كثرة أخذ عينات الدم الذيل-نصيحة في الفئران للتقييم لإفراز الهرمون نابض

Summary

نقدم هنا بروتوكول أخذ عينات دم الذيل-نصيحة لجمع العينات متكررة في الفئران غير المقيد. هذا الأسلوب مفيداً لتقييم أنماط من إفراز الهرمون نابض ويمكن تكييفه لتحليل للعوامل الأخرى المتداولة.

Abstract

في العديد من أجهزة الغدد الصماء، تعميم العوامل أو الهرمونات لا يتم إصدارها بشكل مستمر، ولكن يتم ويفرز كنبض منفصلة في استجابة لعامل الإفراج. إجراءات أخذ العينات نقطة واحدة لا تكفي لنفهم تماما أهمية نمط الافرازية نابض الهرمونات أما في الظروف الفسيولوجية العادية أو أثناء ظروف التقلبات البيولوجية. الهرمون (LH) هو توليفها من قبل الخلايا جونادوتروبي الغدة النخامية الأمامية ويفرز في نمط نابض مما يتطلب كثرة جمع عينات الدم لتقييم النبض. هذا لم يكن ممكناً في الفئران حتى الآونة الأخيرة، نتيجة لتطور مقايسة LH حساسية عالية ووتيرة النهوض في تقنية لجمع عينة صغيرة الحجم، وفي البداية وصف ستاين والزملاء. ¹ هنا يمكننا وصف بروتوكول لجمع عينة الدم المحيطي متكررة من الفئران مع تأقلم معالجة كافية للكشف عن إفراز LH نابض. تفاصيل البروتوكول الحالي فترة تأقلم موسعة التي تتيح تقييم لنبضات قوية ومستمرة من ناحية اليسار على مدى ساعات عدة. في هذا البروتوكول، ويتم قص غيض الذيل ويتم جمع الدم من الذيل باستخدام ماصة اليد. لتقييم LH نابض في الفئران جوناديكتوميزيد، المسلسل عينات جمعت كل دقيقة 5-6 ل 90-180 دقيقة الأهم من ذلك، يمكن أن يتم جمع الدم وقياس نبضات قوية من ناحية اليسار في الفئران مستيقظا، ويتصرف بحرية، نظراً لمعالجة كافية التأقلم والجهود المبذولة للحد من الإجهاد البيئي. تأقلم كافية يمكن أن يتحقق في غضون 4-5 أسابيع قبل جمع الدم. ويبرز هذا البروتوكول السلف في منهجية لضمان جمع عينات الدم كله لتقييم الأنماط إفراز LH نابض على مدى ساعات عدة في الماوس، نموذج حيوان قوية لأبحاث الغدد الصم العصبية.

Introduction

وظيفة الغدد التناسلية في الثدييات متوقفاً على إفراز تروج والهرمون (LH) والهرمون من الغدة النخامية جريب. هي يفرز gonadotropins أما نمط نابض أو الطفرة في الاستجابة لإفراز طائي تروج – الإفراج عن هرمون (GnRH). التوليف وإفراز LH و FSH وينظم عن طريق عمل الغدد الصماء، وباراكريني، وأوتوكريني من مجموعة متنوعة من الجزيئات بما فيها جنره طائي، وهرمونات الستيرويد جوندال، والنظام أضافت-إينهيبين-فوليستاتين، فضلا عن عدد وافر من الظروف الفسيولوجية بما في ذلك توازن الطاقة والإجهاد. ²

نمط نابض LH في الدم ينشأ من إبراء ذمة مفاجئ نوعا من LH في الدم المحيطي، تليها نحو أسي القضاء. هامة تتضمن الميزات نمط تكرار كل تفريغ LH والسعة للاستجابة LH، سواء منها التي تمليها، جزئيا، الإفراج عن جنره. الواجب إلى الصعوبة في جمع الدم طائي النخامية المدخل لقياس جنره نابض، أخذ العينات وقياس LH كوكيل للائحة جنره المحور طائي جوندال الغدة النخامية. ولذلك، يتم ترميز المعلومات الحاسمة في التردد والسعة من البقول LH، الذي لا يمكن تحديده من عينة واحدة.

تحليل لإفراز LH نابض تاريخيا محدودة للثدييات الكبيرة (البشر والقرود والأغنام) نظراً لحجم كبير من الدم والتسامح لجمع عينة الدم المتكرر. في القوارض، أخذ عينات من الدم المتكرر تقتصر على الفئران ويتحقق عن طريق سكني القسطرة أذينية. ^{3 , 4} بتكلفة منخفضة نسبيا وتوافر الوراثية (مثل لجنة المساواة العرقية-لوكس، كريسبر) والتلاعب الدارة العصبية المعقدة (مثل أوبتوجينيتيكس، تشيموجينيتيكس) جعل الفئران كائن نموذج جذاب؛ ومع ذلك، تحقيق عينات الدم المتكررة والتحليل اللاحق لتركيزات LH حتى مؤخرا، أثبت بعيد المنال. كان رائدا في هذه المهمة الضخمة ستاين وزملاء العمل. وقد بدأت ¹ منذ ذلك الحين، عدد من معامل الاستفادة من أخذ عينات من الدم المتكررة وفحوصات LH فائقة الحساسية لتقييم إفراز LH نابض في مجموعة متنوعة من النماذج التجريبية. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} تجدر بالسعي إلى طريقة عملية لجمع عينات الدم متعددة من الفئران في التقدم لمالا يقل عن 40 سنة¹⁰ مع التحسينات المتعددة المقدمة على طول الطريق. ^{11 , 12}

يمثل تقييم أنماط نبض LH (أي من التردد والسعة) صقل كبرى في رصد إفراز تروج القاعدية في هذا النموذج الحيواني يستهدف وراثيا. تقليديا، تم تحديد تركيزات LH في الفئران في عينة دم واحدة. إحدى نقاط الضعف لعينات نقطة واحدة مجموعة البيانات اختلافاً كبيرا نظراً لأن تركيزات LH بطبيعة الحال متقلبة خلال كل نبضة. ضعف آخر وأن القياسات المعزولة أصلاً افتقد المعلومات الحاسمة التي تنقلها إلى أنماط إفراز LH نبض. وهكذا، طريقة لجمع عينات الدم المتكرر في التصرف بحرية، الفئران غير المقيد (باستثناء معالجة لطيف أثناء أخذ العينات) ستوفر معلومات معززة وتكون مفيدة للعديد من مختبرات التحقيق في تنظيم هرمون نابض.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لجمع متكررة (كل دقيقة 6) الدم عينات من الفئران مستيقظا، غير المقيد. الأهم من ذلك، أننا تشتمل التعامل مع تأقلم البروتوكول الذي يسمح بالكشف عن القوى والمستمر لإفراز LH نابض في عينات الدم كله جمعت على مدى يمكن تحديد طول الوقت الذي ما قبل وما بعد التقييم التحدي حاد، مثل الاستجابة للإجهاد النفسي والاجتماعي لتجميد وضبط النفس. وقد وصفت مقايسة فعال لتركيزات LH من عينات الدم كله سابقا؛ ¹ هذا البروتوكول وتركز على أسلوب لجمع عينات الدم لقياس نبض LH.

Protocol

الأسلوب الموصوفة هنا هو الاتفاق مع الوطني معاهد للرعاية الصحية والحيوانية واستخدام المبادئ التوجيهية، وقد إذن بها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في جامعة كاليفورنيا، سان دييغو.

1-التأقلم للمناولة

1. التعامل مع الإجراء
   1. ضع أقفاص الماوس في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. إزالة الماوس أول من القفص والمكان على سطح مناسبة (مثل غطاء قفص نظيفة) داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
   2. كبح جماح بلطف الماوس على سطح العمل بعقد قاعدة الذيل مع السبابة والإبهام من جهة. ثم السكتة الدماغية بقوة على السطح البطني من الذيل، من القاعدة إلى طرف الذيل، بالسبابة والإبهام من جهة أخرى. كرر هذا الجرة 6 مرات (أي 1 من مجموعة) والعودة الماوس إلى قفصة.
   3. انتظر 6 دقيقة وكرر الخطوة 1.1.2.
      ملاحظة: في المجموع، خطوة 1.1.2 سوف تتكرر 4 مرات للماوس (أي 4 مجموعات من السكتات الدماغية 6)، حيث أن كل الماوس سوف تتلقى ما مجموعة 24 ذيل ضربات في كل يوم للتعامل.
2. تواتر المناولة اليومية
   1. من خمس سنوات حتى أسبوعين قبل اليوم جمع الدم المخططة، التعامل مع الفئران كما هو موضح في الخطوة 1، 1، خمسة أيام في الأسبوع (لا تتم معالجة الفئران يوم السبت أو الأحد حتى الأسبوعين الأخيرين من التأقلم).
   2. إذا كان العلاج التجريبي خلال فترة أخذ العينات سوف تشمل أي معالجة إضافية (مثل سكروفينج أو الحقن داخل)، التأقلم الفئران لهذا النشاط المناولة خلال كل دورة معالجة.
      ملاحظة: للتأقلم لإجراءات الحقن، استخدام إبرة يتثلم القيام حقن شام.
   3. خلال الأسبوعين الماضيين قبل اليوم جمع الدم المخططة، التعامل مع الفئران كما هو موضح في 1.1، سبعة أيام في الأسبوع.
   4. منزل على الأقل أسبوعين قبل يوم جمع الدم المخططة، الفئران في أزواج لتقليل الاختلالات في الفئران أثناء أخذ العينات.

2-إعداد أنابيب جمع الدم

1. إعداد المخزن المؤقت لفحص LH أولتراسينسيتيفي في زجاجة زجاج: ألبومين المصل البقري 0.2% و 0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني [ز 0.2 بوكل، ز 8 كلوريد الصوديوم، ز 1.44 غ₂هبو₄ (لا مائي)، 0.24 ز خ₂ص₄، الماء عالي النقاوة إلى 1 لتر وتصفية ودرجة الحموضة 7.4 اﻷوتوكﻻف] ، تخزين في 4 درجات مئوية. ¹
   ملاحظة: حجم LH أولتراسينسيتيفي الإنزيم المخزن المؤقت إعداد يمكن حساب استناداً إلى عدد العينات وحجم كل عينة كما هو مبين أدناه (2.2 والمناقشه)
2. إعداد أنابيب جمع الدم (0.6 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب). تسمية أنابيب والمقايسة الكوة المخزن المؤقت (57 ميليلتر من المخزن المؤقت كل أنبوب؛ الملاحظة، وحدة التخزين هذه قد تختلف تبعاً لحجم الدم التي يتم جمعها أو نسبة الدم إلى المخزن المؤقت المطلوب). أنابيب يمكن أن يكون مستعدا أيام قبل أخذ العينات، وتخزين في 4 درجات مئوية.

3. جمع الدم

1. إعداد مواد جمع الدم.
   1. يعد مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لاستخدامها، وترتيب المواد التالية في غطاء محرك السيارة أو عربة القريبة: 10 ميليلتر "الماصة؛" نصائح ماصة (مجموعة 3 ميليلتر أو حجم جمع الدم المطلوب)، والنفايات بن لنصائح الماصة المستخدمة، الموقت، والنسخة المطبوعة مع إعداد الحيوانات وعينه (أرقام ملاحظات بشأن قضايا أخذ العينات أو الحيوان)، الثلجية دلو مع أنابيب جمع الدم ومقص وشاش صغير (2 "x 2").
      ملاحظة: "العد" الدالة على جهاز ضبط وقت مختبر مفيد لأنه لم يكن لديه إنذار مسموعة يمكن أن تخل بالفئران
   2. استخدام علامة دائمة للاحتفال بذيل الماوس كل (بالقرب من القاعدة) للمساعدة في التعرف السريع على الماوس الصحيح أثناء أخذ العينات.
2. لقطة لإعداد مجموعة الذيل والدم قبل.
   1. في 45 دقيقة قبل بدء جمع الدم، إزالة الماوس أول من قفصة ووضعه على سطح مناسبة (غطاء قفص نظيف يعمل بشكل جيد) إطار السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
   2. استخدام مقص حاد، والعقيمة لإزالة 1-2 مم طرف ذيل الماوس، بعد إعداد العقيم (أي فرك الكحول وتدين).
      ملاحظة: هذا يمكن أن يتحقق في الحيوانات مستيقظا مع ضبط النفس لطيف أو تحت التخدير إيسوفلوراني.  بالإضافة إلى ذلك، قد يتم توفير التسكين بناء على توصية إياكوك المحلية.
   3. السكتة الدماغية ذيل الماوس بعناية كما هو موضح أعلاه (1-1-2؛ 1-2 السكتات الدماغية كافية عموما) حتى الحبرية أشكال الدم على طرف الذيل.
   4. استخدام ماصة مع تلميح نظيفة لجمع 3 ميليلتر من الدم من طرف الذيل وتجاهل نصيحة ماصة بالدم.
   5. قبل أن تعود الماوس إلى قفصة، ضمان أن توقف تدفق الدم. إذا لزم الأمر، تطبيق ضغط لطيف مع شاش معقم.
   6. كرر الخطوات 3.2.1-3.2.5 لجميع الفئران. ويمكن جمع عينات الدم اللاحقة بشدة الجرة ذيل الماوس حتى قطره دم أشكال في الطرف الذيل.
      ملاحظة: إذا كان لا تشكل معالجة تجميعية دم بعد ضربات ثابتة، يمكن مست الذيل مع وسادة شاش غارقة في المياه المالحة. الجلطات أكثر احتمالاً للنموذج أثناء أخذ العينات أقل تواترا (أي > فواصل زمنية 15 دقيقة). مرة واحدة يتم مسح الجلطة من هذا السياق، يمكن مواصلة أخذ العينات.
   7. مواصلة جمع 3 ميليلتر من الدم من كل الماوس كما هو موضح أعلاه كل دقيقة 6 لحوالي 45 دقيقة خلال هذه الفترة إعداد جمع الدم قبل. تجاهل نصيحة الدم وماصة.
3. أخذ عينات من الدم
   1. جمع 3 ميليلتر من الدم من طرف الذيل كما هو موضح أعلاه. أخذ الحيطة والحذر لضمان أخذ العينة 3 ميليلتر الكامل في تلميح ماصة (بدون فقاعات أو تلوث الفراش). إخراج عينة الدم في المخزن المؤقت للفحص في أنبوب مسمى. مزيج من انعكاس والعودة على أنبوب للجليد.
   2. قبل أن تعود الماوس إلى قفصة، ضمان أن توقف تدفق الدم. إذا لزم الأمر، تطبيق ضغط لطيف مع شاش معقم.
   3. كرر الخطوات 3.3.1-3.3.2 لكل الماوس، كل دقيقة 6، خلال مدة محددة سلفا في أخذ العينات. رصد كل الحيوانات لإشارات الاستغاثة (الجفون مغلقة جزئيا مثل، موقف متحدب [لم يسببها العلاج الأخرى] أو عدم الاستجابة للمعالجة) وإنهاء أخذ العينات، إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: استغاثة السلوكية أو المضاعفات الأخرى التي تتطلب إنهاء لأخذ العينات جداً نادراً ما تحدث في المختبر.
   4. إذا هي euthanized الحيوانات لا بعد أخذ عينات من الدم، التأكد من أن تدفق الدم من الذيل-نصيحة قد توقفت تماما. مسح أي الدم المسكوب من داخل قفص كل الحيوانات (أو أقفاص التغيير) والعودة في أقفاص الحيوانات إلى رف الإسكان.

4-عينة من معالجة وتحليل

1. تخزين عينات الدم في-20 درجة مئوية حتى التحليل.
   ملاحظة: LH هو جزيئي في عينات الدم كله تضعف في المخزن المؤقت للمقايسة؛ لا يوجد فصل من الأمصال أو البلازما مطلوب قبل التخزين أو التحليل.
2. فحص عينات الدم قبل أليسا أولتراسينسيتيفي كالموصوفة سابقا القيم¹ والتقرير في نانوغرام/مليلتر دم كله بعد تصحيح لتخفيف حجم العينة في المخزن المؤقت للمقايسة.
3. تحديد نبضات LH في مجموعة البيانات. حساب ومقارنة نبض يعني السعة وتواتر النبض (أو الفاصل الزمني لنبض بين الوكالات) حسب الاقتضاء لمجموعة البيانات.
   ملاحظة: برامج ومعايير نشر^13،14 ، تتوفر^15،16 للكشف عن نبضات LH.

النتائج

أنماط نبض LH الممثل من الفئران 4 مبينة في الشكل 1 (بيانات طبعها من يانغ et al.، 2017). وتم قياس LH في عينات الدم المتكرر لتحديد الاستجابة لتحدي إجهاد النفسي حاد. أوفاريكتوميزيد فئران C57/Bl6 الإناث الكبار والتعامل معها كما هو مفصل في هذا البروتوكول لجمع الدم المت...

Discussion

هنا يصف لنا وضع بروتوكول لجمع الدم المتكرر لعينات الدم كل طرف الذيل للتقييم لإفراز LH نابض في الفئران. هذا البروتوكول يتيح جمع العينات للكشف عن التغيرات الحادة في إفراز LH نابض عقب التعرض للإجهاد النفسي ومناسبة تماما لتقييم البقول LH تحت الأخرى التلاعب الحاد أو المزمن.

من عناص...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosaftey cabinet	Lab Products Inc	L/F-B
Bovine serum albumin	Sigma	A5403
Tween-20	Sigma	P2287
KCl	Sigma	P9333
NaCl	Sigma	S7653
Na2HPO4 (anhydrous)	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P5655
Ultrapure water	Millipore		Purified and filtered water
Broome Rodent Restraint Device	Harvard Apparatus	52-0460	Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.
DynPeak	n/a	n/a	http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001