تطبيقها على الأجهزة الأخرى بالتعديل المناسبة إذا لزم الأمر.

واستخدمت ميكرودياليسيس أول مرة في أوائل الستينات، ومنذ ثم أنها قد استخدمت على نطاق واسع لجمع جزيئات صغيرة بما في ذلك الأحماض الأمينية أو العصبية في الدماغ. ومع ذلك، وسعت الأخيرة التوافر التجاري لتحقيقات ميكرودياليسيس مع الوزن الجزيئي العالية قطع الأغشية (100 3 كاتشين MDa) تطبيقه على البروتينات أكبر نسبيا في قوي الأمن الداخلي، وكذلك^4،،من^{56 ،7}. الدراسات التي تستخدم هذه المجسات أدى إلى إيجاد تلك البروتينات مثل تاو أو α-سينوكلين الذي كان يعتقد منذ فترة طويلة أن تكون حصرية هيولى موجودة أيضا الناحية الفسيولوجية في قوي الأمن الداخلي^4،،من⁵⁸.

إحدى الصعوبات استخدام المسابير ميكرودياليسيس مع قطع كبيرة من الأغشية (كاتشين 1,000 عادة أكثر) أنهم أكثر عرضه ل ultrafiltration السوائل المفقودة بسبب الضغوط الداخلية المتراكمة في التحقيقات. وقد ميكرودياليسيس المسابر المستخدمة هنا بنية فريدة من نوعها لتجنب هذه المشكلة. سوف لا تكون تراكمت الضغط نتيجة لهذا الهيكل، وبالتالي ينبغي أن يدار ميكرودياليسيس مع هذه التحقيقات في وضع "دفع وجذب" باستخدام مضخة الحقن إلى نتخلل المسابر (= دفع) ومضخة اسطوانة/تحوي جمع dialysate القادمة من منفذ مسبار (= السحب) ⁹ (على الرغم من أنه يحتاج إلى مضخات الدفع والجذب، بسبب ضغط إلغاء تنفيس ثقوب موجودة في التحقيقات، النظام من الناحية الفنية فقط تحركها مضخة سحب). يبدأ بالجراحة ستيريوتاكسيك لغرس القنية دليل هذه المادة وتوضح هذه المقالة كيفية إعداد خطوط ميكرودياليسيس من أجل جمع قوي الأمن الداخلي من خلال تحقيقات ميكرودياليسيس مع كاتشين 1,000 وقف إنتاج الأغشية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

جميع الدراسات الحيوانية تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة "مدرسة الدراسات العليا للطب" في جامعة طوكيو.

1-قبل إجراء العمليات الجراحية

1. قبل البدء بعملية جراحية، يمسح كل شيء مع الإيثانول 70% للحفاظ على ظروف معقمة. ويوصي بدعم الحرارية باستخدام وسادة تدفئة.
2. تخدير الفئران بحقن داخل كلورال هيدرات (400 مغ/كغ). تأكيد أنيسثيتيزيشن بأداء قرصه أخمص القدمين. يوصي باستخدام ميلوكسيكام ريال في الاستقراء والبوبرينورفين بعد شفائهم محاولة لمالا يقل عن 24 ساعة.
3. حلاقة الشعر مع المقص جراحي. إصلاح ماوس الماوس ومحول الفئران حديثي الولادة باستخدام أشرطة الإذن والمشبك آنف.
   ملاحظة: من المهم للتأكد من أن رأس الماوس هو المضمون في هذه المرحلة ولا تتحرك جنبا بجنب.
4. تطبيق مرهم البيطرية في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.

2-ستيريوتاكسيك لعملية جراحية لغرس القنية دليل

1. تعيين الماوس وفار الولدان محول على الجهاز ستيريوتاكسيك. جعل شق ساجيتالي على الجلد أكثر من الجمجمة باستخدام مشرط.　تمحو الدم والنسيج الضام في الجمجمة باستخدام مسحه القطن رطبة.
2. تحديد التنسيق لمنطقة الدماغ لمصلحة استخدام أطلس الدماغ. قبل البدء في القياسات، تأكد من أن خط الوسط مستقيم حتى يمكن مثقاب انتقلت A-P، وتبقى على خياطة خط الوسط طوال الوقت.
   ملاحظة: يستخدم هذه المقالة التنسيق (A/p:-3.10 مم، M/l:-2.50 ملم، د/الخامس:-1.20 مم، 12 درجة) لاستهداف الحصين الخلفي.
3. جمجمة مستوى A-P
   1. إرفاق تدريبات على مناور إطار ستيريوتاكسيك. خفض التدريبات حتى أنها تمس برفق لامدا وسجل تنسيق البطني. كرر هذا الإجراء بريجما.
      ملاحظة: عندما يتم تسويته الجمجمة، قياس الرأسي بريجما مساوية لامدا. إذا لم يكن كذلك، ضبط ارتفاع المشبك الآنف تبعاً لذلك. بعد أن يحصل تعادل الجمجمة، سجل إحداثي بريجما الأمامي/الخلفي، والجانبي.
4. مستوى الجمجمة اليسار واليمين
   1. نقل التدريبات من بريجما إلى التنسيق (A/p:-3.10 مم، M/l: +2.0 ملم) وخفض التدريبات في الجمجمة وتسجيل اﻻحداثي الرأسي. ثم كرر هذا الإجراء للتنسيق (A/p:-3.10 مم، M/l:-2.00 ملم).
      ملاحظة: إذا كان يتم تسوية الجمجمة، تتساوى هذه القياسات الرأسية من نقطتين مسافة واحدة من خط الوسط. إذا لم يكن الأمر كذلك، ضبط ارتفاع أشرطة الإذن.
5. حفر حفرة لدغ بعناية في تنسيق الهدف (A/p:-3.10 مم، M/l:-2.50 ملم) زرع قنية دليل. إذا كان القطر من ثقب لدغ ليست كبيرة بما يكفي غرس قنية دليل، حفر ثقب آخر يتداخل مع أول واحد. حفر ثقب آخر في العظم الجداري حق (الجانب كونترالاتيرال) وإدراج المسمار العظام، مما يساعد على تأمين الأسمنت الأسنان في 1.10 (انظر الشكل 1B).
6. قص قطعة دائرية تأمين من الجانب الخلفي من غطاء أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل بشفرة حلاقة وجعل '' تاج ''. يستخدم هذا التاج لمنع الأسمنت الأسنان من الانتشار للجلد. وضعه في الجمجمة حيث أن الثقوب لدغ في الخطوة 2، 5 البقاء داخل الدائرة (انظر الشكل 1).
7. إعداد عقد جمعية ستيريوتاكسيك بوضع قنية دليل على الذراع أقصر من محول ستيريوتاكسيك وثبتت عليه باستخدام غطاء الجوز. تعيين ذراع أطول من محول ستيريوتاكسيك على المشبك الكهربائي. نعلق على مناور جهاز ستيريوتاكسيك (انظر الشكل 1A).
8. استدارة الجمعية ستيريوتاكس د-V في الذراع مناور 12 درجة (انظر الشكل 1B). نقل قنية دليل للدغ حفرة في 1.6. إدراج قنية دليل ببطء في الدماغ بخفضه من 1.2 مم.
   ملاحظة: زاوية التحقيق محددة إلى الحصين؛ قد تتطلب المناطق الأخرى لا زاوية أو زوايا أخرى على الإطلاق. استشارة أطلس الدماغ لإحداثيات دقيقة. الجاف على سطح الجمجمة، لأنه إذا لم الأسمنت لن تتمسك، ويمكن أن تصبح فكها غطاء الأسمنت
9. إضافة الأسمنت الأسنان داخل التاج تغطية كامل الجزء المعدني قنية دليل والمسمار العظام ما يكفي لتأمينها. تطبيق الأسمنت الأسنان إضافية إذا كان هناك جزء من جمجمة مكشوف.
10. انتظر حتى تماما هو المجففة الأسمنت الأسنان (~ 12-20 دقيقة). قم بإزالة محول ستيريوتاكسيك من المشبك الكهربائي. إزالة غطاء الجوز واستبدال محول ستيريوتاكسيك مع تحقيق زائف وربط الجوز كاب.
11. حرر زر الماوس من جهاز ستيريوتاكسيك وبيت الماوس وحدها في قفص حدة.
    ملاحظة: الماوس لا ينبغي أن تترك غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. تحقق من الماوس يوميا حتى يوم ميكرودياليسيس. ويتلقى الماوس المسكنات مثل والايبوبروفين إذا كان يبدو في الألم. انتظار 2 أسابيع أمر ضروري لدراسات النوم-اليقظة حتى الماوس هابيتواتيس إلى البيئة الجديدة¹⁰، ولكن أنواع أخرى من الدراسات قد تتطلب فترات استرداد أقصر (مثلاً، 1-2 أيام).

3-ميكرودياليسيس الإعداد

1. فحص الجودة من تحقيقات: تعبئة حقنه المتاح 1 مل مع الشربووجدت المقطر توصيله بالمنفذ (بورت أقصر) للتحقيق باستخدام أنبوب بيتون. تغطية ثقوب تنفيس مع الأصابع وكساد المكبس حقنه برفق ضخ المياه للتحقيق. تحقق من أن تظهر المياه من مدخل التحقيق وهناك لا تسرب على سطح غشاء ميكرودياليسيس.
   1. تنشيط تحقيقات: تغرق في الأغشية للتحقيق في الإيثانول (70-100%) لمدة ثانيتين. وبعد ذلك، ضخ الماء المقطر في التحقيق مرة أخرى مع حقنه مرة أخرى.
2. إعداد المخزن المؤقت التروية: لتفادي التصاق الجزيئات المستهدفة للغلايات، إضافة جيش صرب البوسنة بتمييع حل جيش صرب البوسنة 30% إلى 4% مع الخدمات القطرية المصطنعة (1.3 مم كاكل₂، 1.2 مم MgSO₄، 3 مم بوكل، 0.4 مم خ₂ص₄، 25 مم ناكو₃ ، عيار 122 ملم كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة = 7.35)، تطابقاً مع تركيز المنحل بالكهرباء في السائل الدماغي النخاعي، مباشرة قبل استخدامها. قم بتصفية المخزن المؤقت التروية من خلال وحدة تصفية المحاقن مع 0.1 حجم المسام ميكرومتر.
   ملاحظة: 4% جيش صرب البوسنة يحسن الانتعاش للالتصاق البروتينات ولكن يمكن أن تحد بشدة من تسليم المركبات، خاصة بالنسبة للمركبات التي لديها جيش صرب البوسنة-ربط عالية. هذا إحدى ميزات استخدام تركيز أقل من جيش صرب البوسنة (مثل 0.15%) في بعض الحالات³. علما بأن جيش صرب البوسنة يمكن تجميعها بسهولة جداً عند تحريكها بلوحة دوامة أو إثارة. يمكن أن تسد هذه المجاميع المسابير أو مسام الغشاء. يجب توخي الحذر عند إعداد حل جيش صرب البوسنة للحد من هذا التجميع
3. إعداد سطرين منفصلين لمدخل ومخرج (انظر الشكل 1) وتوصيل خطوط على حد سواء مع إبرة اتصال. ملء المتاح 3 مل حقنه مليئة بالمخزن المؤقت التروية وتوصيله مع نهاية مدخل الأنابيب باستخدام إبرة بلانت-نهاية. ملء الأنبوب كامل مع نضح المخزن المؤقت عن طريق تشغيل المضخة المحاقن.
4. إيقاف المضخة المحاقن واستبدالها الإبرة الاتصال بين الخط مدخل ومخرج خط تحقيقا ميكرودياليسيس المنشط من الخطوة 3، 3 (انظر الشكل 1). قبل هذا الاستبدال، وضع الجوز كاب على التحقيق.
5. تركيب أنبوب الاسطوانة في أنابيب المآخذ على المضخة الدوارة. بدء ضخ حقنه في 10 ميليلتر/دقيقة ومن ثم المضخة الدوارة في معدل التدفق أبطأ قليلاً (9.5-9.8 ميليلتر/دقيقة). تأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء في الأنبوب الكامل، الذي يمكن أن يؤثر في الانتعاش عندما يقومون بإدخال المسبار.
6. تخدير الماوس من الخطوة 1، 12 بنفس الطريقة كما في الخطوة 1.2. وضع طوق الماوس حولها في الرقبة. إزالة غطاء الجوز ومسبار وهمية وبطء إدراج تحقيق ميكرودياليسيس من 3.4 من خلال قنية دليل وربط الجوز كاب.
7. مكان الماوس في القفص متصل بنظام الحركة الحرة وحبل الماوس مع ذوي الياقات البيضاء. الحفاظ على تشغيل المضخة المحاقن ومضخة الاسطوانة بمعدل تدفق المشار إليها في الخطوة 3، 5 على الأقل 1 ح.
   ملاحظة: لتحقيق جمع قوي الأمن الداخلي من الحيوانات مستيقظا، تستخدم هذه المقالة نظام الحركة الحرة، حيث القفص نفسه يستجيب لحركة الحيوان للحفاظ على الغلايات من التواء. بدلاً من ذلك، يمكن أيضا استخدام سائل يدور المتاحة من مختلف الشركات.
8. محطة ضخ الاسطوانة أولاً ومن ثم ضخ حقنه. تعيين معدل التدفق المطلوب. تشغيل المحاقن ضخ 20 ٪ أسرع من المضخة الدوارة.
   ملاحظة: على سبيل المثال، إذا قمت بتشغيل في 1 ميليلتر/دقيقة، تعمل المضخة حقنه في 1.2 ينبغي أن تحدد معدل التدفق الأمثل ميليلتر/كحد أدنى لكل جزيء تجريبيا.
9. جمع عينات من قوي الأمن الداخلي: وضع نهاية الأنابيب منفذ مجاناً على جامع الكسر المبردة.
   ملاحظة: يختلف حجم العينة المناسب تبعاً لفحوصات المستخدمة للتحليل.
10. بعد الانتهاء من هذه التجربة، إزالة المسبار. (تخدير الماوس حسب الحاجة.)  التعامل مع الانتعاش الماوس بنفس الطريقة كما في الخطوة 2.11. تحليل قوي الأمن الداخلي التي يتم جمعها من خلال أساليب مثل [هبلك] أو أليسا.
11. غسل الأنابيب كاملة بعد ميكرودياليسيس، الاتصال مدخل ومنفذ الغلايات مرة أخرى بالاستعاضة عن التحقيق مع الاتصال إبرة وتشغيل المبيض المخفف في الأنبوب كامل وثم مسح عليه بالماء. الجاف وتخزينها للاستخدام المتكرر.
    ملاحظة: أنواع أخرى من الغلايات مقبولة، بيد أن جيش صرب البوسنة في المخزن المؤقت التروية يمكن أن تسد الأنابيب مع القطر الصغير، وبالتالي تعتبر هذه الأنابيب تستخدم مرة واحدة. الغلايات يمكن ارتداؤها أو انسداد بعد استخدامات متعددة، لذا تأكد أن معدل التدفق يتسق كل مرة قبل الاستخدام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

أن تحفز أو تثبط نشاط الخلايا العصبية في عكس ميكرودياليسيس^11،،من¹²¹³، بيكروتوكسين، خصم مستقبلات GABA_A أو تيدرودوتاكسين، استخدمت مانع قناة نا⁺ . فقد ثبت أن إطلاق سراح تاو هو حفز زيادة نشاط الخلايا العصبية^...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ميكرودياليسيس مع ارتفاع الوزن الجزيئي قطع الأغشية ليدار بطريقة دفع وجذب، وبالتالي من الأهمية بمكان أن معدل التدفق دقيقة وثابتة. عدم دقة في معدلات التدفق يمكن أن تكون قضية توليد فقاعة هواء وعدم تناسق في تركيز العينة. إذا كان التدفق غير متناسقة، تحقق من كافة الاتصالات للتسرب. إذا استمرت الم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
The Univentor 820 Microsampler	Univentor	8303002	Refrigerated fraction collector
Syringe pump	KD scientific	KDS-101
Roller pump	Eicom microdialysis	ERP-10
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1409	Free-moving system
Dual species cage kit	BASi	CX-1600
AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm)	Eicom microdialysis	PEP-8-02	Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical.
Microdialysis guide (shaft length 8 mm)	Eicom microdialysis	PEG-8
Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm)	Eicom microdialysis	PED-8
Bone screw	BASi	MD-1310
Super bond C&B set	Sunmedical		Dental cement
Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console	Kopf	Model 940	Stereotaxic apparatus
Mouse and neonatal rat adaptor	Stoelting	51625
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic	Stoelting	51648
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A7284-50ML	30% BSA solution
FEP tubing (70 cm)	Eicom microdialysis	JF-10-70	Internal volume = 0.5 µL/cm
Teflon tubing (50 cm)	Eicom microdialysis	JT-10-50	Internal volume = 0.08 µL/cm
Byton tube	Eicom microdialysis	JB-30
Intramedic luer stab adaptor 23G	BD	427565	Blunt end needle
Roller tube	Eicom microdialysis	RT-5S	Internal volume = 4 µL
Cap nut	Eicom microdialysis	AC-5
0.25 mL microcentrifuge tube with cap	QSP	503-Q	Tubes for fraction collector
Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm)	Eicom microdialysis	PESG-8
Connection needle	Eicom microdialysis	RTJ
Mouse animal collar	BASi	MD-1365
High Speed Rotary Micromotor kit	FOREDOM	K.1070	Drill
Picrotoxin	Sigma	P1675
Screw driver for bone screws
Scalpel
Cotton swab
Surgical clipper